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문제 정의
- 曲 한편 방선균에 속하는 여러 균주들이 xylanase, cellulase 및 각종 가수분해 효소를 생산하는 것으로 일려져 있으나, phytase의 생산성 균주는 보고된 바가 없다. 따라서 본 연구에서는 국내 토양으로부터 phytate 분해력이 우수한 방선균을 분리하고 분리균이 생산하는 phytase 반응 특성을 조사하였다.
제안 방법
- YB-26을 GS.M 배지를 사용하여 28。(2에서 8일간 진탕배양하면서 배양 상등액의 효소 활성을 조사하였다. 그 결과 Fig.
- 위해 30〜60。(2의 범위에서 30분과 60분간 각각 열 처리후 37℃ 잔존활성을 조사하였다. 그 결과 40℃ 이하에서는 거의 실활되지않았으나, 50。(2에서는 급격히 실활되어 비교적 열안정성이 낮은 것으로 확인되었다.
- 형태가 서로 다른 것으로 판단되는 약 1, 200개의 방선균 콜로니를 GS.M 복합 액체배지에 접종하여 28。(:에서 5일간 진탕 배양하여 얻은 배양 상등액을 사용하여 phytate의 분해활성을 조사하였다. 그 결과 몇 주의 분리균주가 phytasef- 생산하는 것으로 확인되었으며, 이들 중 효소 생산성이 높은 균주 YB-26을 선발하였다.
- 분리 균의 16S rRNA 염기서열을 조사한 결과 S华pfcw糜as속에 속하는 균주의 서열과 상동성이 높았다. GS.M 배지에서 분리 균을 배양하여 얻은 배양 상등액을 ammonium sulfete 분획(15- 70%), DEAE-Sepharose column 및 Q-Sepharose column 크로마토그래피를 하여 phytase를 부분 정제하였다. 부분정제된 phytase를 사용하여 효소반응을 실시한 결과 60。(2와 pH 7.
- Phytase 활성을 보이는 분획을 모아 한외초여과 과정을 수행하여 농축한 효소액을 20 mM Tris . HC1 buffer(pH 8.0)에서 투석한 후 동일한 완충용액으로 평형화 시킨 Q-Sepharose column을 사용하여 DEAE-Sepharose column 크로마토그래피와 동일한 조건으로 정제과정을 수행하였다. 용출된 분획 중 phytase의 활성이 높은 분획을 부분정제 효소로 사용하였다.
- Humic acid vitamin 평판배지를 사용하여 토양으로부터 방선균을 분리하였다.⑶ 분리된 방선균 중 phytase 생산균을 탐색하기 위해서는 GS.
- 최종적으로 Q-Sepharose column에서 용출된 분획 중 가장 효소활성이 높은 분획을 SDS-PAGE로 조사한 결과 완전히 정제되지 않은 것으로 나타났다. 따라서 이를 phytase의 부분정제 효소액으로 사용하여 반응온도와 pH가 phytase 활성에 미치는 영향을 조사하기 위하여 30〜7CFC까지의 온도에서 각각 효소 활성을 측정하였으며, 활성에 미치는 pH의 영향을 알아보기 위해서는 pH 5.5에서 pH 10.0까지의 범위에서 효소 활성을 각각 측정하였다. 그 결과 Fig.
- 5 m/이 되도록 하여 적정온도에서 30분간 방치하였다. 반응액에 color-stop 용액 (Nitric acid solution : Molybdate stock solution : Vanadate stock solution = 2 :1 :1)^- 0.5 ml 첨가하고 15분 후에 415nm에서 흡광도를 측정하고 이를 KHzPQ*를 표준시료로 사용하여 동일 조건하에서 발색시켜 조사한 흡광도와 비교함으로써 유리된 무기인의 양을 결정하였다. 효소 활성도 1.
- 분리균을 GS.M 배지에 접종하여 281 에서 6일 동안 진탕 배양한 후 원심분리하여 얻은 배양 상등액을 15~70% ammonium sulfkte로 처리하였다. 침전된 단백질을 20 mM Tris .
- 분리균의 16S rRNA 유전자 단편은 Lee 등이 실시한 방법과 동일하게 세균의 16S rRNA 유전자의 보존적 지역의 염기서열을 primer로 사용하여 PCR로 증폭하고 그 염기서열을 결정하였다. 주형 DNS 사용할 Streptomyces sp.
- 분리균이 생산하는 효소의 반응특성을 조사하기 위해 GS.M 배지에서 6일간 배양하여 얻은 배양 상등액을 ammonium sulfate(l 5%~70%), DEAE-Sepharose column 크로마토그래피, 한외여과(PM 10)와 Q-Sepharose column 크로마토그래피를 수행하였다. 최종적으로 Q-Sepharose column에서 용출된 분획 중 가장 효소활성이 높은 분획을 SDS-PAGE로 조사한 결과 완전히 정제되지 않은 것으로 나타났다.
- 선발된 YB-26의 동정을 위해 16S rRNA의 염기서열을 조사하였다. PCR로 증폭된 DNA 단편으로 직접 결정된 염기서열 (GenBank accession No.
- 0)에 녹이고 동일 buHbi에 투석하였다. 투석한 단백질 용액을 20 mM Tris-HCl bufifer(pH 8.0) 로 평형시킨 DEAE-Sepharose column에 loading하고 NaCl 농도를 0〜0.4 M이 되도록 농도구배를 주어 증가시키면서 흡착된 단백질을 용출하였다. Phytase 활성을 보이는 분획을 모아 한외초여과 과정을 수행하여 농축한 효소액을 20 mM Tris .
- 0으로 맞추어 기질 용액으로 사용하였다. 효소 반응을 위해서는 2 mM sodium phytate, 2mM CaCl2, 50 mM 완충용액을 포함한 혼합물에 효소액을 첨가하여 최종 0.5 m/이 되도록 하여 적정온도에서 30분간 방치하였다. 반응액에 color-stop 용액 (Nitric acid solution : Molybdate stock solution : Vanadate stock solution = 2 :1 :1)^- 0.
대상 데이터
- 2))를 방선균 배양에 사용하였다. Sodium phytate, calcium chloride, ammonium heptamolybdate, ammonium metavanadate, potassium phosphate 등의 분석시약은 Sigma 제품을 사용하였으며, nitric acid는 Merck로부터 구입하였다. 중합효소 연쇄반응(PCR)을 위한 Tag DNA polymerase와 DNA 정제 kit는 솔젠트 사로부터 구입하였다.
- 0)에서 투석한 후 동일한 완충용액으로 평형화 시킨 Q-Sepharose column을 사용하여 DEAE-Sepharose column 크로마토그래피와 동일한 조건으로 정제과정을 수행하였다. 용출된 분획 중 phytase의 활성이 높은 분획을 부분정제 효소로 사용하였다.
- Sodium phytate, calcium chloride, ammonium heptamolybdate, ammonium metavanadate, potassium phosphate 등의 분석시약은 Sigma 제품을 사용하였으며, nitric acid는 Merck로부터 구입하였다. 중합효소 연쇄반응(PCR)을 위한 Tag DNA polymerase와 DNA 정제 kit는 솔젠트 사로부터 구입하였다.
데이터처리
- 분리균의 정확한 계통학적 분석을 위해서 CLUSTAL W software를 사용하여 상동성이 높은 균주들의 16S rRNA 염기서열과 비교하고, 5', 3, 의 gap을 제거하거나 적절히 수정한 후, 분자계통학적 계통수의 작성은 PHYLIP 프로그램 패키지를 사용하여 수행하였다.") 분자진화거리 는 DNAD1ST 프로그램 속의 Jukes & Cantor의 알고리즘을 이용하여 계산하였고 최종적 인계 통수는 NEIGHBOR 프로그램 속의 neighbor-joining method 에") 기초해서 작성하였다. 그 결과 Fig.
- DQ207806)은 미국 NCBI의 BLAST 검색방법을 사용하여 기존에 등록된 다양한 세균들의 상응하는 염기서열과 비교한 결과 Streptomyces속 균주와 유사도가 높았다. 분리균의 정확한 계통학적 분석을 위해서 CLUSTAL W software를 사용하여 상동성이 높은 균주들의 16S rRNA 염기서열과 비교하고, 5', 3, 의 gap을 제거하거나 적절히 수정한 후, 분자계통학적 계통수의 작성은 PHYLIP 프로그램 패키지를 사용하여 수행하였다.") 분자진화거리 는 DNAD1ST 프로그램 속의 Jukes & Cantor의 알고리즘을 이용하여 계산하였고 최종적 인계 통수는 NEIGHBOR 프로그램 속의 neighbor-joining method 에") 기초해서 작성하였다.
이론/모형
- Phytase 활성은 dodecasodium phytate를기질로 하여 효소 반응 후에 유리된 무기인을 발색법으로 정량함으로써 즉정하였다.M)증류수에 lOmM sodium phytate와 10mM CaC.
성능/효과
- M 배지에서 분리 균을 배양하여 얻은 배양 상등액을 ammonium sulfete 분획(15- 70%), DEAE-Sepharose column 및 Q-Sepharose column 크로마토그래피를 하여 phytase를 부분 정제하였다. 부분정제된 phytase를 사용하여 효소반응을 실시한 결과 60。(2와 pH 7.0에서 최대활성을 보였으며, pH 6.0-8.0 범위에서 최대활성의 90% 이상이 되는 활성을 나타냈다. 이 효소는 열안정성이 높지 않으며, CaCL의 존재하에서도 열안정성이 변화가 없는 것으로 확인되 었다.
- PCR로 증폭된 DNA 단편으로 직접 결정된 염기서열 (GenBank accession No. DQ207806)은 미국 NCBI의 BLAST 검색방법을 사용하여 기존에 등록된 다양한 세균들의 상응하는 염기서열과 비교한 결과 Streptomyces속 균주와 유사도가 높았다. 분리균의 정확한 계통학적 분석을 위해서 CLUSTAL W software를 사용하여 상동성이 높은 균주들의 16S rRNA 염기서열과 비교하고, 5', 3, 의 gap을 제거하거나 적절히 수정한 후, 분자계통학적 계통수의 작성은 PHYLIP 프로그램 패키지를 사용하여 수행하였다.
- YB-26이 생산하는 phytase는 열안정성이 낮아 pellet 사료 제조용 효소로는 적합하지 않은 것으로 여겨진다. Streptomyces 속 균주에서 phytase에 대한 보고가 없었지만, 본 연구를 통해 phytase가 방선균에서도 생산된다는 사실이 확인되었으므로 방선균도 phytase의 생산균으로 탐색가치가 있다고 판단된다.
- 0 부근과 중성부근에서 최대활성을 보이는 것으로 알려져 있다.顺 따라서 분리균의 효소를 다른 균주의 효소와 비교하였을 때 B. subtilis와$ B. amyloliquefaciensS\20) 효소와 유사한 최적 반응 pH를 갖는 것을 알 수 있었다. 반응온도의 경우는 대부분의 미생물 유래 효소가 55〜60℃에서 최대반응 활성을 보이고 있어 분리 균의 효소도 이와 유사한 수준으로 여겨진다.
- M 배지를 사용하여 28。(2에서 8일간 진탕배양하면서 배양 상등액의 효소 활성을 조사하였다. 그 결과 Fig. 2에 보인바와 같이 배양 후 2일까지는 배양상등액에서 phytase 활성이 관찰되지 않았고, 3일부터 활성이 관찰되었다. 배양후 6일이 되었을 때 효소 생산이 900 mU/mZS.
- 0까지의 범위에서 효소 활성을 각각 측정하였다. 그 결과 Fig. 3에서 보인바와 같이 pH 7.0과 6VC에서 최대활성을 보였고, pH 6.0-8.0 부근에서 최대 활성의 90% 이상에 해당하는 활성을 나타냈다. 한편 Aspergillus속 균주의 효소는 pH 4.
- M 복합 액체배지에 접종하여 28。(:에서 5일간 진탕 배양하여 얻은 배양 상등액을 사용하여 phytate의 분해활성을 조사하였다. 그 결과 몇 주의 분리균주가 phytasef- 생산하는 것으로 확인되었으며, 이들 중 효소 생산성이 높은 균주 YB-26을 선발하였다.
- 분리 균의 16S rRNA 염기서열을 조사한 결과 S华pfcw糜as속에 속하는 균주의 서열과 상동성이 높았다. GS.
- 배양후 6일이 되었을 때 효소 생산이 900 mU/mZS. 최대에 도달하였으며, 7일 이후에는 약간씩 감소하는 것으로 나타났다.
- M 배지에서 6일간 배양하여 얻은 배양 상등액을 ammonium sulfate(l 5%~70%), DEAE-Sepharose column 크로마토그래피, 한외여과(PM 10)와 Q-Sepharose column 크로마토그래피를 수행하였다. 최종적으로 Q-Sepharose column에서 용출된 분획 중 가장 효소활성이 높은 분획을 SDS-PAGE로 조사한 결과 완전히 정제되지 않은 것으로 나타났다. 따라서 이를 phytase의 부분정제 효소액으로 사용하여 반응온도와 pH가 phytase 활성에 미치는 영향을 조사하기 위하여 30〜7CFC까지의 온도에서 각각 효소 활성을 측정하였으며, 활성에 미치는 pH의 영향을 알아보기 위해서는 pH 5.
- 토양으로부터 분리된 약 1, 200여주의 방선균으로부터 세포 외로 phytase를 분비 생산하는 방선균 YB-26이 분리되었다. 분리 균의 16S rRNA 염기서열을 조사한 결과 S华pfcw糜as속에 속하는 균주의 서열과 상동성이 높았다.
- serevisiae의 효소는8) 40℃에서 각각 빠르게 실활된다. 한편 세균의 효소는 열 안정성에 있어서 균주간 차이가 많으며 B. amyloliquefciens의 효소는 내열성이 우수한 것으로 알려졌다.
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