본 연구에서는 ESI-MS/MS를 이용해 혈액내에서 아실카르니틴과 아미노산을 신속하게 정량분석하는 방법을 개발하였다. 아실카르니틴과 아미노산은 3N butanolic hydrogen chloride를 사용하여 유도체화 과정을 거친 뒤 이중질량분석기로 분석하였다. 아실카르니틴은 precursor 85 ion scan을 사용하여 분석하였고, 아미노산들중 알라닌, 발린, 루신/이소루신, 메티오닌, 페닐알라닌, 타이로신, 아스파르트산, 글루탐산 등은 neutral loss 102 scan, 오르니틴과 시트롤린은 neutral loss 119 scan, 글리신은 neutral loss 56 scan, 아르기닌은 neutral loss 161 scan 그리고 아르기니노석시닉산은 product ion 459 scan을 사용하여 분석하였다. 이 방법은 일반적인 액체 크로마토그래피나 아미노산 분석기에 비해서 시료의 전처리가 비교적 간단하며, 높은 감도와 좋은 재현성을 보여주었다.
본 연구에서는 ESI-MS/MS를 이용해 혈액내에서 아실카르니틴과 아미노산을 신속하게 정량분석하는 방법을 개발하였다. 아실카르니틴과 아미노산은 3N butanolic hydrogen chloride를 사용하여 유도체화 과정을 거친 뒤 이중질량분석기로 분석하였다. 아실카르니틴은 precursor 85 ion scan을 사용하여 분석하였고, 아미노산들중 알라닌, 발린, 루신/이소루신, 메티오닌, 페닐알라닌, 타이로신, 아스파르트산, 글루탐산 등은 neutral loss 102 scan, 오르니틴과 시트롤린은 neutral loss 119 scan, 글리신은 neutral loss 56 scan, 아르기닌은 neutral loss 161 scan 그리고 아르기니노석시닉산은 product ion 459 scan을 사용하여 분석하였다. 이 방법은 일반적인 액체 크로마토그래피나 아미노산 분석기에 비해서 시료의 전처리가 비교적 간단하며, 높은 감도와 좋은 재현성을 보여주었다.
In this study, a new quantitative analytical method has been developed for the rapid determination of acylcarnitines and amino acids in human blood using electrospray ionization / tandem mass spectrometry (ESI-MS/MS). Acylarmitines and amino acids were analyzed by tandem mass spectrometry after conv...
In this study, a new quantitative analytical method has been developed for the rapid determination of acylcarnitines and amino acids in human blood using electrospray ionization / tandem mass spectrometry (ESI-MS/MS). Acylarmitines and amino acids were analyzed by tandem mass spectrometry after conversion to their butylesters through treatment with 3N butanolic hydrogen chloride. Acylcrnitines were analyzed using precursor 85 ion scan and alanine, valine, leucine/isoleucine, methionine, phenylalanine, tyrosine, aspartic acid and glutamic acid were analyzed using neutral loss 102 scan, ornitine and citrulline were analyzed neutral loss 119 scan, glycine was analyzed using neutral loss 56 scan, arginine was analyzed using neutral loss 161 scan and argininosuccinic acid was analyzed product ion 459 scan. This method reduced sample preparation time compared to that with conventional amino acid analyzer and liquid chromatography, with high sensitivity and good reproducibility.
In this study, a new quantitative analytical method has been developed for the rapid determination of acylcarnitines and amino acids in human blood using electrospray ionization / tandem mass spectrometry (ESI-MS/MS). Acylarmitines and amino acids were analyzed by tandem mass spectrometry after conversion to their butylesters through treatment with 3N butanolic hydrogen chloride. Acylcrnitines were analyzed using precursor 85 ion scan and alanine, valine, leucine/isoleucine, methionine, phenylalanine, tyrosine, aspartic acid and glutamic acid were analyzed using neutral loss 102 scan, ornitine and citrulline were analyzed neutral loss 119 scan, glycine was analyzed using neutral loss 56 scan, arginine was analyzed using neutral loss 161 scan and argininosuccinic acid was analyzed product ion 459 scan. This method reduced sample preparation time compared to that with conventional amino acid analyzer and liquid chromatography, with high sensitivity and good reproducibility.
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문제 정의
본 연구에서는 유기산, 지방산, 아미노산 대사 이상 질환을 진단하고자 하는 목적으로, 이들을 진단할 수 있는 지표가 되는 아실 카르니틴과 아미노산을 ESI-MS/MS로 위와 같은 여러가지 scan 방법을 사용하여 정량 분석하였다. 이 방법은 기존의 방법에 비해 빠른 분석 시간과 고감도, 그리고 좋은 재현성을 보여주었기에 이를 보고하고자 한다.
본 연구에서는 임상학적 진단을 위한 목적으로 electrospray ionization tandem mass spectrometry (ESI-MS/MS)를 사용하여 기존의 방법보다 신속, 정확하게 아실 카르니틴과 아미노산을 정량 분석하였다. ESI-MS/MS를 사용하기 위해 필요한 전처리 시간은 기존의 다른 분석 방법들 보다 많은 시간을 단축시켰을 뿐만 아니라, 시료를 분석하는 시간 또한 상당히 많이 단축시켰다.
본 연구에서는 유기산, 지방산, 아미노산 대사 이상 질환을 진단하고자 하는 목적으로, 이들을 진단할 수 있는 지표가 되는 아실 카르니틴과 아미노산을 ESI-MS/MS로 위와 같은 여러가지 scan 방법을 사용하여 정량 분석하였다. 이 방법은 기존의 방법에 비해 빠른 분석 시간과 고감도, 그리고 좋은 재현성을 보여주었기에 이를 보고하고자 한다.
제안 방법
2) precursor scan을 사용하여 분석하였다. Neutral loss scan을 이용할 경우, 이과Q3가 항상 일정한 질량차를 가지는 화합물군을 확인 분류할 수 있으며, 아미노산 분석의 경우 m/z 56, 102(fig. 2), 119, 161을 갖는 neutral loss scan을 사용하여 분석하였다. 그리고 아르기니노석시닉산의 경우 product ion scan을 사용하여 분석하였다.
2), 119, 161을 갖는 neutral loss scan을 사용하여 분석하였다. 그리고 아르기니노석시닉산의 경우 product ion scan을 사용하여 분석하였다.
다음으로 아미노산들 중 알라닌, 발린, 루신/이 소루신, 메티오닌, 페닐알라닌, 타이로신, 아스파르트산, 글루탐산 분석(neutral loss 1G2 scan) 의 최적 MS/MS 조건은 declustering potential(DP) 이 25.0 V, focusing potential(FP)이 391.0 V, entrance potential(EP)이 -8.0 V, collision cell entrance potoitial(CEP) 이 12 V, collision energy(CE)가 21 V, collision cell exit potential(CXP) 은 5 V이고 DF, CEM, CAD, CUR NG, AG, ISV, Temp 등은 앞과 동일한 값을 사용하였다. 다음의 Fig.
이를 위해서 아실카르니틴과 아미노산에 대해 검출 한계 및 정량을 위한 선형 범위를 구하였고 검량선을 이용한 정량법과 비교하였다. 또한 정상인 100명의 시료에 대해 모두 선형범위 안에 들어가는지 확인하였다(Table 1).
아실 카르니틴 프로파일을 얻기 위해서 m/z 250-550의 범위에서 precursor ion 85 scan을 하도록 설정하였고, 아미노산 프로파일을 얻기 위해서 m/z 120-300의 범위에서 neutral loss 102 scan, m/z 120-300의 범위에서 neutral loss 119 scan, m/z 90-180의 범위에서 neutral loss 56 scan, m/z 190-280의 범위에서 neutral loss 161 scan 그리고 혈액 내에서 아르기니노석시닉산이 나오는지 알아보기 위해 product 459 g을 하였다. 또한 회수율 및 재현성 실험을 위해 아세틸카르니틴, 페닐알라닌, 시트룰린에 대해서 실험하였다 '
마지막으로 페닐 알라닌과 시트룰린을 사용하여 회수율 및 재현성 실험을 하였다. 회수율 실험은 농도를 알고 있는 EDTA 혈액에 진한농도(3000µM)의 페닐라닌과 시트룰린을 소량spike하여 전체 spike한 농도가 200 µM, 800 µM이 되게 하고 난 뒤 spike를 하지 않은 EDTA 혈액의 농도를 빼주어서 계산하였다.
이동상으로는 80 % 아세토니 트릴을 사용하였고, 시료의 주입량은 2 #L, 이동상의 유속은 50이동상의 유속은 L/min, 중돌가스로는 고순도 질소률 사용하였다. 아실 카르니틴 프로파일을 얻기 위해서 m/z 250-550의 범위에서 precursor ion 85 scan을 하도록 설정하였고, 아미노산 프로파일을 얻기 위해서 m/z 120-300의 범위에서 neutral loss 102 scan, m/z 120-300의 범위에서 neutral loss 119 scan, m/z 90-180의 범위에서 neutral loss 56 scan, m/z 190-280의 범위에서 neutral loss 161 scan 그리고 혈액 내에서 아르기니노석시닉산이 나오는지 알아보기 위해 product 459 g을 하였다. 또한 회수율 및 재현성 실험을 위해 아세틸카르니틴, 페닐알라닌, 시트룰린에 대해서 실험하였다 '
여기에 내부 표준물질의 농도를 곱하고 여기에 시료/내부 표준물질의 Intensity를 곱하면 시료의 농도가 계산된다 그러나 이식(1)을 사용하기 위해서는 시료 및 내부 표준물질이 정량을 위한 선형범위(linear range) 안에 들어가야 한다. 이를 위해서 아실카르니틴과 아미노산에 대해 검출 한계 및 정량을 위한 선형 범위를 구하였고 검량선을 이용한 정량법과 비교하였다. 또한 정상인 100명의 시료에 대해 모두 선형범위 안에 들어가는지 확인하였다(Table 1).
텐뎀 질량분석기(MS/MS)에서 선구이온(precursor ion) scan을 이용할 경우, 특징적인 딸이온으로 분열되는 모든 어미 이온들의 스펙트럼을 얻을 수 있으므로 혼합물중 같은 딸이온을 내는 화합물군을 분류할 수 있으며, 아실카르니틴 분석의 경우 띠z 85를 갖는 (Fig. 2) precursor scan을 사용하여 분석하였다. Neutral loss scan을 이용할 경우, 이과Q3가 항상 일정한 질량차를 가지는 화합물군을 확인 분류할 수 있으며, 아미노산 분석의 경우 m/z 56, 102(fig.
마지막으로 페닐 알라닌과 시트룰린을 사용하여 회수율 및 재현성 실험을 하였다. 회수율 실험은 농도를 알고 있는 EDTA 혈액에 진한농도(3000µM)의 페닐라닌과 시트룰린을 소량spike하여 전체 spike한 농도가 200 µM, 800 µM이 되게 하고 난 뒤 spike를 하지 않은 EDTA 혈액의 농도를 빼주어서 계산하였다. 그리고 재현성은 회수율 측정 실험을 12회 하여 얻은 값을 상대 표준편차(RSD)로 나타내었다.
대상 데이터
그리고 본 연구에서 사용한 electrospray ionization tandem mass spectrometer로는 Wallac사(Wallac Perkin- Elmer, USA)에서 나온 API 2000 모델을 사용하였으며, 이동상을 흘려주기 위해 사용한 펌프로는 PerkinElmer 에서 나온 series 200마이크로펌프를 사용하였다. 그리고 시료를 텐뎀 질량분석기(MS/MS)에 주입하기 위하여 PerkinElmer series 200 autosampler를 사용하였으며, 부틸에스테르화 과정을 위해 wallac사의 incubator/ shaker를 사용하였다.
그리고 본 연구에서 사용한 electrospray ionization tandem mass spectrometer로는 Wallac사(Wallac Perkin- Elmer, USA)에서 나온 API 2000 모델을 사용하였으며, 이동상을 흘려주기 위해 사용한 펌프로는 PerkinElmer 에서 나온 series 200마이크로펌프를 사용하였다. 그리고 시료를 텐뎀 질량분석기(MS/MS)에 주입하기 위하여 PerkinElmer series 200 autosampler를 사용하였으며, 부틸에스테르화 과정을 위해 wallac사의 incubator/ shaker를 사용하였다. 본 연구에서 사용한 전체적인 시스템은 Fig.
부틸에스테르화를 위해 사용한 3N butanolic hydrogen chloride는 REGIS사(IL, USA)로부터 구입하였다. 그리고 아세토니 트릴, 물, 메탄올 등의 용매는 Fisher scientific으로부터 구입하여 사용하였다.
(MA, USA)로부터 구입하였다. 부틸에스테르화를 위해 사용한 3N butanolic hydrogen chloride는 REGIS사(IL, USA)로부터 구입하였다. 그리고 아세토니 트릴, 물, 메탄올 등의 용매는 Fisher scientific으로부터 구입하여 사용하였다.
를 이용하여 텐뎀 질량분석기에 시료를 주입하였다. 이동상으로는 80 % 아세토니 트릴을 사용하였고, 시료의 주입량은 2 #L, 이동상의 유속은 50이동상의 유속은 L/min, 중돌가스로는 고순도 질소률 사용하였다. 아실 카르니틴 프로파일을 얻기 위해서 m/z 250-550의 범위에서 precursor ion 85 scan을 하도록 설정하였고, 아미노산 프로파일을 얻기 위해서 m/z 120-300의 범위에서 neutral loss 102 scan, m/z 120-300의 범위에서 neutral loss 119 scan, m/z 90-180의 범위에서 neutral loss 56 scan, m/z 190-280의 범위에서 neutral loss 161 scan 그리고 혈액 내에서 아르기니노석시닉산이 나오는지 알아보기 위해 product 459 g을 하였다.
데이터처리
회수율 실험은 농도를 알고 있는 EDTA 혈액에 진한농도(3000µM)의 페닐라닌과 시트룰린을 소량spike하여 전체 spike한 농도가 200 µM, 800 µM이 되게 하고 난 뒤 spike를 하지 않은 EDTA 혈액의 농도를 빼주어서 계산하였다. 그리고 재현성은 회수율 측정 실험을 12회 하여 얻은 값을 상대 표준편차(RSD)로 나타내었다. 다음의 Table 2는 이에 대한 결과를 나타낸 것이다
성능/효과
본 연구 결과에서 아실카르니틴은 precursor ion 85 scan에서 선택적으로 검출할 수 있었다. 그리고 아미노산들 중 알라닌, 발린, 루신/이 소루신, 메티오닌, 페닐 알라닌, 타이로신, 아스파르트산, 글루탐산 등은 neutral loss 102 scan을 사용하여 검출할 수 있었으며, 오르니틴과 시트룰린은 neutral loss 119 scan, 글리신은 neutral loss 56 scan, 아르기닌은 neutral loss 161 scan 그리고 아르기니 노석시닉산은 product ion 459 scan을 사용하여 선택적으로 다른 간섭 없이 검출할 수 있었다. 앞으로 이 방법은 유기산, 지방산 아미노산대사이상질환을 선별검사할 수 있는 방법이 되리라 기대된다.
마지막으로 아르기니노석 신산 분석(product ion 459 scan을)의 최적 MS/MS 조건은 declustering potential (DP)이 81.0 V, focusing potential(FP) 이 350.0 V, entrance potential(EP) 이 -9.5 V, collision cell entrance potemial(CEP)이 18 V, collision energy(CE)7)- 73 V, collision cell exit potential(CXP)0] 8 V이다. 일반적으로 정상인의 혈액으로부터는 아르기니 노석시닉산은 나오지 않는다.
ESI-MS/MS를 사용하기 위해 필요한 전처리 시간은 기존의 다른 분석 방법들 보다 많은 시간을 단축시켰을 뿐만 아니라, 시료를 분석하는 시간 또한 상당히 많이 단축시켰다. 본 연구 결과에서 아실카르니틴은 precursor ion 85 scan에서 선택적으로 검출할 수 있었다. 그리고 아미노산들 중 알라닌, 발린, 루신/이 소루신, 메티오닌, 페닐 알라닌, 타이로신, 아스파르트산, 글루탐산 등은 neutral loss 102 scan을 사용하여 검출할 수 있었으며, 오르니틴과 시트룰린은 neutral loss 119 scan, 글리신은 neutral loss 56 scan, 아르기닌은 neutral loss 161 scan 그리고 아르기니 노석시닉산은 product ion 459 scan을 사용하여 선택적으로 다른 간섭 없이 검출할 수 있었다.
본 연구에서 아실카르니틴 및 아미노산의 부틸에스테르는(Fig. 1) 이미 양전하를 가지고 있으므로 이동상에 따로 검출이 용이하도록 소량의 초산이나 trifluoroacetic acid 등과 같은 첨가제를 넣지 않아도 positive ESI-MS/MS 분석에 적합하다.
한편 페닐 알라닌과 시트룰린을 가지고, 검량선을 이용한 정량과 위의식(1)을 사용하여 얻은 정량값을 비교한 결과 오차가 5% 미만으로 거의 비슷함을 알 수 있었다. 즉 이것은 정량을 위한 선형 범위 안에서는 농도가 2배 증가하면 시료의 intensity도 거의 비례적으로 2배 증가함을 나타내는 것이다.
후속연구
그리고 아미노산들 중 알라닌, 발린, 루신/이 소루신, 메티오닌, 페닐 알라닌, 타이로신, 아스파르트산, 글루탐산 등은 neutral loss 102 scan을 사용하여 검출할 수 있었으며, 오르니틴과 시트룰린은 neutral loss 119 scan, 글리신은 neutral loss 56 scan, 아르기닌은 neutral loss 161 scan 그리고 아르기니 노석시닉산은 product ion 459 scan을 사용하여 선택적으로 다른 간섭 없이 검출할 수 있었다. 앞으로 이 방법은 유기산, 지방산 아미노산대사이상질환을 선별검사할 수 있는 방법이 되리라 기대된다.
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