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문제 정의
- 2001, Monsen and Blouin 2003). 이번 연구에서는 외국에서 도입되어 수 십 년 동안 국내에 서식하는 황소개구리의 유전적 분석을 위한 기초 자료를 제공하기 위해 국내에서 채집한 황소개구리의 mtDNA NDl/tRNA의 염기서열을 분석하고 이를 상호 비교하여 종 내 유전적 유사도를 조사하였다.
- 이번 연구에서는 황소개구리의 개체군 동태에 미치는 유전적 요인을 조사하기 위하여 국내에 서식하는 황소개구리의 유전자 분석을 실시하였다. 황소개구리 출현이 많은 전라남도 5 개 지역에서 지역별로 채집한 개체의 미토콘드리아 NDl/tRNA 유전자 1, 215 bp의 염기 서열을 결정하고 이를 기존에 발표된 황소개구리의 염기서열과 비교, 분석한 결과 모든 개체의 1 개 위치에서 염기 변화가 발견되었다.
제안 방법
- 각각의 PCR 조성은 template DNA 10“L, forward primer와 reverse primer는 각각 1 "L(10 pM 10X Taq PCR Buffer I (with MgCt) 5“L, dNTP mixture (2.5 mM each) 1 “L, Taq DNA polymerase (5 unit ^L"1) 0.5 를 넣고” 멸균된 증류수로 최종부피 50"L을 맞추었다. Thermocyclei를 이용한 PCR 증폭은 94 °C에서 5 mill간 preincubation 한 후, 94°C에서 45 sec간 denaturation하였으며, 50°C에서 45 sec간 primer annealing하였匸土 그 후 DNA extension는 72 °C 에서 45 sec로 하여 총 30 cycles 을 수행하였다.
- , USA)으로 해독하여 분석하였다. ND1/ tRNA large 什agment의 염기서열은 F23과 F24, MB130 primer를 이용하여 분석하였다(Table 2). 염기 서열은 양 방향으로 확인하였고, 2회 이상 반복 실시하여 결정하였다.
- 5 를 넣고” 멸균된 증류수로 최종부피 50"L을 맞추었다. Thermocyclei를 이용한 PCR 증폭은 94 °C에서 5 mill간 preincubation 한 후, 94°C에서 45 sec간 denaturation하였으며, 50°C에서 45 sec간 primer annealing하였匸土 그 후 DNA extension는 72 °C 에서 45 sec로 하여 총 30 cycles 을 수행하였다. 모든 PCR 과정이 끝난 후 agarose gel 전기 영동으로 증폭된 DNA의 크기를 확인하였다.
- 실시하였다. rntDNA NDl/tRNA gene을 PCR로 증폭하여 예상된 1215 bp 크기를 agarose gel 전기영동으로 확인한 후(자료미저】시) 염기 서열 분석에 이용하였다. 기존에 발표된 황소개구리의 염기 서열과 비교하였을 때 조사한 모든 개체들에서 R.
- 이 DNA를 주형으로 PCR을 이용하여 mtDNA에 ND1/ tRNA 如gment를 증폭하였다. 각 각의 primeT는 기존에 발표된 R. catesbeiana mitochondrial gGnome(Rana catesbeiana, NCBI Genbank gi:336962; Nagae 1988; Yoneyama 1987)에 근거하여 제작하였으며 사용한 primer의 염기서열은 Table 2에 표시하였다
- 각 지역당 2개체 이상씩 채집한 황소개구리는 실험에 이용할 때까지 -20笆에 보관하였고 각 DNA sample들은 뒷다리 대퇴부 근육에서 DNeasy Tissue Kit(Qiagen, USA)를 이용하여 분리하였다. 이 DNA를 주형으로 PCR을 이용하여 mtDNA에 ND1/ tRNA 如gment를 증폭하였다.
- Thermocyclei를 이용한 PCR 증폭은 94 °C에서 5 mill간 preincubation 한 후, 94°C에서 45 sec간 denaturation하였으며, 50°C에서 45 sec간 primer annealing하였匸土 그 후 DNA extension는 72 °C 에서 45 sec로 하여 총 30 cycles 을 수행하였다. 모든 PCR 과정이 끝난 후 agarose gel 전기 영동으로 증폭된 DNA의 크기를 확인하였다.
- 수로나 하천의 경우에는 2 m X 2 m 크기의 방형구 10곳을 무작위로 선정한 다음 족대를 이용하여 포획하였다. 서식밀도 조사는 봄과 여름에 걸쳐 2회 실시되었으며, 각 조사 지역마다 성체 방형구 1곳와 올챙이 방형구 10곳을 설치하여 반복 조사하였고 그 결과를 평균치로 환산하여 등급별로 나누었다.
- 서식밀도는 현장 조사 시 정성적으로 확인한 결과와 서식면적, 은신처와 먹이원이 제공되는 서식 환경 등을 고려하여 4등급으로 구분하였으며, 1등급(풍부), 2등급(중간), 3등급(빈약), 4 등급(극히 미비)로 하였다(Table 1). 등급 기준은 국립환경과학원의 제2차 전국 자연 환경 조사에서 사용한 기준을 이용하였다.
- 이 DNA를 주형으로 PCR을 이용하여 mtDNA에 ND1/ tRNA 如gment를 증폭하였다. 각 각의 primeT는 기존에 발표된 R.
- 타 지역에 비해 황소개구리의 출현이 빈번한 것으로 조사된 전라남도 지역에서 채집한 개체를 대상으로 하여 유전자 염기분석을 실시하였다. rntDNA NDl/tRNA gene을 PCR로 증폭하여 예상된 1215 bp 크기를 agarose gel 전기영동으로 확인한 후(자료미저】시) 염기 서열 분석에 이용하였다.
대상 데이터
- 2004년 봄과 여름에 걸쳐 서울, 경기 전라남도에서 황소개구리의 서식밀도를 조사하였다 조사 지역은 서울시 서초구 양재천, 경기도 양평군 양수리와 전라남도 지역에서 광주광역시 오산동 황룡강, 나주시 남평읍 문씨방죽, 고흥군 동강면 침교제, 장흥군 장동면 북동제, 영암군 금정면 아천제 일대를 선택하였다. 서식밀도는 현장 조사 시 정성적으로 확인한 결과와 서식면적, 은신처와 먹이원이 제공되는 서식 환경 등을 고려하여 4등급으로 구분하였으며, 1등급(풍부), 2등급(중간), 3등급(빈약), 4 등급(극히 미비)로 하였다(Table 1).
- 성체의 경우 저수지의 수변 20 mx 20 tn내에 황소개구리가 자주 활동하는 낮 2시에서 4시 사이에 1시간 동안 황소개구리를 포획하여 그 개체 수를 산정하였으며, 올챙이는 저수지의 경우 수변 20 m X 20 m 크기의 방형구를 정한 다음 방형구 내에서 1시간 동안 물위로 부상하는 개체 수를 산정하였다. 수로나 하천의 경우에는 2 m X 2 m 크기의 방형구 10곳을 무작위로 선정한 다음 족대를 이용하여 포획하였다. 서식밀도 조사는 봄과 여름에 걸쳐 2회 실시되었으며, 각 조사 지역마다 성체 방형구 1곳와 올챙이 방형구 10곳을 설치하여 반복 조사하였고 그 결과를 평균치로 환산하여 등급별로 나누었다.
데이터처리
- 모든 sample의 염기 서열은 GenBank에 등록된 황소개구리 염기 서열과 함께 clustalX로 alignment하였다. 지역 개체 군간의 분화를 나타내는 거리 및 형질에 기초한 분지도를 얻기 위하여 MEGA3 software(Kumar et al. 2004)를 이용하여 kimura-2-parameter distance, neighbor-joining (NJ; Saitou and Nei 1987) 및 maximum parsimony(MP) 분석을 실시하였다(Swofford et al. 1996). NJ 및 MP 분석 시 각각 1000번 및 100번의 bootstrap을 실행하였으며 MP 분석 결과에서 GenB球에 등록된 황소개구리의 염기 서열을 외군으로 사용하여 rooted tree를 작성하였다 결과 및 고찰
이론/모형
- PCR를 이용하여 증폭한 mtDNA NDl/tRNA large fragment의 염기 서열은 ABI BigDye terminator 이용한 cycle sequencing 방법(Applied Biosystems Inc., USA)으로 해독하여 분석하였다. ND1/ tRNA large 什agment의 염기서열은 F23과 F24, MB130 primer를 이용하여 분석하였다(Table 2).
- 서식밀도는 현장 조사 시 정성적으로 확인한 결과와 서식면적, 은신처와 먹이원이 제공되는 서식 환경 등을 고려하여 4등급으로 구분하였으며, 1등급(풍부), 2등급(중간), 3등급(빈약), 4 등급(극히 미비)로 하였다(Table 1). 등급 기준은 국립환경과학원의 제2차 전국 자연 환경 조사에서 사용한 기준을 이용하였다. 성체의 경우 저수지의 수변 20 mx 20 tn내에 황소개구리가 자주 활동하는 낮 2시에서 4시 사이에 1시간 동안 황소개구리를 포획하여 그 개체 수를 산정하였으며, 올챙이는 저수지의 경우 수변 20 m X 20 m 크기의 방형구를 정한 다음 방형구 내에서 1시간 동안 물위로 부상하는 개체 수를 산정하였다.
성능/효과
- Kimura-2-parameter distance 분석법에 의하여 국내에 서식하는 황소개구리 각 개체들 간의 genetic distance를 비교하였을 때 장흥 1 및 2, 고흥 2, 영암 1의 4개체는 원산지 황소개구리와 100%, 영암 2를 제외한 나머지의 광주를 비롯한 6개체는 98.7%~99.1%의 유사도를 나타내 종내 유전적 유사도가 매우 높은 것을 알 수 있다. 이는 한국산 개구리의 종내 유사도가 참개구리의 경우 98%, 아무르산 개구리의 경우 97.
- 또한 조사한 개체 일부에서 유전자 염기 서열의 6개 위치에서의 변이가 발견되었으나 이는 l, 215bp에서 극히 일부분이 변화된 것으로 유전적 변이가 일어났다고 판단하기 어렵다. Kimura-2-parameter distance 분석에서 국내 서식 황소개구리는 98.7%~100%의 높은 유사도를 보여 종내 유전적 거리의 차이가 거의 없었으며 유전적으로 유사한 개체들이 cluster를 형성하는 Neighbor-Joining 분석 결과에서 원산지 황소개구리가 국내 서식 황소개구리의 일부와 함께 같은 cluster에 속하므로 원산지와 국내 서식 황소개구리는 유전적 차이가 적은 것을 알 수 있었다. 이러한 결과들로부터 국내에 서식하는 황소개구리는 종내 유전적 유사도가 매우 높으며 국내에 도입된 후 지역 특이적으로 유전적 분화가 거의 일어나지 않은 것을 알 수 있다.
- 1996). NJ 및 MP 분석 시 각각 1000번 및 100번의 bootstrap을 실행하였으며 MP 분석 결과에서 GenB球에 등록된 황소개구리의 염기 서열을 외군으로 사용하여 rooted tree를 작성하였다 결과 및 고찰
- 황소개구리가 관찰되었다. 경기도 양수리와 전남 지역의 광주, 남평, 장흥에서의 황소개구리 서식 밀도는 아주 낮았으며 영암은 중간, 그리고 고흥에서는 풍부한 서식 밀도를 관찰할 수 있었다(Fig. 1, Table 3).
- 것이 확인되었다. 광주 1, 2, 남평 1, 2, 3, 고흥 1의 6개체로 구성된 cluster는 95%, 장흥 1, 2, 고흥 2, 영암 1의 5개체가 속한 cluster는 89%로 높은 bootstrap iteration 결과를 보였다. 원산지 황소개구리가 처음부터 따로 분화되어 있는 것이 아니라 장흥의 개체 등과 동일한 cluster에 속하는 것을 볼 때 계통 분류적으로 매우 가까운 것을 알 수 있다(Fig.
- 기존의 발표된 황소개구리 염기 서열을 외군으로 설정하여 분석한 MP(tnaximum parsimony) 에서 100번의 bootstrap 을 수행한 결과 크게 2가지의 cluster가 형성됨을 볼 수 있다. 광주 1, 2, 남평 1, 2, 3, 고흥 1의 6개체와 영암 2가 하나의 cluster를 이루어 90%의 높은 bootstrap 결과를 보였다. 이와 같이 MP와 NJ 분석 결과 국내에 서식하는 황소개구리는 원산지 집단과 비교하여 유전적으로 매우 가까운 것을 확인하였다.
- 005(자료미제시)와 약간의 차이를 보였으나 이는 유전자 분석과 단백질 전기영동 분석 간의 실험 방법의 차이, 또는 조사 시기의 차이점이 반영된 것으로 볼 수 있으며, 실험 개체의 소규모에 의한 효과일 수도 있다. 그러나 이번 연구로 국내에 서식하는 황소개구리는 원산지 개체와 유전적 유사도가 높으며, 국내에 서식하는 개체 간에도 유전적 다양성은 극히 미비하다는 것을 알 수 있다. 북미지역에서는 수십 km의 지리적 거리마다R cafes脸沏a가 유전적 차이를 나타내는 서식지 개체군을 형성된다는 보고가 있다(Austin et al.
- rntDNA NDl/tRNA gene을 PCR로 증폭하여 예상된 1215 bp 크기를 agarose gel 전기영동으로 확인한 후(자료미저】시) 염기 서열 분석에 이용하였다. 기존에 발표된 황소개구리의 염기 서열과 비교하였을 때 조사한 모든 개체들에서 R. catesbeiana mitochondrial genome의 C2714 가 G로 transition0] 일어난 것으로 확인되었다(Fig 2). 이 중 영암의 한 개체와 고흥의 한 개체는 C27, 4-Xj 변이만이 발견되었으므로 이 서열이 국내도입 개체군의 초기 서 열로 추정된다.
- 3a). 기존의 발표된 황소개구리 염기 서열을 외군으로 설정하여 분석한 MP(tnaximum parsimony) 에서 100번의 bootstrap 을 수행한 결과 크게 2가지의 cluster가 형성됨을 볼 수 있다. 광주 1, 2, 남평 1, 2, 3, 고흥 1의 6개체와 영암 2가 하나의 cluster를 이루어 90%의 높은 bootstrap 결과를 보였다.
- 황소개구리 출현이 많은 전라남도 5 개 지역에서 지역별로 채집한 개체의 미토콘드리아 NDl/tRNA 유전자 1, 215 bp의 염기 서열을 결정하고 이를 기존에 발표된 황소개구리의 염기서열과 비교, 분석한 결과 모든 개체의 1 개 위치에서 염기 변화가 발견되었다. 또한 조사한 개체 일부에서 유전자 염기 서열의 6개 위치에서의 변이가 발견되었으나 이는 l, 215bp에서 극히 일부분이 변화된 것으로 유전적 변이가 일어났다고 판단하기 어렵다. Kimura-2-parameter distance 분석에서 국내 서식 황소개구리는 98.
- 2001). 우리는 이번 연구에서 분류에 보다 유용한 정보를 제공하는 것으로 알려진 protein-coding sequence인 미토콘드리아 ND1(NADH hydrogenase subunit I)과 연이어 위치한 tRNA coding sequence(tRNA Leu, Gin, Met) 1214bp를 비교 분석한 결과 국내에 서식하는 황소개구리 개체간의 유전자 변이가 극히 적은 것을 알 수 있었다. 이는 동종효소 단백질 전기 영동에 의한 국내 서식 황소개구리의종내 유사도 분석과도 비슷한 결과이다.
- catesbeiana mitochondrial genome의 2714, 2899, 2975, 3182, 3242, 3445) 전체 L2kb에서 매우 적은 변이가 일어난 것을 알 수 있다. 이상의 결과는 국내에 서식하는 황소개구리는 원산지의 개체와 비교하여 큰 유전적 변이가 없는 것을 시사한다(Fig 2).
- 광주 1, 2, 남평 1, 2, 3, 고흥 1의 6개체와 영암 2가 하나의 cluster를 이루어 90%의 높은 bootstrap 결과를 보였다. 이와 같이 MP와 NJ 분석 결과 국내에 서식하는 황소개구리는 원산지 집단과 비교하여 유전적으로 매우 가까운 것을 확인하였다. NJ 분석 결과에서 영암 2 개체가 따로 분화한 것으로 보이나 이는 앞서 genetic distance 결과와 같이 인위적인 지역 이동이나 유난히 염기 변이가 심한 변이체가 실험된 것이라는 추정을 뒷받침한다.
- 이번 연구에서는 황소개구리의 개체군 동태에 미치는 유전적 요인을 조사하기 위하여 국내에 서식하는 황소개구리의 유전자 분석을 실시하였다. 황소개구리 출현이 많은 전라남도 5 개 지역에서 지역별로 채집한 개체의 미토콘드리아 NDl/tRNA 유전자 1, 215 bp의 염기 서열을 결정하고 이를 기존에 발표된 황소개구리의 염기서열과 비교, 분석한 결과 모든 개체의 1 개 위치에서 염기 변화가 발견되었다. 또한 조사한 개체 일부에서 유전자 염기 서열의 6개 위치에서의 변이가 발견되었으나 이는 l, 215bp에서 극히 일부분이 변화된 것으로 유전적 변이가 일어났다고 판단하기 어렵다.
후속연구
- 그러나 국내에 서식하는 황소개구리는 외국에서 인위적으로 도입된 소수의 개체가 국내 여러 지역의 자연 생태에 방사되었기 때문에 다양성이 적은 집단의 개체 사이에서 교배가 지속되어 새로운 유전적 차이를 나타내는 서식지 개체군을 형성하기 힘들 것으로 추정된다. 그러나 보다 정확한 결론을 도출하기 위해 서식 집단에 따라 더 많은 개체군의 분석과 현 조사에서 이용되었던 mtDNA와 더불어 nuclear DNA의 염기 서열 분석도 병행되어야 할 것이다 이번 연구에서 확립된 유전자 서열은 향후 유전적 다양성이 외래 도입종의 개체군 동태에 미치는 영향을 분석하는 데 기초 자료로 제공될 수 있을 것이다.
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