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문제 정의
- 계통발생학적으로 Archaea domain에 속하는 모든 미생물이 메탄생성균은 아니나 메탄생성균은 이 domain에 속한다. Arc/zaea에 특이적인 primers를 이용한 PCR 결과는 목에 특이적인 PCR과 mcrA PCR 실험과정에 오류가 없었음을 확인하기 위해서 실시하였다(Fig. 4의 왼쪽 위 사진).
- 그래서 본 연구에서는 실험실 규모의 고온 CSTR을 이용하여 포도당을 기질로 氏를 생산하는 동안 반응기의 미생물을 분석하여 반응기 성능의 이해를 돕고자하였다.
- 반응기내에 균체량이 낮은 단점이 있다. 그래서 본연구에서는 유출된 biomass를 침전조로부터 CSTR로 재도입시킴으로써 반응기 내에 biomass를 유지하고자하였다. 식종후 초기 biomass 농도는 5, 350 mg VSS/L이 었으나 시 간이 감에 따라 점 점 감소하여 13일부터는 1, 450~2, 200 mg VSS/L범 위를 유지하다가 33일 이후는 595-812 mg VSS/L를 유지하였다(Fig.
- 그러 나 반응기를 운전함에 따라 채취한 시료에서는 2~3개의 진하게 염색된 굵은 밴드가 관찰되는 것으로 보아 CSTR의 운전조건 하에 농화 배 양된우점종임을알 수 있었다.본 연구에서 침전조를 이용해 유실된 biomass를 재순환하여 반응기내 biomass를 유지하고자 한 전략이 효과가 없었던 것은, 이렇게 한 개체군의 우세와 더불어 슬러지 침강에 관련된 다른 균의 점차적인 소실 및 수적 약화에 기인한 것으로 여겨진다.
가설 설정
- 조류 (algae)의 성장을 억제하기 위해 반응기는 알루미늄 foil로 싸서 빛을 차단하였다. 반응기 운전 조건을 바꿀 때는 18배 이상의 HRT 동안 한조건하에 반응기를 운전한 후와 가스 농도를 3번 연속 측정하여 같은 값을 나타낼 때를 안정상태로 가정하였다.
제안 방법
- CSTR 의 온도는 반응기의 중앙에 설치된 hypodermic thermocouple probe (Cole-Panner) 와 온도계 (Digi-Sense, Cole-Parmer)로 모니터하였다. 조류 (algae)의 성장을 억제하기 위해 반응기는 알루미늄 foil로 싸서 빛을 차단하였다.
- CSTR는 포도당을 기초로 하는 합성배지(8)를 공급하여 43일간 운전하였다. 반응기 온도와 유입되는 포도당 농도는 55°C와 6.
- 이들은 Methanobacteriales, Methanosarcinales, Methanomicrobiales, 그리고 Methanococcales 목에 각각 해 당한다. Negative controls은 P. putida DNA를 template 로 사용하거나 template DNA를 첨가하지 않은 PCR 반응을 사용하였다. PCR 산물은 agarose gel 전기영동 후 디지털 이미지를 얻었고 필요에 따라 SigmaGel (Jandal Scientific, San Rafael, CA)을 사용하여 DNA band의 강도를 측정하였다
- putida DNA를 template 로 사용하거나 template DNA를 첨가하지 않은 PCR 반응을 사용하였다. PCR 산물은 agarose gel 전기영동 후 디지털 이미지를 얻었고 필요에 따라 SigmaGel (Jandal Scientific, San Rafael, CA)을 사용하여 DNA band의 강도를 측정하였다
- 실시하였다. PCR 산물은 문헌(5)에 기술된 것과 같이 DCode System (Bio-Rad, Hercules, CA)을 사용하여 분리하였다. 주요 DNA bands는 DGGE gels로부터 잘라내어 PCR로 다시 증폭하고, 증폭된 PCR 산물은 정제 kit (Bioneer Co.
- PCR은 16S rRNA 유전자 단편을 증폭하여 Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) 분석에 사용하거나, 메탄생성 균이 가지는 mcrA 유전자를 증폭하는데 사용하였다. 본 연구에 사용한 PCR primers는 Table 1에 나타내었으며 PCR 반응은 문헌(5)에 기술된 것과 같이 실시하였다.
- 본 연구에 사용한 PCR primers는 Table 1에 나타내었으며 PCR 반응은 문헌(5)에 기술된 것과 같이 실시하였다. Primers 357f-GC와 518r을 사용하여 16S rRNA 유전자 단편 (Escherichia coli numbering에 의해 341-534 위치에 해당하는 약 194-bp PCR 산물)을 증폭하였다. PCR 산물은 agarose gel 전기영동을 실시하여 그 크기를 확인한 후에 DGGE에 사용하였다.
- , Daejeon, Korea)으로정제한 후에 nucleotide sequencing을 실시하였다. Ribosomal Database Project II의 CHIMERA CHECK program을 이용하여 chimeric sequences를 가진 nucleotide sequences는 스크린 및배제시켰다. 또한 BLASTN (version 2.
- Ribosomal Database Project II의 CHIMERA CHECK program을 이용하여 chimeric sequences를 가진 nucleotide sequences는 스크린 및배제시켰다. 또한 BLASTN (version 2.2.10)을 이용하여 GenBank database에서 가장 유사한 염기서열을 검색하였다.
- 메탄생성균이 가지는 mcrA 유전자를 증폭하기위해 두 sets의 primers를 사용하였다 메탄생성균을 검출하기 위해 (Table 1); ME1/ME2(14) 그리고 Lf/Lr(15). 유전자 mcrA PCR 에서 positive control 로서는 Methanosarcina barkeri DSM 10131 로부터 추출한 total DNA를 사용하였고, 한편 negative control로는 Pseudomonas putida DNA를 template로 사용하였다.
- 반응기 내의 미생물 군집을 조사하기위해 PCR로 증폭한 16S rRNA 유전자 단편을 사용하여 DGGE를 실시하였다. PCR 산물은 문헌(5)에 기술된 것과 같이 DCode System (Bio-Rad, Hercules, CA)을 사용하여 분리하였다.
- 생산된 biogas의 부피는 wet gas meter (W-NK, Shinagawa, Tokyo, Japan)로 측정하였고, 한편 biogas 내의 H2, CO2, CH4, 그리고 N2 조성은 문헌 (11) 에 기술된 것과 같이 gas chromatograph로 측정하였다. 유출수 내의 다양한 유기산, ethanol, 그리고 포도당의 농도는 high-perfonnance liquid chromatograph (HPLC, 1100 series, Agilent Technologies, Forster, CA)로 측정하였다(11).
- 식종슬러지나 반응기로부터 취한 시료 6mL을 원심 분리하여 biomass를 획득한 후 phosphate-buffered saline (0.13 M NaCl, 10 mM sodium phosphate buffer, pH 7.2)으로 세 척 하고, Soil DNA isolation kit (Mo Bio Labs. Inc., Solana Beach, CA)을 사용하여 제조회사의 지시대로 DNA를 추출하였다. DNA 농도는 Lambda 12 spectrophotometei (Perkin Elmer, Foster city, CA)로 측정하였고, 추출된 DNA는 polymerase 나lain reaction (PCR) 에 사용되 었 다.
- 1); ME1/ME2(14) 그리고 Lf/Lr(15). 유전자 mcrA PCR 에서 positive control 로서는 Methanosarcina barkeri DSM 10131 로부터 추출한 total DNA를 사용하였고, 한편 negative control로는 Pseudomonas putida DNA를 template로 사용하였다. 아울러 template DNA를 첨가하지 않은 PCR 반응도 negative control로 사용하였다.
- 유전자 me以가 PCR 증폭된 시료에 있는 메탄생성 균의 계통발생 학적 위치를 조사하기위해 메탄생성균의 주요 목(order)에 특이적인 PCR primers를 사용하여 16S rRNA 유전자 단편을 증폭하였다(Fig. 4). 전기영동 사진의 디 지 털이 미지를 분석한 결과 식종슬러지에 있는 메탄생성 균들은 주로 MethanosarcinalesS\ Methanomicrobiales 목에 속하였으며(Fig.
- 유전자 術心가 PCR 증폭된 시료에 있는 메탄생성균의 계통발생 학적 위치를 조사하였다. 이 때 메탄생성균의 주 요목 (order)에 특이적인 PCR primers를 사용하여 16S rRNA 유전자 단편을 증폭하였다(16).
- 유전자 mcr4는 메탄형성에서 주요역할을 하는 methyl coenzyme M reductase의 a-subunit을 암호화한다. 유전자에 특이적 인 2 sets의 primers를 사용하여 PCR로 시료 내의 메탄생성균을 분석하였다. 본 연구에 사용된 이 2 sets의 primers는 계통발생학적 적용범위가 다른 것으로 보고 되 었다 (21).
- 측정하였다. 유출수 내의 다양한 유기산, ethanol, 그리고 포도당의 농도는 high-perfonnance liquid chromatograph (HPLC, 1100 series, Agilent Technologies, Forster, CA)로 측정하였다(11). 분석된 유기산은 다음과 같다; succinate, lactate, fonnate, acetate, propionate, n-butyrate, iso-butyrate, n-valerate, iso-valerate, 그리고 n-caproate.
- Meiha冲bacte/iales에 특이적인 109f71401r, Methanos아'cin血s와 Methctnomicmbiales에 특이 적 인 355f/1068r, Methanococcales특이적 인 344f/1202r. 이 때 PCR 에서 positive controls로서는 다음의 균주로부터 추출한 total DNA를 사용하였다 Methanobacterium bryantii DSM 863T, Methanosarcina barkeri DSM 10131, Methanosaeta concilliDSM 3671T, Methanospillium hungatei DSM 864T, 그리고 Methanococcus jannashii DSM 2661T(Table 1). 이들은 Methanobacteriales, Methanosarcinales, Methanomicrobiales, 그리고 Methanococcales 목에 각각 해 당한다.
- PCR 산물은 문헌(5)에 기술된 것과 같이 DCode System (Bio-Rad, Hercules, CA)을 사용하여 분리하였다. 주요 DNA bands는 DGGE gels로부터 잘라내어 PCR로 다시 증폭하고, 증폭된 PCR 산물은 정제 kit (Bioneer Co., Daejeon, Korea)으로정제한 후에 nucleotide sequencing을 실시하였다. Ribosomal Database Project II의 CHIMERA CHECK program을 이용하여 chimeric sequences를 가진 nucleotide sequences는 스크린 및배제시켰다.
대상 데이터
- 본 연구에서는 pH controller가 장착된 실험실 규모의 working volume이 3 L인 5 L(KF-5L, Kobiotech, Korea) CSTR(12)을 사용하였다. 하수처리장에서 공급받은 혐기성 소화 슬러지를 채 (No.
- 사용하였다. 하수처리장에서 공급받은 혐기성 소화 슬러지를 채 (No. 12; 1.70 mm aperture)5. 걸러 큰 입자를 제거하고 열처리 (70°C, 30분)한 후 이 반응기에 식종하였다.
데이터처리
- 분석된 유기산은 다음과 같다; succinate, lactate, fonnate, acetate, propionate, n-butyrate, iso-butyrate, n-valerate, iso-valerate, 그리고 n-caproate. 분석은 각 안정상태에서 3번 이상 실시하여 평균하였다. 유출수 내의 biomass (VSS)는 Standard methods(13)에 따라 측정하였다.
이론/모형
- 분석은 각 안정상태에서 3번 이상 실시하여 평균하였다. 유출수 내의 biomass (VSS)는 Standard methods(13)에 따라 측정하였다.
성능/효과
- 반면에채류시간 (hydraulic retention time, HRT)과 pH는 순차적으로 감소시켰다. HRT를 48 h, 36 h, 그리고 24 h로 순차적 감소를 시킴에 따라 유기물 부하량은 3.43에서 6.86 g glucose/1/d로 증가되었다. 공급된 배지의 pH는 초기에 6.
- PCR 분석을 한 결과 식종슬러지와 반응기 운전 8일과 41일째 취한 시료에서 mcrA 유전자를 증폭할 수 있었으며, 두 sets의 primers는 같은 결과를 나타냈다(Fig. 3). 운전 8 일 째 취한 시료에서 증폭된 mcrA 유전자는 가스분석 결과를 뒷받침하였다: 이 때 분석된 biogas의 45%는 CH, 가 차지하였다.
- 그러나 14일부터는 CH4이 무시할 수준으로 검출되었다. 그래서 본 연구에서 사용한 CSTR 조건이 메탄생성 균의 활성을 억제하는 것으로 나타났다.
- 색 된 가는 DNA band가 여 러 개 나타났다. 그러 나 반응기를 운전함에 따라 채취한 시료에서는 2~3개의 진하게 염색된 굵은 밴드가 관찰되는 것으로 보아 CSTR의 운전조건 하에 농화 배 양된우점종임을알 수 있었다.본 연구에서 침전조를 이용해 유실된 biomass를 재순환하여 반응기내 biomass를 유지하고자 한 전략이 효과가 없었던 것은, 이렇게 한 개체군의 우세와 더불어 슬러지 침강에 관련된 다른 균의 점차적인 소실 및 수적 약화에 기인한 것으로 여겨진다.
- 반응기 운전 8, 21, 그리고 41일째 취한 시료의 주요 bands (Fig. 2의 bands 2, 3, 그리고 6)는 Clostridium cellulosi, Fervidobactrium gondwanens, 그리고 Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum 에 계통발생학적으로 가장 연관되어있는 것으로 나타났다(Table 2). Clostridiim과 Thermoanaerobacterium속은 Clostridia 강 (class) 에 속하나 Fervidobactrium은 Thermotogae 강에 속한다.
- 고온 반응기에서는 C/os"赫a 강 중에서 Thermoanaerobacterium 속 (genus)에 속하는 미생물이 우세한 것으로 보인다(5, 7-9). 본 연구를 통해 T. thermosaccharc烦cum와 계통발생학적으로 관련된 개체군이 고온 CSTR 조건하에서도 상당히 농화 배양되었음을 알 수 있었다. 다양한 탄소원과 반응기 형태를 사용하여 H2 생산을 연구한 전 보고들(5, 7-9)도 T.
- 본 연구에서 식종 슬러지를 열처리하는데 사용한 조건은 메탄생성균을 완전히 제거하는데 불충분하여 운전 초기에 CH, 이 biogas에서 검출되었고(Fig. 1C), 식종 슬러 지와 반응기로부터 취한 시료에서 메탄생성균이 가지는 mcrA 유전자가 PCR로 증폭되었다는 점으로 알 수 있었다(Fig. 3). 유전자 mcr4는 메탄형성에서 주요역할을 하는 methyl coenzyme M reductase의 a-subunit을 암호화한다.
- 식종 후 43일간의 운전 기간 동안에 관찰된 미생물 군집 조성은 동적인 변화를 나타내었다(Fig. 2). 약 14일부터 관찰된 일정한 biogas 조성 (v/v)에도 불구하고(Fig.
- 운전 15일에는 "-butyrate과 acetate의 농도가 같아졌고 그 이후로는 “-butyrate이 CSTR에서 생산된 주요 유기산 중에서 가장 높은 농도를 나타내었다. 운전 32일 경에 lactate와 ethanol의 농도가 일시적으로 증가함에 따라 butyrate의 농도, H2 수율과 생산속도도 감소하였다.
- 3). 운전 8 일 째 취한 시료에서 증폭된 mcrA 유전자는 가스분석 결과를 뒷받침하였다: 이 때 분석된 biogas의 45%는 CH, 가 차지하였다. 비록 반응기 운전 41일째는 CH, 은 검출되지 않았으나, 매우 약하게 염색된 PCR 산물을 나타내었다.
- 1C). 운전 초기에 생산된 biogas의 40% 이상 CH4이 검출됨으로써 본 연구에서 식종 슬러지를 열처리하는데 사용한 조건은 메탄생성 균을 완전히 제거하는데 불충분하다는 것을 알 수 있었다. 그러나 14일부터는 CH4이 무시할 수준으로 검출되었다.
- 4). 전기영동 사진의 디 지 털이 미지를 분석한 결과 식종슬러지에 있는 메탄생성 균들은 주로 MethanosarcinalesS\ Methanomicrobiales 목에 속하였으며(Fig. 4 오른쪽 위 사진), 8일째 검출된 메 탄생 성균들은 주로 Methanobacteriales 목에 해당되는 것으로 나타났다(Fig. 4 왼쪽 아래 사진). Methanobacteriales 목에 속하는 메 탄 생산 균은 전형적 인 hydrogenotrophic methanogens으로서 H?를 기질로 하여 CH, 을 생산한다.
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