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문제 정의
- 특히 Mgl이 결핍된생쥐에서, 타이로신수산화효소 (Tyrosine hydroxylase, TH) 면역양성 세포들이 중뇌흑색질에서 발견되지 않으므로 Marl이 도파민 신경세포의 발생에 필수적임을 알 수 있다. 본 연구에서는도파민 신경세포의 형질을 유도하는데 있어서 Mgl이 매개하는기작을 연구하기 위해서 레트로 바이러스를 이용하여 을도입한 무한증식 신경간세포를 사용하였다 Nurrl 유전자의 과발현 만으로는 신경간세포에서 도파민 신경세포의 형질을 유도하지는 못하지만, 레티노이드 (retinoid, RQ 와 폴스콜린 (forskolin, FK)을 처리하여 TH와 방향성 L-아미노산 탈카르복시화효소 (aromatic L-amino acid decarboxylase, AADC) mRNA 의발현을 유도하였다. 또한, Nurrl 과발현 신경간세포를 사람 별아교세포와 공동배양 하여 TH 발현량을 많이 증가시켰다.
- 다분화 능력을 가지는 신경간세포를 중뇌 도파민 신경세포로 분화 유도하기위해서는 전사조절인자 Nurrl과 별아교세포로부터의 인자가필요하다는 보고도 있다<12). 이러한 사실들을 바탕으로, 본연구에서는 ASM 이 과발현되는 인간 신경간세포를 만든 후, 이를 도파민 신경세포로 분화유도하기 위하여 레티노산과 폴스콜린처리, 별아교세포 공동배양, SHH과 FGF-8에 의한 효과들을 조사하여 이에 대한 모델을 구성하였다.
제안 방법
- hShh-N을 FGF-8과 조합하여 C4-Nurrl 세포주에 다음과같이 처리하였다. C4-hShh-N 세포주의 배지를 모아서 원심분리후 상층액만 조심스럽게 모아 새 배지와 7 : 3의 비율로섞은 후 C4-N"rl 세포의 배지를 제거하고 앞서 얻어진 혼합액을 이용하여 8일 동안 분화 유도하였다. FGF-8은 50 阐 헤파린 (heparin)은 1%의 농도로 같이 처리하였다.
- 그러나, C4와 A3 두 종류의 신경간세포에서 Nurrl 과발현만으로는 도파민 신경세포로 분화에서 가장 중요한 도파민 생합성에 관여하는 '효소인 TH의 발현이 유도되지 않았다. 도파민신경세포로 분화 유도하기 위해서 Nurrl 과발현 세포주인 C4-N"rl과 A3-Mht1 을 확립한 후, TH 발현과 도파민 신경세포의 분화에 관계하는 여러 요소들을 처리하여 도파민 신경세포의 분화를 유도하였다.
- 앞서 선별된 PA317/pBabe-puro/hcN"T 세포주를 먼저 100 mm 배양접시에 40% 농도로 접종하고, 감염 하루 전 표적 세포주인 사람 신경간세포 C4와 A3를 30% 농도로 100 mm 배양접시에 접종하였다. 이들 세포로의 2차 감염을 위하여 먼저 C4와 A3 세포의 배지를 제거하고 DEAE-덱스트란 (DEAE-dextran)이 25 Ug/ml의 농도로 함유된 배지를 첨가하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 한 시간 동안 배양하였다.
- PCR반응은 94℃- 45 초, 55℃- 45초, 72℃- 45초에서 GAPDH, AADC, DBH는 30 cycles 동안 반응시켰고, TH는 35 cycles 동안 반응시켰다. 1.2% agarose 겔에 전기영동해서 EtBr 염색으로 확인하였다.
- 2%, heparin 1%, bFGF 50 园戒의 농도와 UBC1 이 1% 포함된 DMEM (UBC1/DMEM) 배지로 교환하여 24 시간동안 37℃, 5% CO2 배양기에서 세포를 증식시켰다. 24시간 후 UBC1/DMEM 배지에서 헤파린 (heparin)과 bFGF를 넣지 않고 레티노산과 폴스콜린를 각각 1 硕과 5 UM 농도가 되도록 첨가하였다. RA는 6일 동안 이틀마다 배지를 교환하였고, 이후 8일 동안레티노산을 넣지 않고 2일에 한번씩 배지를 교환하였다.
- C4-N(gl과 A3-Nurrl 인간 신경간세포를 0.25 x 10s cells/ml의 농도로 심은 후, 37℃, 5% CO2 배양기에서 세포가 바닥에 붙을 때까지 10% FBS가 포함된 DMEM에서 배양하였고, PBS로 두번 씻어주고 FBS 대신 insulin 1.2%, heparin 1%, bFGF 50 园戒의 농도와 UBC1 이 1% 포함된 DMEM (UBC1/DMEM) 배지로 교환하여 24 시간동안 37℃, 5% CO2 배양기에서 세포를 증식시켰다. 24시간 후 UBC1/DMEM 배지에서 헤파린 (heparin)과 bFGF를 넣지 않고 레티노산과 폴스콜린를 각각 1 硕과 5 UM 농도가 되도록 첨가하였다.
- C4와 C4-AST을 커버슬립에 0.25 x 105 cells/ml의 농도로 심고 SHH-N과 FGF-8으로 분화를 유도한 뒤 면역세포화학반응 (immunocytochemistry)을 수행하였다. 세포고정화는 4% paraformaldehyde 용액 (0.
- 70℃ 에서 15분 동안 효소반응을 비활성화시킨 후 증류수 180 加를 첨가하고 사용하기 전까지 -20℃ 에 보관하였다. GAPDH의 PCRe 25 凤 부피로 template 5 以 10 * Buffer 2.5 處 50 mM MgC12 0.75 以 10 mM dNTP Mix 0.5 以 forward primer 25 pmole, reverse primer 25 pmole, Taq polymerase (5 U//Z1) 0.25 口1를 첨가하고 반응시켰다. TH, AADC, DBH의 PCRe 50 의 부피로 template 30 pl, 10 x Buffer 5 /A, 50 mM MgC12 1.
- 이들 세포로의 2차 감염을 위하여 먼저 C4와 A3 세포의 배지를 제거하고 DEAE-덱스트란 (DEAE-dextran)이 25 Ug/ml의 농도로 함유된 배지를 첨가하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 한 시간 동안 배양하였다. PA317/pBabe-puro/hcN“rrl 세포주의 배지를 0.22 /zm 필터로 여과 후 배지가 제거된 C4와 A3세포주와 혼합 첨가하였다. 감염 24시간 후에 신선한 배지로 다시 교체하고 48시간 경과 후 퓨로마이신이 5 理/ml 농도로 함유된 배지에 10일 간격으로 2번의 교체작업을 통하여 C4-N勿rl, A3-Nurrl 세포주를 선별하였다.
- TH 및 AADC, DBH 발현에 대한 별아교세포의 영향을 RT-PCR을 이용하여 조사하기 위하여 처음 24시간 동안은 bFGF를 넣어주고 세포 증식을 시켰고, 24시간 후에 사람 별아교세포와 공동배양을 통해서 분화를 유도하였다.
- 25 口1를 첨가하고 반응시켰다. TH, AADC, DBH의 PCRe 50 의 부피로 template 30 pl, 10 x Buffer 5 /A, 50 mM MgC12 1.5 jA, 10 mM dNTP Mix 1 以 forward primer 50 pmole, reverse primer 50 pmole, Taq polymerase (5 U〃d) 1 를 첨가하였다. PCR반응은 94℃- 45 초, 55℃- 45초, 72℃- 45초에서 GAPDH, AADC, DBH는 30 cycles 동안 반응시켰고, TH는 35 cycles 동안 반응시켰다.
- 22 /zm 필터로 여과 후 배지가 제거된 C4와 A3세포주와 혼합 첨가하였다. 감염 24시간 후에 신선한 배지로 다시 교체하고 48시간 경과 후 퓨로마이신이 5 理/ml 농도로 함유된 배지에 10일 간격으로 2번의 교체작업을 통하여 C4-N勿rl, A3-Nurrl 세포주를 선별하였다.
- 또한 도파민 신경세포 발생에 Nurrl 유전자와는 독립적으로 와 Lmxlb 두유 전자가 같이 발생에 관여하는 기작이 필요하다는 보고도 있다. 도파민 신경세포의 분화는 이와 같이 상당히 복잡하며 최종적으로 모식도에 본 연구에서 수행한 실험들과 여러 보고들을 기초로 도파민 신경세포의 분화에서 중요한 TH 유전자 발현에 대한 가상적인 모델 (model)을 도식화 하였다<Fig. 8).
- 레트로 바이 러스 벡터 pBabe-puro는 제한효소 SwB I 으로절단하고, 인간 전장 Nurrl cDNA (hcMwrl)를 포함하는 pBluescript USK(+) 는 XZw I 과 X阮 I 으로 자른 후 Klenow fragment로 둔단 말단 (blunt end)을 만들어 전기영동 후 QIAEX n 젤 추출키트 (Qiagen)로 용출시켜 순수 분리하였다. 최종 의 .
- 25 X 105 cells/ml의 농도로 심었고, 1차 세포 배양한 별아교세포 (rat astrocyte) 는 culture plate insert (Millipore) 에 두배의 농도로 접종 후, 7일 동안 공동배양 하였다. 레티노산과 폴스콜린은 위와 같은 농도로 첨가하였고, 레티노산은 6일 동안, 폴스콜린은 7일 동안 공동배양과 같은 시점에서 첨가하였다.
- 먼저 신경간세포는 신경세포 및 신경교세포로 분화할 수있는 능력을 갖는 미분화된 전구세포이기 때문에 신경세포로의 분화를 확인하기 위하여 신경세포의 표지 (marker)인 Q튜불린에 대한 면역세포화학반응을 수행하였다. C4와 C4-Nurrl 모두 Q튜불린에 면역 양성 반응을 보이고 있고, 이 사실로 Nurrl 과발현의 유무에 관계없이 신경세포로 분화가 이루어짐을 알 수 있다世ig.
- 다시 PBS로 5분간 3번 세척 후 Vectastain Elite ABC kit의 아비딘 (avidin)용액, 바이오틴 (biotin) 용액, PBS를 1:1: 50으로 반응시키기 30분전에 준비하여 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 미 반응물들은 PBS 로 5분간 3번 씻어주고 AEC(AEC stock 25 lA + 0.05 M acetate Buffer (PH 5.0) + 30% H2O2 3 U) 반응을 상온에서 10분 동안 진행 후, 증류수로 조심스럽게 세척하여 슬라이드슬립에 올려 관찰하였다.
- 본 연구에서는 Mwrl을 과발현하는 인간 신경간세포주를확립하여 도파민 신경세포로 분화 유도를 시도하였다. 그러나, C4와 A3 두 종류의 신경간세포에서 Nurrl 과발현만으로는 도파민 신경세포로 분화에서 가장 중요한 도파민 생합성에 관여하는 '효소인 TH의 발현이 유도되지 않았다.
- 또 하나는 대상 유전자를 표적 세포 염색체 안으로의 통합 (integration)이 안정하다는 것이다(13). 본 연구에서는 감염된 A3와 C4 사람 신경간세포를 항생제 퓨로 마이신 (puromycin)으로 선별 (selection)을 하여 Nurrl을과발현하는 A3-M//T1과 C4-Nurrl 세포주를 만들었다.
- 분화를 유도시킨 A3-Nurrl, C4-Nurrl 세포들을 RNAzol™ B (Tel-Test)를 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 전체 RNA를 추출하여 RT-PCR을 수행하였다. 분광기로 정량화한 후 2 陽의 전체 RNA, 1 小의 Oligo-dT (500 建/ml)를 넣고 DEPC 처리된 물로 11 以로 맞춘 후 70℃에서 10분간 방치하였다.
- 최종 의 .세포 내 감염을 위한 재조합 벡터 pBabe-puro/hcNurrle pBabe-puro/SnaB I 단편과 hcNurrl/Xba I, Xho I /Klenow 단편을 접합하여 제작하였다. 이 재조합플라스미드를 lipofectamine™ reagent (GibcoBRL)를 사용하여제조사의 방법에 따라 바이러스벡터 포장세포주 PA317 에 핵산전달감염 (transfection)시켰다.
- 이 재조합플라스미드를 lipofectamine™ reagent (GibcoBRL)를 사용하여제조사의 방법에 따라 바이러스벡터 포장세포주 PA317 에 핵산전달감염 (transfection)시켰다. 세포주에 감염 (transfection) 후 20시간 동안 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양 후 신선한배지로 교체하고 이틀 후에 5 您/ml 의 퓨로마이신 (puromycin)이 함유된 선택배지에 10일동안 2번의 교체를 통해서 양성 세포주만을 선별하였다.
- SHH 은 분비 단백질이므로 C4-hShh-Ne 배양시 배지로 인간 SHH-N을 과다 분비한다. 이 배지를 인간 신경간세포주 배양 시 배지에 첨가하였고, 광학 현미경에서 200배의 배율로 관찰하였다.
- 세포 내 감염을 위한 재조합 벡터 pBabe-puro/hcNurrle pBabe-puro/SnaB I 단편과 hcNurrl/Xba I, Xho I /Klenow 단편을 접합하여 제작하였다. 이 재조합플라스미드를 lipofectamine™ reagent (GibcoBRL)를 사용하여제조사의 방법에 따라 바이러스벡터 포장세포주 PA317 에 핵산전달감염 (transfection)시켰다. 세포주에 감염 (transfection) 후 20시간 동안 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양 후 신선한배지로 교체하고 이틀 후에 5 您/ml 의 퓨로마이신 (puromycin)이 함유된 선택배지에 10일동안 2번의 교체를 통해서 양성 세포주만을 선별하였다.
- 접종하였다. 이들 세포로의 2차 감염을 위하여 먼저 C4와 A3 세포의 배지를 제거하고 DEAE-덱스트란 (DEAE-dextran)이 25 Ug/ml의 농도로 함유된 배지를 첨가하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 한 시간 동안 배양하였다. PA317/pBabe-puro/hcN“rrl 세포주의 배지를 0.
- 이러한 형태학적 관찰을 통하여, Nurrl 과발현 신경간세포주에 SHH과 FGF-8을 처리하면 분화가 일어난다는 것을 알 수 있었다. 이와 같은 분화가 도파민 신경세포로 유도되는지 확인하기 위해서 FGH-8로 8일 동안 처리된인간 shh-N TH와 신경세포에 대한 표지 (marker)인 各튜불린 (Qtubulin)으로 면역세포화학반응을 수행하였다.
- 인간 SHH 아미노 말단 (amino terminal hShh-N)을 과발현하는 세포주를 확보하기 위하여, pcDNA3.1/myc-HisC/hShh-N construct를 제한효소 Not I 과 Ba也HI 처리 후 Klenow fragment로 점착성 말단을 만들고, 레트로 바이러스 벡터 pLPCX는 Hpa I 으로 자르고 hShh-N DNA 단편과 접 합하였다. 이후의 실험방법은 Nurrl 과발현 인간 신경간세포를 만드는 방법과 같은 방법으로 C4 - hShh-N 세포주를 확보하였다.
- RA는 6일 동안 이틀마다 배지를 교환하였고, 이후 8일 동안레티노산을 넣지 않고 2일에 한번씩 배지를 교환하였다. 폴스콜린은 14일 동안 2일에 한번씩 배지에 첨가하였다.
대상 데이터
- QIAEX II 젤 추출키트와 QIAGEN 플라스미드 미디키트는 QIAGEN (Valencia, CA, USA)사 제품이다. LIPOFECTAMINE™ Reagent는 GIbco BRL에서, 퓨로 마이신은 Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA), 0.22 마이크로미터 공극을 지니는 주사기 필터는 Millipore (Billerica, MA, USA) 사에서 구입하였다. 레티노산과 폴스콜린은 Sigma-Aldrich에서 구입하였다.
- 세포배양에 3차원적 환경을 제공하기 위하여 삽입된 Millicell-CM 세포배양판 입체삽입기는 Milli pore 사에서 구입하였다. RNAzol™ B는 Tel-Test (Friendswood, TX, USA)사에서 구입하였고, 역전사 효소와 DNA 증폭효소는 Gibco BRL에서 구입하였다. 타이로신수산화효소 (TH) 항체는 Pel-Freez Biologicals (Rogers, AR, US A)에서, VectaStain Elite ABC 키트는 Vector Laboratories (Burlingame, CA, USA)사에서 구매하였다.
- 타이로신수산화효소 (TH) 항체는 Pel-Freez Biologicals (Rogers, AR, US A)에서, VectaStain Elite ABC 키트는 Vector Laboratories (Burlingame, CA, USA)사에서 구매하였다. 그 밖의 언급되지 않는 시약류는 Sigma-Aldrich사에서 특급시약으로 구매하여 사용하였다.
- 22 마이크로미터 공극을 지니는 주사기 필터는 Millipore (Billerica, MA, USA) 사에서 구입하였다. 레티노산과 폴스콜린은 Sigma-Aldrich에서 구입하였다. 세포배양에 3차원적 환경을 제공하기 위하여 삽입된 Millicell-CM 세포배양판 입체삽입기는 Milli pore 사에서 구입하였다.
- 본 연구에서 수행하고자 하는 Nsrle 발생중인 도파민 신경세포에서 발현되며 중추신경계에서 넓은 발현분포를 보이는 전사조절인자이며 리간드가 아직 밝혀져 있지 않은 핵 수용체이다. RNR-1, HZF-3, NOT 이라고 불리우기도 흐}는 Nwrle NGFI-B와 매우 유사하다.
- 레티노산과 폴스콜린은 Sigma-Aldrich에서 구입하였다. 세포배양에 3차원적 환경을 제공하기 위하여 삽입된 Millicell-CM 세포배양판 입체삽입기는 Milli pore 사에서 구입하였다. RNAzol™ B는 Tel-Test (Friendswood, TX, USA)사에서 구입하였고, 역전사 효소와 DNA 증폭효소는 Gibco BRL에서 구입하였다.
- 제한효소와 그 밖의 반응 효소들은 모두 New England Biolab (Beverly, MA, USA) 제품을 이용하였고, Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), Fetal Bovine Serum (FBS), 젠타마이신은 GIbco BRL (Grand Island, NY, USA) 제품을 이용하였다. QIAEX II 젤 추출키트와 QIAGEN 플라스미드 미디키트는 QIAGEN (Valencia, CA, USA)사 제품이다.
- RNAzol™ B는 Tel-Test (Friendswood, TX, USA)사에서 구입하였고, 역전사 효소와 DNA 증폭효소는 Gibco BRL에서 구입하였다. 타이로신수산화효소 (TH) 항체는 Pel-Freez Biologicals (Rogers, AR, US A)에서, VectaStain Elite ABC 키트는 Vector Laboratories (Burlingame, CA, USA)사에서 구매하였다. 그 밖의 언급되지 않는 시약류는 Sigma-Aldrich사에서 특급시약으로 구매하여 사용하였다.
이론/모형
- 1/myc-HisC/hShh-N construct를 제한효소 Not I 과 Ba也HI 처리 후 Klenow fragment로 점착성 말단을 만들고, 레트로 바이러스 벡터 pLPCX는 Hpa I 으로 자르고 hShh-N DNA 단편과 접 합하였다. 이후의 실험방법은 Nurrl 과발현 인간 신경간세포를 만드는 방법과 같은 방법으로 C4 - hShh-N 세포주를 확보하였다. hShh-N을 FGF-8과 조합하여 C4-Nurrl 세포주에 다음과같이 처리하였다.
성능/효과
- TH 발현정도가 매우 증가하였다. C4-N"tt1 은 bFGF 경우와 별아교세포 공동배양에 레티노산과 폴스콜린을같이 처리한 경우에만 TH 발현 양상을 보였으나, AADC 발현은 C4와 비교하면 별아교세포 공동배양에서는 현저히 줄어들었고 bFGF에서만 발현이 되었다. A3-Nurrl도 C4-Nurrl 에서의 결과처럼 TH 발현정도가 매우 높았고, AADC는 전혀 발현되지 않았다(Fig.
- 7 D, E). AADC 발현은 조사하지 않았지만 TH 유전자의 발현이 되었으므로 C4-Nurrl 은 SHH과 FGF-8을 처리하면 도파민 신경세포로 분화 유도됨을 알 수 있었다. 본 연구에서는 SHH과 FGF-8을 처리한후 TH에 대한 면역세포화학반응만을 수행하였는데, 향후 TH 이외의 효소에 대한 역전사효소-PCR (RT-PCR)을 수행해야할 것으로 사료된다.
- C4와 A3 신경간세포주는 레티노산과 폴스콜린을 처리한 결과처럼 TH 유전자 발현을 유도하지 못하였으나, C4-Wrl 과 A3-Nurrl 신경간세포주는 레티노산과 폴스콜린을 처리한 경우보다 TH 발현정도가 매우 증가하였다. C4-N"tt1 은 bFGF 경우와 별아교세포 공동배양에 레티노산과 폴스콜린을같이 처리한 경우에만 TH 발현 양상을 보였으나, AADC 발현은 C4와 비교하면 별아교세포 공동배양에서는 현저히 줄어들었고 bFGF에서만 발현이 되었다.
- TH 발현에 대한 별아교세포의 영향은 Nurrl 과발현 신경간세포에서 레티노산과 폴스콜린에 비해서 훨씬 높은 것으로나타났으나 AADC의 발현이 완전히 사라져서 도파민 신경세포의 형질을 나타내지는 못하였다.
- 7 A, B). TH 항체로 면역세포화학반응을 수행한 결과 Nurrl을 과발현시키지 않은 C4는 양성 반응을 전혀 보이지 않았으며(Fig. 7 C), C4-Nurrl 세포주는 FGF-8을 처리한 경우와 SHH과 FGF-8을 동시에 처리한 두경우에 양성 반응을 보였다(Fig. 7 D, E). AADC 발현은 조사하지 않았지만 TH 유전자의 발현이 되었으므로 C4-Nurrl 은 SHH과 FGF-8을 처리하면 도파민 신경세포로 분화 유도됨을 알 수 있었다.
- 그 결과 C4-Nwrle TH를 발현하는 신경세포로 분화가 되었다. SHHe 세포막에 존재하는 수용체 복합체 Ptc-Smo의 Pte와 결합을 하고 이 신호를 Smo가 전사조절인자인 Gli에 전해서 유전자의 활성을 조절하는 기작이다.
- 그러나, C4와 A3 두 종류의 신경간세포에서 Nurrl 과발현만으로는 도파민 신경세포로 분화에서 가장 중요한 도파민 생합성에 관여하는 '효소인 TH의 발현이 유도되지 않았다. 도파민신경세포로 분화 유도하기 위해서 Nurrl 과발현 세포주인 C4-N"rl과 A3-Mht1 을 확립한 후, TH 발현과 도파민 신경세포의 분화에 관계하는 여러 요소들을 처리하여 도파민 신경세포의 분화를 유도하였다.
- DBH 유전자의 발현은 어떤 경우에도 나타나지 않았다. 따라서, 도파민 신경세포로 분화 유도는 C4와 A3는 일어나지 않음을 확인할 수 있었으며, Nurrl 과발현된 신경간세포중에서 C4-M〃l에 bFGF를 처리하였을 경우에만 분화가 일어남을 알 수 있었다(Fig. 2).
- 4, 6). 또한 Nurrl 과발현 유무에 관계없이 SHH과 FGF-8을 처리한 세포역시 처리하지 않은 세포보다 많은 수상돌기의 뻗어감이 더많이 관찰된 것으로 보아 SHH과 FGF-8 이 분화에 커다란 역할을 할 것이라는 것을 예상할 수 있다. SHH과 FGF-8을 처리하면 세포들이 군집을 이루면서 일정한 형태를 이루는 경향을 보이고, 그물망 형태를 이루는 세포들도 관찰할 수 있었다(Fig.
- 본 연구에서는도파민 신경세포의 형질을 유도하는데 있어서 Mgl이 매개하는기작을 연구하기 위해서 레트로 바이러스를 이용하여 을도입한 무한증식 신경간세포를 사용하였다 Nurrl 유전자의 과발현 만으로는 신경간세포에서 도파민 신경세포의 형질을 유도하지는 못하지만, 레티노이드 (retinoid, RQ 와 폴스콜린 (forskolin, FK)을 처리하여 TH와 방향성 L-아미노산 탈카르복시화효소 (aromatic L-amino acid decarboxylase, AADC) mRNA 의발현을 유도하였다. 또한, Nurrl 과발현 신경간세포를 사람 별아교세포와 공동배양 하여 TH 발현량을 많이 증가시켰다. 이러한공동배양실험에서, RA와 FK를 처리하면 TH의 발현수준이 더욱더 증가함을 발견하였다.
- 별아교세포 공동배양에 의한 분화 유도의 결과를 보면 Nurrl 과발현 세포주인 C4-Mgl과 A3-ASvl에서만 TH 발현에 있어서는 bFGF, 레티노산, 폴스콜린에 비해 큰 효과가있었다. 공동배양에 사용한 삽입 배양 용기 (culture plate insert)에는 미세 구멍이 있어서 배양접시에서 배양하고 있는세포와 삽입 배양 용기에서 배양되는 별아교세포 사이에 직접적인 접촉을 방지하고 별아교세포가 방출하는 거대 '분자들은 통과할 수 있게 구성되었다.
- 파킨슨병 의 치료를 위해현재까지 알려진 치료법 중의 하나로 L-DOPA를 환자에게투여하는 방법이 있으나 수의운동장애 (dyskinesia) 등의 중대한 부작용을 초래하여 파킨슨병의 근본적인 치료법이될 수 없다. 신경독성물질인 6-히드록시도파민 (6-OHDA, 6-Hydroxydopamine) 이 나 1-메 틸-4-페 닐-1, 2, 3, 6-테트라히 드로피리딘 (MPTP, l-methyl-4-phenyl-l, 2, 3, 6-tetrahydropyridine)을투여하여 얻은 파킨슨병 동물 모델의 뇌에 태아의 중뇌조직을 이식하였을 때 운동실조 증세가 호전되었으며, 흰쥐태아의 뇌 조직이 이식 .후 숙주의 뇌에서 도파민 신경세포로 분화하여 도파민 신경전달 물질을 활발하게 생산하고 있음이 실증되었다(2, 3).
- TH와 AADC가 함께 발현되어서 도파민 .신경세포의 형질을 보이는 경우는 은 폴스콜린, A3-Nurrle 레티노산과 폴스콜린을 처리하였을 경우에 도파민 신경세포의 형질을 나타냄을 알 수 있었다. 그리고, bFGF 도 TH 발현에 효과가 큰 것으로 나타났으나, AADC가 발현되지 않았으므로 레티노산과 폴스콜린과는 다른 기작을 통해작용함을 추측할 수 있다.
- 3-6). 이러한 형태학적 관찰을 통하여, Nurrl 과발현 신경간세포주에 SHH과 FGF-8을 처리하면 분화가 일어난다는 것을 알 수 있었다. 이와 같은 분화가 도파민 신경세포로 유도되는지 확인하기 위해서 FGH-8로 8일 동안 처리된인간 shh-N TH와 신경세포에 대한 표지 (marker)인 各튜불린 (Qtubulin)으로 면역세포화학반응을 수행하였다.
- 즉, Nurrl 유전자가 과발현하고 있는 세포주에서 RA와 FK 을 처리하였을 때 도파민 신경세포의 형질이 나타났으며 이 결과를 통해 Nurrl 유전자가 과발현하고 있는 인간 신경 간세 포주에 레티노산과 폴스콜린을 처리하면 도파민 신경세포로 분화 유도할 수 있음을 알 수 있었다.
후속연구
- TH 유전자도 NRSE 염기서열이 존재하므로 도파민 신경세포로 분화를 유도하기 위해서는 REST의 발현억제가 필수적이라 할 수 있다. 따라서, 분화를 유도하면 REST의 발현 수준이 어떻게 변화하는지 조사해볼 필요가 있을 것이다. 또한 도파민 신경세포 발생에 Nurrl 유전자와는 독립적으로 와 Lmxlb 두유 전자가 같이 발생에 관여하는 기작이 필요하다는 보고도 있다.
- 8). 또한 도파민 신경세포 분화와 관련된 여러 기작들은 아직 이해하지 못한 부분이 많으므로 앞으로 좀더 활발한 연구가 지속 되어야 할 것이다.
- 또한 본 연구에서 얻은 결과를 바탕으로 앞에서 언급한 유도인자들의 다른 조합 뿐만 아니라 도파민 신경세포-분화에중요한 여러 유전자들의 조합이나 발현 조절 등을 통해 도파민 신경세포의 대량 확보 및 동물모델에 이식을 통해 in vivo 에서 분화 유도한 도파민 신경세포의 역할을 조사할 필요가있을 것으로 예상된다.
- AADC 발현은 조사하지 않았지만 TH 유전자의 발현이 되었으므로 C4-Nurrl 은 SHH과 FGF-8을 처리하면 도파민 신경세포로 분화 유도됨을 알 수 있었다. 본 연구에서는 SHH과 FGF-8을 처리한후 TH에 대한 면역세포화학반응만을 수행하였는데, 향후 TH 이외의 효소에 대한 역전사효소-PCR (RT-PCR)을 수행해야할 것으로 사료된다.
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