Rhizoctonia solani에 의한 결구상추 밑둥썩음병 방제균주 Stenotrophomonas maltophilia BW-13의 분리 및 동정 Isolation and Identification of Stenotrophomonas maltophilia BW-13 Active Against Rhizoctonia solani Causing Crisphead Lettuce Bottom Rot원문보기
결구상추 밑둥썩음병의 병원균 Rhizoctonia solani에 대한 길항세균을 분리하기 위하여 결구상추 재배 포장에서 결구상추의 밑둥부위, 뿌리조직 그리고 근권토양에서 세균 702균주를 분리하였다. 분리균주 중에서 대치배양에 의해 길항능을 나타낸 7균주를 선발하였으며, 그 중 포트검정 실험에서 유묘와 성체식물에서 발병억제효과가 우수한 BW-13균주를 길항균으로 최종선발하였다. 최종 선발된 BW-13균주의 동정을 위하여 생리$\cdot$생화학적 특성, API test 및 16S rDNA sequence를 분석한 결과 Stenotrophomonas maltophilia로 동정되었으며, 본 균주를 S. maltophilia BW-13으로 명명하였다. 본 연구의 결과는 S. maltophilia BW-13이 결구상추 밑둥썩음병의 생물적 방제원으로 이용될 수 있음을 보여준다.
결구상추 밑둥썩음병의 병원균 Rhizoctonia solani에 대한 길항세균을 분리하기 위하여 결구상추 재배 포장에서 결구상추의 밑둥부위, 뿌리조직 그리고 근권토양에서 세균 702균주를 분리하였다. 분리균주 중에서 대치배양에 의해 길항능을 나타낸 7균주를 선발하였으며, 그 중 포트검정 실험에서 유묘와 성체식물에서 발병억제효과가 우수한 BW-13균주를 길항균으로 최종선발하였다. 최종 선발된 BW-13균주의 동정을 위하여 생리$\cdot$생화학적 특성, API test 및 16S rDNA sequence를 분석한 결과 Stenotrophomonas maltophilia로 동정되었으며, 본 균주를 S. maltophilia BW-13으로 명명하였다. 본 연구의 결과는 S. maltophilia BW-13이 결구상추 밑둥썩음병의 생물적 방제원으로 이용될 수 있음을 보여준다.
In a course of searching for biofungicide to control crisphead lettuce bottom rot caused by Rhizoctonia solani, we have isolated an antagonistic bacterium from lettuce rhisophere soil. A total of 702 bacterial isolates were isolated and tested for in vitro growth inhibition of R. solani. Seven strai...
In a course of searching for biofungicide to control crisphead lettuce bottom rot caused by Rhizoctonia solani, we have isolated an antagonistic bacterium from lettuce rhisophere soil. A total of 702 bacterial isolates were isolated and tested for in vitro growth inhibition of R. solani. Seven strains appeared to have strong antagonistic effect against R. solani in in vitro growth inhibition assay. In the pot experiments, a strain BW-13 showed the most potent disease control effect on the both lettuce seedlings and adults plants. Therefore, the BW-13 was selected as a biocotrol candidate against crisphead lettuce bottom rot. Based on its morphology, physiological characteristics, and 165 rRNA gene analysis, the BW-13 was finally identified as Stenotrophomonas maltophilia. This study indicated that S. maltophilia BW-13 could be used as a biocontrol agent to control crisphead lettuce bottom rot.
In a course of searching for biofungicide to control crisphead lettuce bottom rot caused by Rhizoctonia solani, we have isolated an antagonistic bacterium from lettuce rhisophere soil. A total of 702 bacterial isolates were isolated and tested for in vitro growth inhibition of R. solani. Seven strains appeared to have strong antagonistic effect against R. solani in in vitro growth inhibition assay. In the pot experiments, a strain BW-13 showed the most potent disease control effect on the both lettuce seedlings and adults plants. Therefore, the BW-13 was selected as a biocotrol candidate against crisphead lettuce bottom rot. Based on its morphology, physiological characteristics, and 165 rRNA gene analysis, the BW-13 was finally identified as Stenotrophomonas maltophilia. This study indicated that S. maltophilia BW-13 could be used as a biocontrol agent to control crisphead lettuce bottom rot.
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문제 정의
본 연구에서는 결구상추 밑둥썩음병을 생물적으로 방 제하기 위해 길항력이 높고 지금까지 보고된 바가 없는 새로운 길항세균을 분리하여 동정하였다. 또한 생물적 방 제의 실용화를 위해 분리균주의 결구상추 밑둥썩음병의 생물적 방제 활성을 검토하였다.
본 연구에서는 결구상추 밑둥썩음병을 생물적으로 방 제하기 위해 길항력이 높고 지금까지 보고된 바가 없는 새로운 길항세균을 분리하여 동정하였다. 또한 생물적 방 제의 실용화를 위해 분리균주의 결구상추 밑둥썩음병의 생물적 방제 활성을 검토하였다.
제안 방법
유묘 및 성체식물의 생육상내 포트검정. 1차 선발된 균주들을 nutrient broth 배지에서 30℃, 1일간 진탕배양 한 후 세균부유액(IXleCFU/mZ)을 결구상추의 유묘 및 파종 후 30일된 성체식물에 각각 50m/, 100 m/씩 골고루 분무접종하였다. 이것을 25℃ 생육실에 보관 24시간 후에 Yeast extract-glucose broth(YGB 배지)에서 진탕 배양 한 병원균 PY-1 균주의 균사조각 부유액0抑=1.
1차 선발된 길항세균을 결구상추에 접종하여 비 병원성균임을 확인하였다. 1차 선발된 길항세균의 밑둥썩음병에 대한 발병억 제 효과를 보기위해 유묘 및 성체식물의 생육상내 포트 검정을 실시하였다.
5 units의 Taq DNA polymerase가 혼합되었다. PCR product는 pGEM-T vector (Promega, U.S.A)에 cloning 하였으며, 유전자의 염기서열은 GenBank에서 BLASTN 으로 분석하였다. 최종선발된 길항세균 BW-13 균주의 16S rDNA 염기서열을 결정하고 PAUP 프로그램의 default setting으로 Maximum parsimony 분석을 통해 계통분류적 위치를 확인하였으며, 계통분류 tree의 신뢰를 위해 200 회 반복으로 Bootstrap 분석을 수행하였다.
경상남도 의령군 부림면 신 반리의 결구상추 재배 포장에서 건전 결구상추의 밑둥부 위, 뿌리 및 근권토양 10 g을 살균수 50ml과 각각 혼합 한 후, 마쇄기 (Warning, USA)에 10~30초간 분쇄한 다음 nutrient agar 배지에 평판희석법으로 배양하였다. 각 시료를 3(TC에서 48시간 배양한 후 세균균총을 분리하여 순 수배양하고, 각 균주별로 R. solani에 대한 길항능을 조 사하였다. 실험에 사용된 병원균은 결구상추로부터 분리한 R.
0) 40 ml 을 길항세균 처리한 결구상추 잎에 골고루 분무 접종하 고(Kim 등, 2004), 3일 후 플라스틱 하우스에 옮겨서 7일 이후의 방제가를 측정하여 가장 높은 방제가를 나타낸 균 주를 길항균으로 최종 선발하였다. 각 처리구는 5포트로 하여 3반복으로 시행하였다. 길항균에 의한 식물병의 방 제가는 다음과 같이 계산하였다.
결구상추 밑둥썩음병의 병원균 Rhizoctonia solani, 에 대한 길항세균을 분리하기 위하여 결구상추 재배 포장에서 결구상추의 밑둥부위, 뿌리조직 그리고 근권토양에서 세 균 702균주를 분리하였다. 분리균주 중에서 대치배양에 의해 길항능을 나타낸 7균주를 선발하였으며, 그 중 포 트검정 실험에서 유묘와 성체식물에서 발병억제효과가 우수한 BW-13균주를 길항균으로 최종선발하였다.
길항세균의 선발 및 항균활성 검정. 토착 생육력이 강한 길항세균을 분리하기 위하여 재배 포장내의 결구상추 의 밑둥부위, 뿌리 및 근권토양에서 토양세균을 분리한결과 총 702균주를 분리하였다.
solani PY-1 을 사용하였으며 (Kim 등, 2004), potato dextrose agar (PDA)배지에서 배양하였다. 분리균주에서 길항 미생물을 선발하기 위하여, PDA배지상에서 분리균 주별로 병원균 PY-1 균주와 25℃에서 5~7일간 대치배양 하여 균사생장 저지대(inhibition zone)를 조사하여 저지대 가 큰 세균을 길항세균으로 1차 선발하였다. 1차 선발된 길항세균을 결구상추에 접종하여 비 병원성균임을 확인하였다.
토착 생육력이 강한 길항세균을 분리하기 위하여 재배 포장내의 결구상추 의 밑둥부위, 뿌리 및 근권토양에서 토양세균을 분리한결과 총 702균주를 분리하였다. 분리된 균주 중에서 밑 둥썩음병의 병원균인 R. solani PY-1에 대한 길항능을 가진 균주를 분리, 선발하기 위하여 대치배양한 결과 강한항균활성을 나타낸 7균주를 1차 선발하였다(Table 1, Fig. 1). 1차 선발된 각 길항세균에 의한 발병억제 효과를 유 묘와 성체식물에서 포트검정한 결과, 유묘에서의 방제가 는 길항세균 R-13 처리구에서 82.
1차 선발된 균주들을 nutrient broth 배지에서 30℃, 1일간 진탕배양 한 후 세균부유액(IXleCFU/mZ)을 결구상추의 유묘 및 파종 후 30일된 성체식물에 각각 50m/, 100 m/씩 골고루 분무접종하였다. 이것을 25℃ 생육실에 보관 24시간 후에 Yeast extract-glucose broth(YGB 배지)에서 진탕 배양 한 병원균 PY-1 균주의 균사조각 부유액0抑=1.0) 40 ml 을 길항세균 처리한 결구상추 잎에 골고루 분무 접종하 고(Kim 등, 2004), 3일 후 플라스틱 하우스에 옮겨서 7일 이후의 방제가를 측정하여 가장 높은 방제가를 나타낸 균 주를 길항균으로 최종 선발하였다. 각 처리구는 5포트로 하여 3반복으로 시행하였다.
길항 세균의 동정. 최종 선발된 길항 미생물의 동정을 위하여 투과전자현미경 (TEM)을 이용한 형태 관찰 및 API system(API 20E kit, bioMerieux, France)를 이용한 생리학 적 특성을 조사하였으며, 기타 생화학적 특성을 Bergey's manual을 기초로 하여 조사하였다. 16S rDNA sequence 분석을 위하여 Genomic DNA purification kit (Promega,U.
A)에 cloning 하였으며, 유전자의 염기서열은 GenBank에서 BLASTN 으로 분석하였다. 최종선발된 길항세균 BW-13 균주의 16S rDNA 염기서열을 결정하고 PAUP 프로그램의 default setting으로 Maximum parsimony 분석을 통해 계통분류적 위치를 확인하였으며, 계통분류 tree의 신뢰를 위해 200 회 반복으로 Bootstrap 분석을 수행하였다.
대상 데이터
최종 선발된 길항 미생물의 동정을 위하여 투과전자현미경 (TEM)을 이용한 형태 관찰 및 API system(API 20E kit, bioMerieux, France)를 이용한 생리학 적 특성을 조사하였으며, 기타 생화학적 특성을 Bergey's manual을 기초로 하여 조사하였다. 16S rDNA sequence 분석을 위하여 Genomic DNA purification kit (Promega,U.S.A)를 사용하여 chromosomal DNA를 준비하였으며, 16S rDNA의 증폭을 위한 primer는 universal primer 27mF (5'-AGA GTT TGA TCH)와 1492R (5'-GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3)를 사용하였다. PCR 반응은 초기 변 성화 반응(9VC, 3분), 30회의 증폭반응(94℃, 1분; 45℃, 30초; 72℃, 1분 30초) 그리고 최종 확장반응(72℃, 5분) 조건으로 수행되었다.
길항세균의 분리 및 선발. 경상남도 의령군 부림면 신 반리의 결구상추 재배 포장에서 건전 결구상추의 밑둥부 위, 뿌리 및 근권토양 10 g을 살균수 50ml과 각각 혼합 한 후, 마쇄기 (Warning, USA)에 10~30초간 분쇄한 다음 nutrient agar 배지에 평판희석법으로 배양하였다. 각 시료를 3(TC에서 48시간 배양한 후 세균균총을 분리하여 순 수배양하고, 각 균주별로 R.
결구상추 밑둥썩음병의 병원균 Rhizoctonia solani, 에 대한 길항세균을 분리하기 위하여 결구상추 재배 포장에서 결구상추의 밑둥부위, 뿌리조직 그리고 근권토양에서 세 균 702균주를 분리하였다. 분리균주 중에서 대치배양에 의해 길항능을 나타낸 7균주를 선발하였으며, 그 중 포 트검정 실험에서 유묘와 성체식물에서 발병억제효과가 우수한 BW-13균주를 길항균으로 최종선발하였다. 최종 선발된 BW-13균주의 동정을 위하여 생리 .
solani에 대한 길항능을 조 사하였다. 실험에 사용된 병원균은 결구상추로부터 분리한 R. solani PY-1 을 사용하였으며 (Kim 등, 2004), potato dextrose agar (PDA)배지에서 배양하였다. 분리균주에서 길항 미생물을 선발하기 위하여, PDA배지상에서 분리균 주별로 병원균 PY-1 균주와 25℃에서 5~7일간 대치배양 하여 균사생장 저지대(inhibition zone)를 조사하여 저지대 가 큰 세균을 길항세균으로 1차 선발하였다.
성능/효과
1). 1차 선발된 각 길항세균에 의한 발병억제 효과를 유 묘와 성체식물에서 포트검정한 결과, 유묘에서의 방제가 는 길항세균 R-13 처리구에서 82.4%로 가장 높은 방제 가를 보였으며, BW-13, R-26순으로 각각 72.4%, 63.7% 의 방제가를 나타내었다. 이에 반해 성체식물에서는 BW13 균주가 70.
분리균주에서 길항 미생물을 선발하기 위하여, PDA배지상에서 분리균 주별로 병원균 PY-1 균주와 25℃에서 5~7일간 대치배양 하여 균사생장 저지대(inhibition zone)를 조사하여 저지대 가 큰 세균을 길항세균으로 1차 선발하였다. 1차 선발된 길항세균을 결구상추에 접종하여 비 병원성균임을 확인하였다. 1차 선발된 길항세균의 밑둥썩음병에 대한 발병억 제 효과를 보기위해 유묘 및 성체식물의 생육상내 포트 검정을 실시하였다.
본 연구의 결과는S. maltophilia BWJ3이 결구상추 밑둥썩음병의 생물적 방제원으로 이용될 수 있음을 보여준다.
maltophilia의 식물 병원균에 대한 길 항능의 작용기작은 protease, chitinase, 0-1,3-glucanase 등과 같은 진균의 세포벽 분해능과 관련된 효소의 분비, maltophilia, xanthobactiri과 같은 항진균성 활성을 가진 항 생물질의 생산, 그리고 근권에서의 정착성 등이 보고 되어 있다(Dunne 등, 1997; Elliott Juhnke 등, 1987; Lambert 등, 1987; Lambert 등, 1990; O'Brien와 Davis, 1982; Zhmg와 Yuen, 2000). 그러나 본 연구에서 BW-13 균주 의 chitinase 활성은 미미한 것으로 확인되었으므로, S. maltophilia BW-13 균주의 결구상주 밑둥썩음병균 R. solani PY-1 에 대한 생물학적 방제효과의 작용기작은 항생물질 에 의한 항생작용인 것으로 생각된다.
5). 따라서 본 균주를 S. maltophilia BW-13 으로 최종 동정하고 명명하였다.
4%의 방제가를 보였다. 따라서, 결구상추의 유묘와 성체의 포트검정을 통하여 BW-13 균주가 다른 길항세균에 비하여 R. solani1^ 대한 발병억제 효과가 우수하여 길항세균으로 최종선발하였다(Fig. 2, 3).
생화학적 특성을 조사한 결과, catalase, protease의 활성 그리고 starch 분해능이 있었으 며, citrate와 glucose을 이용하였고, oxidase에 양성반응을 나타냈다. 또한 진균의 세포벽을 가수분해할 수 있는 chitinase 활성은 나타났지만 미미한 수준이었고, 식물에 대한 병원 성은 나타나지 않았다(Table 2). 이상의 생리 • 생화학적 및 형태학적 특성을 Bergey's manual과 비교한 결과 Stenotrophomonas maltophiliae 가장 유사하였으며, API system의 분석과 16S rDNA sequence 분석결과 각각 98.
8% 와 99%의 유사도를 보였다. 또한, 계통분류적 분석 결과 BW-13이 database의 S. maltophilia와 가장 유사한 것으로 나타났다(Fig. 5). 따라서 본 균주를 S.
4), 편모가 있어 운동성이 있는 것으로 조사되었다. 생화학적 특성을 조사한 결과, catalase, protease의 활성 그리고 starch 분해능이 있었으 며, citrate와 glucose을 이용하였고, oxidase에 양성반응을 나타냈다. 또한 진균의 세포벽을 가수분해할 수 있는 chitinase 활성은 나타났지만 미미한 수준이었고, 식물에 대한 병원 성은 나타나지 않았다(Table 2).
또한 진균의 세포벽을 가수분해할 수 있는 chitinase 활성은 나타났지만 미미한 수준이었고, 식물에 대한 병원 성은 나타나지 않았다(Table 2). 이상의 생리 • 생화학적 및 형태학적 특성을 Bergey's manual과 비교한 결과 Stenotrophomonas maltophiliae 가장 유사하였으며, API system의 분석과 16S rDNA sequence 분석결과 각각 98.8% 와 99%의 유사도를 보였다. 또한, 계통분류적 분석 결과 BW-13이 database의 S.
길항세균의 동정. 최종 선발된 길항세균 BW-13 균주 를 그람 염색 및 투과전자현미경으로 관찰한 결과, 그람 음성 간균의 형태였으며(Fig. 4), 편모가 있어 운동성이 있는 것으로 조사되었다. 생화학적 특성을 조사한 결과, catalase, protease의 활성 그리고 starch 분해능이 있었으 며, citrate와 glucose을 이용하였고, oxidase에 양성반응을 나타냈다.
길항세균의 선발 및 항균활성 검정. 토착 생육력이 강한 길항세균을 분리하기 위하여 재배 포장내의 결구상추 의 밑둥부위, 뿌리 및 근권토양에서 토양세균을 분리한결과 총 702균주를 분리하였다. 분리된 균주 중에서 밑 둥썩음병의 병원균인 R.
참고문헌 (18)
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