HPLC에 의한 산지별 한국산 석류과피 중 항산화화합물의 함량분석 Quantitative Analysis of Antioxidants in Korean Pomegranate Husk (Granati pericarpium) Cultivated in Different Site원문보기
한국산 석류 과피 중 주요 성분으로 함유되어 있는 ellagic acid와 punicalagin에 대한 HPLC정량법을 확립하였다. 확립된 방법은 다음과 같다. 즉 column은 Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18($4.6{\times}150mm,\;5{\mu}m$), 이동상은 1% formic acid를 포함하는 순수(A)와 1% formic acid를 함유하는 MeCN(B)을 이용하여(A) 용매가 5%에서 50분 후 100%가 되도록 농도기울기를 주어 용출하며, 이 때 유속은 0.8 ml/min., 검출은 UV 254 nm이다. 석류 과피 중 ellagic acid와 punicalagin 함량을 분석하기 위한 최적 전처리 추출조건을 확립한 결과, 100 ml의 95% ethanol로 5 g의 석류 과피를 3시간 환류추출한 경우 상기 항산화 화합물의 추출효과가 가장 좋았다. 확립된 최적 분석 조건을 이용하여 재배지가 다른 국내산 석류 과피 5종 중 함량을 조사한 결과 ellagic acid의 함량은 해평산이 $15.27{\mu}g/mg$으로 가장 높았으며, punicalagin의 함량은 장성산이 $16.21{\mu}g/mg$으로 가장 높았다. 한편 이들의함량은 산지별로 매우 큰 차이를 보여 한국산 석류피를 건강기능식품 등의 원료로 이용할 경우 산지의 선택이 매우 중요할 수 있음을 시사하였다.
한국산 석류 과피 중 주요 성분으로 함유되어 있는 ellagic acid와 punicalagin에 대한 HPLC 정량법을 확립하였다. 확립된 방법은 다음과 같다. 즉 column은 Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18($4.6{\times}150mm,\;5{\mu}m$), 이동상은 1% formic acid를 포함하는 순수(A)와 1% formic acid를 함유하는 MeCN(B)을 이용하여(A) 용매가 5%에서 50분 후 100%가 되도록 농도기울기를 주어 용출하며, 이 때 유속은 0.8 ml/min., 검출은 UV 254 nm이다. 석류 과피 중 ellagic acid와 punicalagin 함량을 분석하기 위한 최적 전처리 추출조건을 확립한 결과, 100 ml의 95% ethanol로 5 g의 석류 과피를 3시간 환류추출한 경우 상기 항산화 화합물의 추출효과가 가장 좋았다. 확립된 최적 분석 조건을 이용하여 재배지가 다른 국내산 석류 과피 5종 중 함량을 조사한 결과 ellagic acid의 함량은 해평산이 $15.27{\mu}g/mg$으로 가장 높았으며, punicalagin의 함량은 장성산이 $16.21{\mu}g/mg$으로 가장 높았다. 한편 이들의함량은 산지별로 매우 큰 차이를 보여 한국산 석류피를 건강기능식품 등의 원료로 이용할 경우 산지의 선택이 매우 중요할 수 있음을 시사하였다.
The quantitative analytical method for major antioxidants, ellagic acid and punicalagin, in pomegranate husk (Granati pericarpium) were established by HPLC. The optimal HPLC conditions were as follows: Column; Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18 ($4.6{\times}150mm,\;5{\mu}m$), mobile phase; 1%...
The quantitative analytical method for major antioxidants, ellagic acid and punicalagin, in pomegranate husk (Granati pericarpium) were established by HPLC. The optimal HPLC conditions were as follows: Column; Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18 ($4.6{\times}150mm,\;5{\mu}m$), mobile phase; 1% formic acid in water (A) and 1% formic acid in MeCN (B) (gradient elution of 5% to 100% B for 50 min), flow rate; 0.8 ml/min., detection; UV 254 nm. The optimal pre-treatment conditions for HPLC analysis were as follows: 5 g of pomegranate husk in 100 ml of 95% EtOH, refluxed for 3 h. Under these analytical conditions, punicalagin and ellagic acid contents in Korean pomegranates husks which were cultivated in five different sites were determined. As results, the ellagic acid and punicalagin (as a mixture of ${\alpha-\;and\;{\beta}-anomer$) contents were the highest in Haepyung pomegranate husk $(15.27{\mu}g/mg)$ and Jangsung pomegranate husk $(16.21{\mu}g/mg)$, respectively.
The quantitative analytical method for major antioxidants, ellagic acid and punicalagin, in pomegranate husk (Granati pericarpium) were established by HPLC. The optimal HPLC conditions were as follows: Column; Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18 ($4.6{\times}150mm,\;5{\mu}m$), mobile phase; 1% formic acid in water (A) and 1% formic acid in MeCN (B) (gradient elution of 5% to 100% B for 50 min), flow rate; 0.8 ml/min., detection; UV 254 nm. The optimal pre-treatment conditions for HPLC analysis were as follows: 5 g of pomegranate husk in 100 ml of 95% EtOH, refluxed for 3 h. Under these analytical conditions, punicalagin and ellagic acid contents in Korean pomegranates husks which were cultivated in five different sites were determined. As results, the ellagic acid and punicalagin (as a mixture of ${\alpha-\;and\;{\beta}-anomer$) contents were the highest in Haepyung pomegranate husk $(15.27{\mu}g/mg)$ and Jangsung pomegranate husk $(16.21{\mu}g/mg)$, respectively.
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문제 정의
최적 전처리조건 확립. 석류의 주요 항산화 물질로 알려진 ellagic acid 및 punicalagin에 대한 최적 주줄 조건을 검토하였다. 먼저 ethanol 농도(40-95% 수성 ethanol)에 따른 ellagic acid 및 punicalagin의 추출 효과를 비교한 결과, 화합물의 종류에 따라 많은 차이를 나타내었는데, ellagic acid의 함량에 미치는 영향은 매우 적은 반면, punicalagin의 경우(a- 및 β-anomer의 합)는 ethanol 농도가 높을수록 추출되는 함량이 증가하는 경향을 나타내어 40% ethanol로 추출한 경우에 비하여 95% ethanol로 추출한 경우 약 70% 함량이 증가하였다(Fig.
함량에 대한 연구는 없다. 이와 같은 배경에 따라 한국산 석류 과피 중의 항산화 성분 분석에 적합한 HPLC 분석법을 확립하고, 확립된 방법을 이용하여 산지별 석류 과피 중의 항산화 성분을 분석, 정량함으로써 한국산 석류의 항산화 건강기능식품 자원화를 위한 기초자료를 확립하고자 하였다.
제안 방법
Poyrazogiu 등28)의 여러 문헌 및 HPLC 상에서의 major peak를 분리한 자체 결과를 토대로 석류 과피 중 주 항산화 물질로 ellagic acid(Sigma, USA)와 punicalagin(자체 분리동정, UV 254 nm, HPLC에서 순도 98% 이상)29)을 지표 성분으로 정하고, HPLC를 이용하여 확보된 표준품의 standard curve를 작성하였다. HPLC 조건은 석류 ethanol 추출물의 분석에 사용한 것과 동일하며, 표준품을 일정 농도로 희석한 후 HPLC에서 나타난 peak area의 2회 반복 평균값을 취한 후 표준품의 양과 peak area 사이의 상관 관계를 도출하여 검량선을 작성하였다.
석류 ethanol 추출물의 HPLC 분석법 확립. HPLC는 Jasco PU-2080+ 펌프 및 MD-2010+ PDA 검출기를 이용하였으며, 컬럼은 ZORBAX Ecilpse XDB-Cl8(Agilent, 4.6X250mm, 5 ㎛)를 이용하여 석류 과피 중 성분 분석을 하였다. 이 때, mobile phase는 1% fonnic acid를 함유한 H2O(A)와 1% formic acid를 함유한 acetonitriIe(B)[(B)가 50분 동안 5%에서 100%까지 증가하도록 농도 구배를 줌], flow rate는 0.
작성. Poyrazogiu 등28)의 여러 문헌 및 HPLC 상에서의 major peak를 분리한 자체 결과를 토대로 석류 과피 중 주 항산화 물질로 ellagic acid(Sigma, USA)와 punicalagin(자체 분리동정, UV 254 nm, HPLC에서 순도 98% 이상)29)을 지표 성분으로 정하고, HPLC를 이용하여 확보된 표준품의 standard curve를 작성하였다. HPLC 조건은 석류 ethanol 추출물의 분석에 사용한 것과 동일하며, 표준품을 일정 농도로 희석한 후 HPLC에서 나타난 peak area의 2회 반복 평균값을 취한 후 표준품의 양과 peak area 사이의 상관 관계를 도출하여 검량선을 작성하였다.
6 X 150 mm) 등의 column을 비교하였다. 그 결과 ZORBAX XDBC18(Agilent, 4.6 × 150 mm)을 고정상으로 사용한 경우, 대부분의 주요 peak들이 base line separation을 나타냈으므로 이 column을 이용하여 분석하기로 하였다. 또한 PDA 상에서 주요 peak들의 검출 pattern을 비교한 결과 uv 254 혹은 380nm에서 측정한 경우보다 254 nm에서 검출하는 것이 주요 peak의 감도가 좋았으며, 기타 화합물의 검출감도도 좋았다(Fig.
또한 95% ethanol을 용매로 하여 추출시간에 따른 ellagic acid 및 punicalagin의 추출율을 조사하였다(Fig. 3). 이 경우에도 ellagic acid의 함량에 미치는 영향은 매우 미미하였으나 punicalagin 함량의 경우 추출시간이 길어짐에 따라 추출효율이 증가하다가 3시간 이후에는 함량 증가가 완만하게 나타나, 경제적인 면을 고려한다면 석류 과피로부터 주요 항산화 화합물을 추출하는 데는 3시간 정도가 가장 적당한 것으로 판단되었다.
산지별석류과피 추출물 중 항산화성분 함량분석. 상기에서 얻은 최적 추출방법에 따라 산지별로 시료를 초제한 다음, 이들 중 함유된 항산화 성분 ellagic acid와 punicalagin의 함량을 확립된 HPLC 분석 방법에 따라 정량하였다. 그 결과, punicalagin 의 함량은 16.
HPLC 분석법 확립. 석류추출물에 포함된 항산화 화합물들의 최적분석법 확립을 위하여 μ-Bondapak C18(Waters, 3.9 × 150 mm, 3.9X300 mm), Nova-Pak C18(Waters, 3.9 X 150 mm), Symmetry C18(3.9X 150 mm), Tosoh 80TM(Toshoh, 4.2 × 150 mm), ZORBAX XDBC18(Agilent, 4.6 X 150 mm) 등의 column을 비교하였다. 그 결과 ZORBAX XDBC18(Agilent, 4.
최적 추출 용매를 결정하기 위하여 가장 확보량이 많은 해평산 석류 5 g을 서로 다른 농도의 수성 ethanol 100 mZ로 3시간 동안 환류추출하거나, 최적 추출 시간을 결정하기 위하여 석류 5 g에 대하여 100ml의 95% 에탄올로 1, 2, 3, 4시간 환류추출 하였다. 위 방법으로 추출한 추출물을 filter paper로 여과 후 여액에 적당량의 ethanol을 가하여 용량을 100 m/로 조절한 다음 이 용액 1 ml를취하여 0.45 |im membrane filter로 여과 후 여 액 20 ㎕를 HPLC로 분석하였다.
6X250mm, 5 ㎛)를 이용하여 석류 과피 중 성분 분석을 하였다. 이 때, mobile phase는 1% fonnic acid를 함유한 H2O(A)와 1% formic acid를 함유한 acetonitriIe(B)[(B)가 50분 동안 5%에서 100%까지 증가하도록 농도 구배를 줌], flow rate는 0.8 ml/min, detector는 PDA로 측정하여 UV 254nm에서 peak area 값을 측정하였다.
추출 용매로서는 식품으로 사용된다는 점을 감안하여 ethanol을 사용하였다. 최적 추출 용매를 결정하기 위하여 가장 확보량이 많은 해평산 석류 5 g을 서로 다른 농도의 수성 ethanol 100 mZ로 3시간 동안 환류추출하거나, 최적 추출 시간을 결정하기 위하여 석류 5 g에 대하여 100ml의 95% 에탄올로 1, 2, 3, 4시간 환류추출 하였다. 위 방법으로 추출한 추출물을 filter paper로 여과 후 여액에 적당량의 ethanol을 가하여 용량을 100 m/로 조절한 다음 이 용액 1 ml를취하여 0.
이러한 결과에 따라서 이후의 실험은 모두 95% ethanol을 이용하여 추출하였다. 한편 95%의 ethanol으로 추출하고 남은 추출 잔사에 대하여 2차 환류추출한 경우는 두 화합물이 거의 검출되지 않아 추출회수는 1회로 한정하였다(data 미제시).
대상 데이터
국내산 산지별 석류의 확보. 경북 의성, 해평, 안동 및 대구, 전남 장성 등 소규모 재배지로부터 5종의 석류를 확보하였다(2002년 10월수집).
성능/효과
상기에서 얻은 최적 추출방법에 따라 산지별로 시료를 초제한 다음, 이들 중 함유된 항산화 성분 ellagic acid와 punicalagin의 함량을 확립된 HPLC 분석 방법에 따라 정량하였다. 그 결과, punicalagin 의 함량은 16.25g/mg으로 장성산이 가장 높았으며 ellagic acid의 경우 해평산이 15.27 ㎍/mg으로 가장 높았다(Table 1). 또한 산지별로 석류과피 중 주요 항산화 성분인 ellagic acid와 punicalagin의 함량 차이가 매우 커 국내산 석류를 이용하여 항산화건강기능식품을 개발할 경우, 산지의 선택이 매우 중요한 요소가 될 수 있음을 시사하였다.
6 × 150 mm)을 고정상으로 사용한 경우, 대부분의 주요 peak들이 base line separation을 나타냈으므로 이 column을 이용하여 분석하기로 하였다. 또한 PDA 상에서 주요 peak들의 검출 pattern을 비교한 결과 uv 254 혹은 380nm에서 측정한 경우보다 254 nm에서 검출하는 것이 주요 peak의 감도가 좋았으며, 기타 화합물의 검출감도도 좋았다(Fig. 1).
27 ㎍/mg으로 가장 높았다(Table 1). 또한 산지별로 석류과피 중 주요 항산화 성분인 ellagic acid와 punicalagin의 함량 차이가 매우 커 국내산 석류를 이용하여 항산화건강기능식품을 개발할 경우, 산지의 선택이 매우 중요한 요소가 될 수 있음을 시사하였다. 한편, 사용한 석류는 대규모 재배지가 아닌 소규모 재배지에서 채집한 것으로 정확한 재배년수를 알 수 없어, 재배 년수의 영향도 간과할 수 없으므로 이에 대하여는 추후 보완연구가 필요할 것으로 생각된다.
석류의 주요 항산화 물질로 알려진 ellagic acid 및 punicalagin에 대한 최적 주줄 조건을 검토하였다. 먼저 ethanol 농도(40-95% 수성 ethanol)에 따른 ellagic acid 및 punicalagin의 추출 효과를 비교한 결과, 화합물의 종류에 따라 많은 차이를 나타내었는데, ellagic acid의 함량에 미치는 영향은 매우 적은 반면, punicalagin의 경우(a- 및 β-anomer의 합)는 ethanol 농도가 높을수록 추출되는 함량이 증가하는 경향을 나타내어 40% ethanol로 추출한 경우에 비하여 95% ethanol로 추출한 경우 약 70% 함량이 증가하였다(Fig. 2). 사용 용매 중 95% ethanol을 사용한 경우가 두 가지 화합물에 대한 추출 효율이 가장 높았으며 경제적인 면을 고려하여 100% ethanol은 실험 대상에서 제외하였다.
3). 이 경우에도 ellagic acid의 함량에 미치는 영향은 매우 미미하였으나 punicalagin 함량의 경우 추출시간이 길어짐에 따라 추출효율이 증가하다가 3시간 이후에는 함량 증가가 완만하게 나타나, 경제적인 면을 고려한다면 석류 과피로부터 주요 항산화 화합물을 추출하는 데는 3시간 정도가 가장 적당한 것으로 판단되었다.
후속연구
또한 산지별로 석류과피 중 주요 항산화 성분인 ellagic acid와 punicalagin의 함량 차이가 매우 커 국내산 석류를 이용하여 항산화건강기능식품을 개발할 경우, 산지의 선택이 매우 중요한 요소가 될 수 있음을 시사하였다. 한편, 사용한 석류는 대규모 재배지가 아닌 소규모 재배지에서 채집한 것으로 정확한 재배년수를 알 수 없어, 재배 년수의 영향도 간과할 수 없으므로 이에 대하여는 추후 보완연구가 필요할 것으로 생각된다.
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