국내에서 개발된 GM 쌀인 밀양 204호, 익산 483호의 정성 PCR분석법의 개발을 위해 쌀의 내재 유전자로써 SAMDC1(S-adenosylmethionine decarboxylase)에 특이적인 primer (OsSAMDC1-5'/3')쌍을 제작하여 쌀을 포함한 20개 작물에 대해 PCR을 수행하여 쌀에 특이적으로 증폭되는 것을 확인하였다. 또한, 밀양 204호에 삽입된 GUS 유전자와 NOS terminator 연결 부위를 증폭시켜 172 bp의 PCR 산물을 얻을 수 있는 primer(Os204-5'/OsNOS-3')와 익산 483호에 삽입된 bar 유전자와 NOS terminator 연결 부위를 증폭시켜 161 bp의 PCR 산물을 얻을 수 있는 primer(Os483-5'/OsNOS-3')을 이용하여 국내 개발된 GM 쌀인 밀양 204호, 익산 483호의 PCR 정성 분석법을 확립하였다.
국내에서 개발된 GM 쌀인 밀양 204호, 익산 483호의 정성 PCR 분석법의 개발을 위해 쌀의 내재 유전자로써 SAMDC1(S-adenosylmethionine decarboxylase)에 특이적인 primer (OsSAMDC1-5'/3')쌍을 제작하여 쌀을 포함한 20개 작물에 대해 PCR을 수행하여 쌀에 특이적으로 증폭되는 것을 확인하였다. 또한, 밀양 204호에 삽입된 GUS 유전자와 NOS terminator 연결 부위를 증폭시켜 172 bp의 PCR 산물을 얻을 수 있는 primer(Os204-5'/OsNOS-3')와 익산 483호에 삽입된 bar 유전자와 NOS terminator 연결 부위를 증폭시켜 161 bp의 PCR 산물을 얻을 수 있는 primer(Os483-5'/OsNOS-3')을 이용하여 국내 개발된 GM 쌀인 밀양 204호, 익산 483호의 PCR 정성 분석법을 확립하였다.
For the development of qualitative PCR detection method of genetically modified rice (Oryza sativa L.), rice species specific gene, SAMDC1 (S-adenosylmethionine decarboxylase), was selected and validated as suitable for use as an endogenous reference gene in rice. The primer pair OsSAMDC1-5'/3' with...
For the development of qualitative PCR detection method of genetically modified rice (Oryza sativa L.), rice species specific gene, SAMDC1 (S-adenosylmethionine decarboxylase), was selected and validated as suitable for use as an endogenous reference gene in rice. The primer pair OsSAMDC1-5'/3' with 110 bp amplicon was used for amplification of the rice endogenous gene, SAMDC1 and no amplified product was observed from 19 different plants as templates. Qualitative PCR method was assayed with 2 different GM rices (Milyang 204 and Iksan 483) developed in Korea. For the qualitative PCRs, the construct-specific detection primer pairs were constructed. Os204-5'/OsNOS-3' amplifying the junction region of GUS gene and NOS terminator introduced in Milyang 204 gave rise to an amplicon 172 bp; also, Os483-5'/OsNOS-3' amplifying the junction region of Bar gene and NOS terminator introduced in Iksan 483 gave rise to an amplicon 161 bp.
For the development of qualitative PCR detection method of genetically modified rice (Oryza sativa L.), rice species specific gene, SAMDC1 (S-adenosylmethionine decarboxylase), was selected and validated as suitable for use as an endogenous reference gene in rice. The primer pair OsSAMDC1-5'/3' with 110 bp amplicon was used for amplification of the rice endogenous gene, SAMDC1 and no amplified product was observed from 19 different plants as templates. Qualitative PCR method was assayed with 2 different GM rices (Milyang 204 and Iksan 483) developed in Korea. For the qualitative PCRs, the construct-specific detection primer pairs were constructed. Os204-5'/OsNOS-3' amplifying the junction region of GUS gene and NOS terminator introduced in Milyang 204 gave rise to an amplicon 172 bp; also, Os483-5'/OsNOS-3' amplifying the junction region of Bar gene and NOS terminator introduced in Iksan 483 gave rise to an amplicon 161 bp.
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문제 정의
현재까지 GM 콩, 옥수수, 감자 등에 대해 PCR을 이용한 분석 방법8-10)이 보고되었으나, GM 쌀에 대한 정성 PCR 분석법에 대한 보고된 바 없다. 따라서 본 연구에서는 두 종의 GM 쌀의 분석을 위해 쌀의 특이적인 내재 유전자를 선별하고, 제초제 저항성인 밀양204호, 익산 483 호 품종에 삽입된 특이적인 유전자를 이용하여 정성 PCR 분석법을 개발하고자- 한다.
따라서 국내에서도 GM 쌀(밀양 204호, 익산 483호)의 개발을 이미 10년 전부터 시작해 오고 있으며, 국내 상업화를 목적으로 한 최초 GM 작물인 만큼 삽입유전자의 이동성, 재배 기간중에 우점 토착미생물의 변화 양상, 시험포장내 무척추동물의 다양성에 미치는 영향, 생산성 및 영양성분 비교 등의 포괄적인 환경위해성 평가가 진행 중에 있다. 따라서 이러한 GM 쌀의 예기치 못한 개발 중의 관리 소홀로 인한 주변 지역의 방출 또는 앞으로 상업화에 따른 GM 쌀에 대한 관리 체계 확립을 위한 검정법 마련의 필요성에 따라 본 연구를 수행하였다.
제안 방법
GM 쌀, non-GM 쌀, 그리고 다른 19종의 작물들은 모두 1 g씩의 시료를 준비하여 막자사발에 넣고 액체질소를 가하여 분말형태로 만들어 DNeasy Plant Maxi kit(Qiagen, USA)을 이용하여 genomic DNA를 추출하였다. 추출된 DNA 는 UV-visible spectrophotometer UV-1700(Shimadzu, Japan)를 이용하여 260 nm와 280nm에서 정량 하였으며 260nm/280nm 가 1.
5 mM each, TaKaRa, Japan) 그리고 50 ng의 template DNA가 포함되도록 하였고, 반응은 thermocycler PC808(ASTEC, Japan)를 이용하여 수행하였다. PCR 조건으로 첫 cycle에서 95℃에서 5분간 수행하였고 나머지 cycle에서는 95℃에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 30 초간 40 cycle을 수행하였으며, 마지막 단계로 72P에서 8분간 수행한 후 4P에서 PCR 산물을 보관하였다. PCR 산물은 3% agarose gel상에서 전기영동을 수행하였다.
1에서 보는 바와 같이 밀양 204호는 bar 유전자와 NOS terminator가 삽입되어 있고, 익산 483호는 bar 유전자와 NOS terminator 그리고 GUS 유전자가 삽입되어 있다. 따라서 본 연구에서는 밀양 204호의 분석을 위해 GUS 유전자와 NOS termmator 부위에서 각각 forward/reverse primer 쌍을 제작하였고, 익산 483 호의 분석을 위해 bar 유전자와 NOS terminator 부위에서 forward/reverse primer 쌍을 제작하였다. 이러한 각각의 primer 쌍과 쌀의 내재 유전자를 특이적으로 증폭시킬 수 있는 primer(OsSAMCl-5'3')쌍을 이용하여 duplex PCR을 실시하였다(Fig.
밀양 204호와 익산 483호에 각각의 특이적인 primer 쌍을 이용하여 증폭된 PCR 산물들은 Automated DNA Sequencer ABT 3700(Applied Biosystems, USA)을 이용하여 두 번 반복하여 염기서열을 분석하였다.
반응 용액은 1.5mM MgCl2를 포함하는 10XPCR bufler(TaKaRa, Japan) 2.5 yd, 10 μM 의 forward primer, 10 μM의 reverse primer, 2 ㎕ dNTP(2.5 mM each, TaKaRa, Japan) 그리고 50 ng의 template DNA가 포함되도록 하였고, 반응은 thermocycler PC808(ASTEC, Japan)를 이용하여 수행하였다. PCR 조건으로 첫 cycle에서 95℃에서 5분간 수행하였고 나머지 cycle에서는 95℃에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 30 초간 40 cycle을 수행하였으며, 마지막 단계로 72P에서 8분간 수행한 후 4P에서 PCR 산물을 보관하였다.
쌀의 내재 유전자인 SAMDC1 (S-adenosylmethionine decarboxylase) 유전자11)의 염기서열을 기초로 하여 110bp의 PCR 산물을 얻을 수 있도록 특이적인 primer 쌍을 제작하였다. 밀양 204호는 삽입된 GUS 유전자즈와 NOS terminator를 증폭 시켜 172 bp의 PCR 산물을 얻을 수 있도록 특이적인 primer 쌍을 제작하였고, 익산 483은 삽입된 bar 유전자와 NOS terminator를 증폭시켜 161 bp의 PCR 산물을 얻을 수 있도록 특이적인 primer 쌍을 제작하였다(Fig.
얻었다. 이러한 각각의 PCR 산물들은 DNA sequencer 기기의 염기서열 분석을 통해서 각각의 염기서열을 확인하였다.
따라서 본 연구에서는 밀양 204호의 분석을 위해 GUS 유전자와 NOS termmator 부위에서 각각 forward/reverse primer 쌍을 제작하였고, 익산 483 호의 분석을 위해 bar 유전자와 NOS terminator 부위에서 forward/reverse primer 쌍을 제작하였다. 이러한 각각의 primer 쌍과 쌀의 내재 유전자를 특이적으로 증폭시킬 수 있는 primer(OsSAMCl-5'3')쌍을 이용하여 duplex PCR을 실시하였다(Fig. 4).
0 사이인 것을 이용하였다. 추출된 DNA는 0.8%의 agarose gel상에서 lOOvolt로 15분 동안 전기영동을 수행하여 확인하였으며, 표준 분자량의 마커로는 NHindm을 사용하였다 (Fig. 2).
대상 데이터
GM 쌀(밀양204호, 익산 483하과 non-GM 쌀(동진벼)은 Oryzae sativa L., Japonica 종으로써 농존진흥정 농업 생명공학연구원 생물안전성과로부터 분양받아 이용하였으며, 콩, 옥수수, 밀, 면화, 유채, 고추, 비타민, 무수 상추, 적근대, 파, 딸기, 돌미나리, 해바라기, 깻잎, 시금치, 돌나물, 파슬리, 쑥갓등 19개 작물들을 농업생명공학연구원 유전자원과로부터 분양 받거나 국내 시장에서 구입하여 본 연구에 이용하였다.
이용하여 genomic DNA를 추출하였다. 추출된 DNA 는 UV-visible spectrophotometer UV-1700(Shimadzu, Japan)를 이용하여 260 nm와 280nm에서 정량 하였으며 260nm/280nm 가 1.8~2.0 사이인 것을 이용하였다. 추출된 DNA는 0.
성능/효과
flavescens DC.), 파 (Allium fistulosum L.), 딸기 (Fmgcvici Ananassa Duchesne), 콩 (Glycine max L.), 고주(Capsicum annuum L.), 돌미나리 (Oenanthe javanica(BlumeeDCe 해바라기(Helianhus annuus), 말(Triticum aestivum L.), 깻잎(Perilla Frutescens), 시금치 (Spinacia oleracea L.), 돌나물(Sedum sarmentosum Bunge), 파슬리 (Petrosehnum crispum), 쑥갓(Chrysanthemum coronarium L.), 옥수수(Zea mays L.), 면화(Gossypium spp.), 그리고 유채 (Brassica campestrisp}^] 20종의 작물로부터 분리된 genomic DNA를 template로 하고 쌀의 내재 유전자에 특이적인 primer (OsSAMCl-5'3')쌍을 이용하여 PCR 결과 쌀에서만 PCR 산물을 얻었다(Fig 3). 따라서 본 연구에서 제작한 primer쌍이 GM 쌀의 정성 PCR 분석에 있어서 내재 유전자에 대한 특이적인 primer로 적용할 수 있음을 확인하였다.
), 그리고 유채 (Brassica campestrisp}^] 20종의 작물로부터 분리된 genomic DNA를 template로 하고 쌀의 내재 유전자에 특이적인 primer (OsSAMCl-5'3')쌍을 이용하여 PCR 결과 쌀에서만 PCR 산물을 얻었다(Fig 3). 따라서 본 연구에서 제작한 primer쌍이 GM 쌀의 정성 PCR 분석에 있어서 내재 유전자에 대한 특이적인 primer로 적용할 수 있음을 확인하였다.
밀양 204호를 검출할 수 있는 특이적인 primer(Os204-57 OsNos-37쌍은 본 연구에서 제시한 PCR 조건에서 172 bp의 PCR 산물을 얻었고, 익산 483호를 검출할 수 있는 특이적인 primer(Os483-5, /OsNos-3)쌍은 동일한 조건에서 161 bp의 PCR 산물을 얻었다. 이러한 각각의 PCR 산물들은 DNA sequencer 기기의 염기서열 분석을 통해서 각각의 염기서열을 확인하였다.
참고문헌 (13)
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