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문제 정의
- 12 이 방법은 기존의 방법에 비해 빠른 분석시간과 고감도, 그리고 좋은 재현성을 보여주었다. 또, 유전성대사질환 환자의 TC, FC, AC 3분획을 분석함으로써 확진 검사 및 환자의 모니터링을 하는데 필요함을 보여주었기에 이를 보고하고자 한다.
- 본 연구는 임상학적 진단을 목적으로 electrospray ionization tandem mass spectrometry (ESI/MS/MS)를 사용하여 기존의 방법보다 신속, 정확하게 카르니틴을 정량분석 하였다. ESI/MS/MS를 사용하기위해 필요한 전처리 시간은 기존의 다른 분석방법들 보다 많은 시간을 단축시켰으며, 유도체화과정을 필요하지 않고, 샘플 matrix interference를 줄였다.
제안 방법
- 2)을 해 본 결과 m/z 85를 major production ion 으로 선정하였다. ESI/MS/M는 MRM scan mode를 이용할 경우 특징적인 production ion으로 분류 할 수 있으며, 카르니틴의 경우 m/z 85를 갖는 precursor ion m/z 162를 사용하여 정량분석을 하였다. FC 과 TC의 직선성은 Fig.
- 이후 FAB-MS/MS9, continuous flow FAB-MS10, secondary ion MS11 등 카르니틴 분석을 위해 다양한 기법이 보고되고 있다. 본 연구에서 카르니틴은 혈액여지를 사용하여 컬럼을 사용하지 않고 유도체화 없이 ESI/MS/MS를 이용하여 분석을 하였다. 혈액여지를 이용한 카르니틴 분석법은 샘플의 matrix interference를 줄여준다.
- 80% 메탄올 200 μL로 추출을 한 다음 30분간 흔들어 주고 새로운 96well plate 옮겨 auto- sampler를 이용하여 탠덤질량분석기에 시료를 주입하였다. 분석할 때 autosampler에서 샘플은 2 ºC로 일정하게 보관하면서 분석을 하였다. AC는 TC에서 FC를 뺀 값을 사용하였다.
- 그리고, 각각의 패턴을 비교해 보면 TC, FC, AC의 순으로 값이 높았다. 유전성대사질환 중 3-methylcrotonic aciduria, propionic aciduria, methylmalonic aciduria, isovaleric acidemia의 질환의 양성환자검체를 분석하였다. 3-methylcrotonic aciduria은 leucine metabolism의 중간대사체인 3-methyl- crotonic acid가 3-methylcrotonyl-Co A carboxylase의 결핍으로 축적되어 나타난다.
- 016 μmol/L로 아주 극미량의 농도까지 측정이 가능하였다. 정밀도 실험결과도 낮은 농도, 중간농도, 높은 농도인 3, 30, 50 μmol/L을 withinday-assay는 5회 측정하였고, betweenday-assay는 5일 동안 측정하였다. 낮은 농도인 3 μmol/L는 withinday-assay의 변동계수가 1.
- 카르니틴 분석조건은 이동상으로 80% 메탄올을 사용하였고, 시료의 주입량은 5μL, 이동상의 유속은 200 μL/min, 샘플 loop는 10 μL를 사용하였고, 충돌가스로는 초고순도질소를 사용하였다. 카르니틴 프로파일을 얻기 위해 MRM scan mode로 분석을 하였으며, 표준물질은 162.1/85.1 m/z, 내부표준물질은 165.1/ 85.1 m/z범위로 정량을 하였다.
- 회수율 및 정밀도 실험결과는 Table 1 과 같다. 회수율 농도는 정량농도의 낮은 농도, 중간농도, 높은 농도인 3, 30, 50 μmol/L을 첨가한 뒤 회수율을 구하였다. 3 μmol/L의 회수율은 2.
대상 데이터
- (MA, USA) 에서 구입하였다. HPLC grade인 메탄올, potassium hydroxide는 Merck (Germany)에서 구입하였다. 그리고, hydro chloric acid는 Tedia (OH, USA)에서 구입을 하였다.
- 본 연구에 사용한 L-carnitine은 Sigma-Aldrich (MA, USA)에서 구입하였고, 내부표준물질인 L-carnitine-d3는 Cambridge Isotope Laboratories Ins. (MA, USA) 에서 구입하였다.
- )사의 nylon membrane filter로 여과한 후 10분간 탈기 하여 사용하였다. 본 연구에서 사용한 electrospray ioni zation tandem mass spectrometer로는 Applied Biosystems (MA, USA)사의 API4000모델을 사용하였으며, 이동상을 흘려주기 위해 사용한 펌프로는 Agilent 1100 series binary 마이크로 펌프를 사용하였고, CTC analytics systems (Switzerland) 사에서 나온 HTS PAL auto sampler를 사용하였다. 시료 전처리 과정을 위해 TAITEC (Tokyo, Japan)사의 incubator/ shaker를 사용하였다.
- 본 연구에서 사용한 electrospray ioni zation tandem mass spectrometer로는 Applied Biosystems (MA, USA)사의 API4000모델을 사용하였으며, 이동상을 흘려주기 위해 사용한 펌프로는 Agilent 1100 series binary 마이크로 펌프를 사용하였고, CTC analytics systems (Switzerland) 사에서 나온 HTS PAL auto sampler를 사용하였다. 시료 전처리 과정을 위해 TAITEC (Tokyo, Japan)사의 incubator/ shaker를 사용하였다.
- 그리고, hydro chloric acid는 Tedia (OH, USA)에서 구입을 하였다. 이 실험에서 사용된 초순수는 Millipore-Milli QTM (Tokyo, Japan)에서 구입을 하여 사용하였으며, 이동상인 메탄올과 초순수는 0.2 μm의 Whatman (Maidstone, U.K.)사의 nylon membrane filter로 여과한 후 10분간 탈기 하여 사용하였다. 본 연구에서 사용한 electrospray ioni zation tandem mass spectrometer로는 Applied Biosystems (MA, USA)사의 API4000모델을 사용하였으며, 이동상을 흘려주기 위해 사용한 펌프로는 Agilent 1100 series binary 마이크로 펌프를 사용하였고, CTC analytics systems (Switzerland) 사에서 나온 HTS PAL auto sampler를 사용하였다.
- 딸이온 m/z 103은 모이온에서 trimethylamino기가 떨어진 것으로 사료되며, 딸이온 m/z 85는 추가적으로 hydroxy기가 떨어진 것으로 사료된다. 최적의 딸이온은 third quadrupole production ion scan (Fig. 2)을 해 본 결과 m/z 85를 major production ion 으로 선정하였다. ESI/MS/M는 MRM scan mode를 이용할 경우 특징적인 production ion으로 분류 할 수 있으며, 카르니틴의 경우 m/z 85를 갖는 precursor ion m/z 162를 사용하여 정량분석을 하였다.
- AC는 TC에서 FC를 뺀 값을 사용하였다. 카르니틴 분석조건은 이동상으로 80% 메탄올을 사용하였고, 시료의 주입량은 5μL, 이동상의 유속은 200 μL/min, 샘플 loop는 10 μL를 사용하였고, 충돌가스로는 초고순도질소를 사용하였다. 카르니틴 프로파일을 얻기 위해 MRM scan mode로 분석을 하였으며, 표준물질은 162.
성능/효과
- 혈액여지를 이용한 카르니틴 분석법은 샘플의 matrix interference를 줄여준다.12 이 방법은 기존의 방법에 비해 빠른 분석시간과 고감도, 그리고 좋은 재현성을 보여주었다. 또, 유전성대사질환 환자의 TC, FC, AC 3분획을 분석함으로써 확진 검사 및 환자의 모니터링을 하는데 필요함을 보여주었기에 이를 보고하고자 한다.
- 3-methylcrotonic aciduria환자는 FC가11.9 μmol/L로 정상범위보다 낮았으며, 각각의 패턴을 비교해 보면 TC, AC, FC순으로 값이 높았다. Propionic aciduria는 valine, isoleucine, methionine 같은 아미노산 대사에 관여하는 propionyl-Co A carboxylase 효소 결핍으로 propionic acid, metylcitric acid, tiglyglycine이 증가하는 대표적인 ketotic hyperglycinemia 질환의 하나이다.
- 2와 같다. 5개 point의 농도의 직선성은 FC의 상관계수 (r2)는 0.9993, 회귀식은 Y = 0.668X + 0.021 이고, TC의 상관계수 (r2)는 0.9995, 회귀식은 Y=0.625X + 0.014로 아주 좋은 상관관계를 보였다. 회수율 및 정밀도 실험결과는 Table 1 과 같다.
- 본 연구는 임상학적 진단을 목적으로 electrospray ionization tandem mass spectrometry (ESI/MS/MS)를 사용하여 기존의 방법보다 신속, 정확하게 카르니틴을 정량분석 하였다. ESI/MS/MS를 사용하기위해 필요한 전처리 시간은 기존의 다른 분석방법들 보다 많은 시간을 단축시켰으며, 유도체화과정을 필요하지 않고, 샘플 matrix interference를 줄였다. 카르니틴은 MRM scan mode에서 분석했으며, 좋은 회수율과 직선성, 재현성을 보여 ESI/MS/MS를 사용하여 카르니틴 분석에 유용함을 보여 주었다.
- 2 μmolL 로 최저값에 가까웠다. 각각의 패턴을 비교해보면 1번환자와 같이 TC, AC, FC 순으로 값이 높았다. Methylmalonic aciduria는 methylmalonyl-Co A로부터 만들어진 methylmalonic acid와 propionyl-Co A로부터 만들어지는 3-hydroxypropionic acid와 methylcitric acid가 현저하게 증가하는 질환이다.
- 4 μmol/L로 모두 정상범위안에 들어왔다. 그리고, 각각의 패턴을 비교해 보면 TC, FC, AC의 순으로 값이 높았다. 유전성대사질환 중 3-methylcrotonic aciduria, propionic aciduria, methylmalonic aciduria, isovaleric acidemia의 질환의 양성환자검체를 분석하였다.
- 8%로 낮은 농도 보다 betweenday-assay 값이 다소 높았다. 높은 농도인 50 μmol/L는 withinday-assay의 변동계수는 2.8%, between- day-assay의 변동계수 값은 7.8%로 낮은 농도 보다 betweenday-assay 값이 다소 높았다. 그렇지만, 전체 농도에서 10%미만으로 안정적이고 재현성이 좋음을 보여주었다.
- 이 환자 2명은 모든 값이 정상범위에 들었고, 패턴도 정상인과 똑같은 TC, FC, AC 순으로 높았다. 따라서, follow up환자들은 카르니틴 치료로 인해 정상인과 같은 패턴을 보였으며, 유전성대사질환 환자들은 AC가 FC보다 높은 비정상적인 패턴임을 알 수 있었다. 따라서, 카르니틴 3분획검사는 만성 카르니틴 결핍증 외에 유전성대사질환 환자의 확진검사와 follow up환자의 모니터링에 유용함을 보여주었다.
- 5 μmol/L 회수되어 97%의 회수율을 보였다. 따라서, 전체 농도범위에서 회수율이 안정되었음을 보여주었다. 카르니틴의 limit of detection(LOD) 는 0.
- 따라서, follow up환자들은 카르니틴 치료로 인해 정상인과 같은 패턴을 보였으며, 유전성대사질환 환자들은 AC가 FC보다 높은 비정상적인 패턴임을 알 수 있었다. 따라서, 카르니틴 3분획검사는 만성 카르니틴 결핍증 외에 유전성대사질환 환자의 확진검사와 follow up환자의 모니터링에 유용함을 보여주었다.
- 카르니틴은 MRM scan mode에서 분석했으며, 좋은 회수율과 직선성, 재현성을 보여 ESI/MS/MS를 사용하여 카르니틴 분석에 유용함을 보여 주었다. 또, 유전성대사질환 환자의 FC, TC, AC의 3분획 검사는 확진 검사 및 follow up 모니터링에 유용함을 보여 주었다.
- 13 이 환자도 이미 확진이 되어 follow up 되는 환자로서 카르니틴을 투여 하고 있었다. 이 환자 2명은 모든 값이 정상범위에 들었고, 패턴도 정상인과 똑같은 TC, FC, AC 순으로 높았다. 따라서, follow up환자들은 카르니틴 치료로 인해 정상인과 같은 패턴을 보였으며, 유전성대사질환 환자들은 AC가 FC보다 높은 비정상적인 패턴임을 알 수 있었다.
- 13 Methylmalonic aciduria환자는 이미 확진이 되어 follow up 되는 환자로서 유전성대사질환 치료로 카르니틴을 투여하고 있었다. 이 환자는 TC가 181 umol/L, FC는 101 umol/L, AC는 80 umol/L로 모두 정상범위보다 2~3배 높았다. 각각 의 패턴을 비교해 보면 TC, FC, AC 순으로 값이 높았다.
- 1%로 보였다. 중간 농도인 30 μmol/L는 withinday-assay의 변동계수가 2.2%, betweenday-assay의 변동계수는 7.8%로 낮은 농도 보다 betweenday-assay 값이 다소 높았다. 높은 농도인 50 μmol/L는 withinday-assay의 변동계수는 2.
- ESI/MS/MS를 사용하기위해 필요한 전처리 시간은 기존의 다른 분석방법들 보다 많은 시간을 단축시켰으며, 유도체화과정을 필요하지 않고, 샘플 matrix interference를 줄였다. 카르니틴은 MRM scan mode에서 분석했으며, 좋은 회수율과 직선성, 재현성을 보여 ESI/MS/MS를 사용하여 카르니틴 분석에 유용함을 보여 주었다. 또, 유전성대사질환 환자의 FC, TC, AC의 3분획 검사는 확진 검사 및 follow up 모니터링에 유용함을 보여 주었다.
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