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문제 정의
- 이러한 통합공정의 타당성을 조사하기 위한 본 연구에서는 lipase를 모델 단백질로 하여, 내 포체 용해용 변성제를 함유한 버퍼 내에서 풀린 (unfolded) 단백질을 대상으로 PEGylation을 시킴으로써 변성 버퍼 상에서의 PEGylation 가능성을 살펴보았고, PEGylation 된 단백질의의 in vitro 재접 힘 가능성 및 수율에 대해 살펴보았다.
제안 방법
- GPC로 분리한 mono-, di-PEGylated lipase를 대상으로 8 M urea를 첨가하여 풀림 시킨 후 희석을 통해 재접힘 시켰 다. Native 한 단량체 lipase의 경우 재접힘 수율은 약 30%이었고, mono-, di-PEGylate 경우에도 각각 27.
- GPC에 의해 분리된 mono-PEGylate, di-PEGylate 및 미수식 된 단량체 lipase 각 0.5 mL를 변성 버퍼 (8 M urea, 0.1 M sodium phosphate, 5 mM DTT, pH 8.0) 내에서 상온에서 2시간 동안 풀림 시킨 후 rapid dilution 시키는 방법에 의해 재접 힘 시켰다. 재접힘 버퍼로는 0.
- GPC에 의해 분리한 PEGylated lipase의 효소 역가를 측정하여 native lipase의 역가와 비교함으로써 PEGylated lipaseS] 활성을 평가하였다. 또 재접힘된 PEGylated lipase의 역가를 측정함으로써 재접힘 수율을 결정하였다.
- 이때 20 mM NaBHKN를 환 원제로 첨가하여 3시간 동안 상온에서 반응시켰다. PEGylation 공정 후 mono-PEGylate와 di-PEGylate를 분리하기 위하여 GPC (Superdex 200 HR 10/30)를 사용하였다. 칼럼 부피는 25 mL이고 시료 부피는 1 mL이었다.
- 5 mL/min으로 일정하게 유지하여 용출하였다. 각 피크에 용출된 용액은 SDS-PAGE (12%)를 이용하여 분석하였다.
- GPC에 의해 분리한 PEGylated lipase의 효소 역가를 측정하여 native lipase의 역가와 비교함으로써 PEGylated lipaseS] 활성을 평가하였다. 또 재접힘된 PEGylated lipase의 역가를 측정함으로써 재접힘 수율을 결정하였다. Lipase의 활성은 Lesuisse 의 방법 (흡광도 측정법)을 사용하였다 (6).
- 1 M sodium phosphate, 1 mM DTT)의 pH를 4Q으로 조절한 후 2 mg/mL의 농도가 되게 lipase 용액을 첨가하여 효소의 풀림을 유도하였다. 여기에 변성 버퍼에 미리 용해한 mPEG-aldehyde 용액을 lipase 대비 PEG의 몰 비율이 50, 75, 100, 150배 되도록 첨가하고, 환원 제로서 50 mM NaBHKN를 사용하여 3시간 동안 상온에서 반응 시켜 PEGylation을 시도하였다. 낮은 pH에서 환원제 존 재 하에서 PEGylation을 수행한 이유는 lipase의 질소 말단기 의 아민기를 우선적으로 수식하기 위한 것이었다(5).
- 3이며 총 7개의 lysine 잔기를 함유하고 있다(4). 이 lipase 용액에는 20~30%의 glycine이 안정제로 첨가되어 있어 투석을 통해 이를 제거하였고, GPC 칼럼 (Superdex 200 HR 10/30, Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden)을 사용하여 기타 불순물을 제거하였다. 활성화 PEG는 평균 분자량이 5 kD인 methoxy polyethylene glycol-aldehyde (mPEG- aldehyde)를 (주) 선바이오사(안양)에서 구입하여 사용하였다.
- PEGylation 된 lipase 의의 재접힘 가능성 및 수율을 살펴보기 위해 다음과 같은 절차의 실험을 수행하였다. 즉, (1) lipase를 PEGylation 시킨 후 각각의 PEGylate들을 GPC로 분리한 후, (2) 이들을 변성제 및 환원제가 함유된 변성 버퍼에 첨가하여 풀림을 유도한 후, (3) 전통적인 희석 방법에 의해 in vitro 재접힘시킨 후, (4) 효소 역가를 측정하여 재접힘 수 율을 분석하였다. 우선 PEGylation을 위하여 0.
대상 데이터
- 본 실험에서 사용된 lipase는 Amano Enzyme Inc.에서 구입 하였다 (제품명: LP "Amano" S, Nagoya, Japan). 이 lipase는 Burkholeria cepacia로부터 유래한 것으로 분자량이 33 kD이 고 등전점이 4.
- 활성화 PEG는 평균 분자량이 5 kD인 methoxy polyethylene glycol-aldehyde (mPEG- aldehyde)를 (주) 선바이오사(안양)에서 구입하여 사용하였다. Sodium phosphate, 변성제로 사용한 urea, 환원제로 사용한 sodium cyanoborohydride (NaBHjCN) 및 dithiothreitol (DTT), 기타 시약은 Sigma사 (St. Louis, USA)에서 시약 급으로 구입하였다.
- 0) 내에서 상온에서 2시간 동안 풀림 시킨 후 rapid dilution 시키는 방법에 의해 재접 힘 시켰다. 재접힘 버퍼로는 0.1 M sodium phosphate 버퍼 (pH 8.0)를 사용하였으며, 희석 배수를 10배로 하여 최종 농도가 100 您/mL이 되게 하였다.
- 이 lipase 용액에는 20~30%의 glycine이 안정제로 첨가되어 있어 투석을 통해 이를 제거하였고, GPC 칼럼 (Superdex 200 HR 10/30, Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden)을 사용하여 기타 불순물을 제거하였다. 활성화 PEG는 평균 분자량이 5 kD인 methoxy polyethylene glycol-aldehyde (mPEG- aldehyde)를 (주) 선바이오사(안양)에서 구입하여 사용하였다. Sodium phosphate, 변성제로 사용한 urea, 환원제로 사용한 sodium cyanoborohydride (NaBHjCN) 및 dithiothreitol (DTT), 기타 시약은 Sigma사 (St.
이론/모형
- 또 재접힘된 PEGylated lipase의 역가를 측정함으로써 재접힘 수율을 결정하였다. Lipase의 활성은 Lesuisse 의 방법 (흡광도 측정법)을 사용하였다 (6). 이때 lipase의 기질로는 p-nitrophenyl palmitate (Sigma, USA)를 사용하였으며 lipase 1 unite p-nitrophenyl palmitate가 분당 1 呻이의 p-nitrophenol로 유리되는 양으로 정의하였다.
- 이때 lipase의 기질로는 p-nitrophenyl palmitate (Sigma, USA)를 사용하였으며 lipase 1 unite p-nitrophenyl palmitate가 분당 1 呻이의 p-nitrophenol로 유리되는 양으로 정의하였다. 재접힘 된 lipase의 활성 측정은 NaOH 적정법을 사용하였으며 이때의 기질로 olive oil (Sigma, USA)를 사용하였다(6). 재 접힘 된 lipase 의의 활성 측정법으로 NaOH 적정법을 사용한 이유는 재 접힘 후 잔존하는 urea가 기질(p-nitrophenyl palmitate)의 흡광도에 영향을 미치기 때문이다.
성능/효과
- Urea가 없는 0.1 M sodium phosphate 버퍼 (pH 8.0)에서 PEGylation시킨 후 각각의 분자량 차이를 이용하여 GPC에 의해 mono-, di-PEGylate 및 미수식된 단량체 lipase를 성공적으로 분리할 수 있었. 다(Fig.
- 또한 mPEGaldehyde로 수식된 mono-PEGylate과 di-PEGylate을 변성제와 환원제를 이용해 unfolding 시킨 후 희석에 의한 재접힘 시 킨 결과, lipase에 공유결합된 PEG 분자는 재접힘 수율에 거의 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다. 따라서 내 포체 단백질을 대상으로 변성된 상태에서 PEGylation 시킨 후 in vitro 재접힘 공정을 통해 PEGylation된 상태의 재생된 단백질을 회수할 수 있는 통합공정의 타당성을 제시하였다.
- 변성제 (urea)와 환원제에 의해 완전히 풀린 상태의 lipase도 PEG에 의해 수식되는 것을 관찰하였다. 또한 mPEGaldehyde로 수식된 mono-PEGylate과 di-PEGylate을 변성제와 환원제를 이용해 unfolding 시킨 후 희석에 의한 재접힘 시 킨 결과, lipase에 공유결합된 PEG 분자는 재접힘 수율에 거의 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다. 따라서 내 포체 단백질을 대상으로 변성된 상태에서 PEGylation 시킨 후 in vitro 재접힘 공정을 통해 PEGylation된 상태의 재생된 단백질을 회수할 수 있는 통합공정의 타당성을 제시하였다.
- 변성 버퍼 상에서 nfEG-aldehyde와 lipase의 접합 반응도 PEG의 몰 비가 증가할수록 PEGylation이 증가하는 것으로 나타났다(Fig. 1). 변성 버퍼의 pH를 4.
- 변성제 (urea)와 환원제에 의해 완전히 풀린 상태의 lipase도 PEG에 의해 수식되는 것을 관찰하였다. 또한 mPEGaldehyde로 수식된 mono-PEGylate과 di-PEGylate을 변성제와 환원제를 이용해 unfolding 시킨 후 희석에 의한 재접힘 시 킨 결과, lipase에 공유결합된 PEG 분자는 재접힘 수율에 거의 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다.
후속연구
- 재조합 대장균에서 내 포체 형태로 과발현되는 단백질의 정제에는 비활성의 내 포체를 재생 (renaturation) 시키는 과정이 필수적이다. 만약 이 재생 과정에 PEGylation 공정을 통합 시켜 PEGylation 된된 형태로 재생된 단백질을 얻을 수 있다면 내포체 재접힘, 재생된 단백질의 분리정제, PEGylation, PEGylation된 변형 단백질의 분리정제로 연결되는 다단계 공정을 단순화시켜 공정 효율 및 성능을 크게 향상시킬 수 있을 것이다.
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