유아의 분변에서 분리한 Lactobacillus gasseri KACC 91155의 Jurkat T Cells에서 항산화 효과 The Antioxidant Effect of Lactobacillus gasseri KACC 91155 Isolated from Korean Infant in Jurkat T Cells원문보기
본 연구에서는 유아의 분변에서 분리한 항산화 효과를 갖는 유산균인 Lactobacillus gasseri KACC 91155의 Jurkat T cell line에서의 지질 과산화 억제 효과, 세포 보호 효과 및 DNA 손상 억제 효과를 측정하였다. 그 결과 1. gasseri 91155는 세포 산화에 의해 생성된 지질 과산화물인 MDA의 생성을 방지하였으며, 또한 뚜렷하게 세포 생존성을 증가시켰다. 그리고 산화적 손상으로부터 DNA 손상을 줄여주는 효과를 나타내었다.
본 연구에서는 유아의 분변에서 분리한 항산화 효과를 갖는 유산균인 Lactobacillus gasseri KACC 91155의 Jurkat T cell line에서의 지질 과산화 억제 효과, 세포 보호 효과 및 DNA 손상 억제 효과를 측정하였다. 그 결과 1. gasseri 91155는 세포 산화에 의해 생성된 지질 과산화물인 MDA의 생성을 방지하였으며, 또한 뚜렷하게 세포 생존성을 증가시켰다. 그리고 산화적 손상으로부터 DNA 손상을 줄여주는 효과를 나타내었다.
In the present study, we investigate the protective effect of antioxidant strain Lactobacillus gasseri KACC 91155, isolated from Korean infant feces(Obstetrics & Gynecology, Suwon, Korea) on the oxidative stress damage on the Jurkat T cells. To estimate the extent of cellular lipid peroxidation inhi...
In the present study, we investigate the protective effect of antioxidant strain Lactobacillus gasseri KACC 91155, isolated from Korean infant feces(Obstetrics & Gynecology, Suwon, Korea) on the oxidative stress damage on the Jurkat T cells. To estimate the extent of cellular lipid peroxidation inhibition, MDA(malondialdehyde) production was measured Furthermore, cell viability was detected by the MTT assay, DNA damage was tested by the comet assay. Cell grown in medium with or without L gasseri lysate$(100\~1,000{\mu}g)$ were treated with $H_2O_2,\;Fe^{2+}$ as an oxidative stimulus. From the result obtained, the supplementation of Jurkat T cells with L. gasseri lysate significantly decreased in MDA production (1,250 vs. 835 nmol/mg protein), and DNA damage(31.6 vs. 22.6 tail moment). Also L gasseri increase cell viability against oxidative damage. We concluded that the L. gasseri KACC 91155 showed a protective effect against oxidative stress.
In the present study, we investigate the protective effect of antioxidant strain Lactobacillus gasseri KACC 91155, isolated from Korean infant feces(Obstetrics & Gynecology, Suwon, Korea) on the oxidative stress damage on the Jurkat T cells. To estimate the extent of cellular lipid peroxidation inhibition, MDA(malondialdehyde) production was measured Furthermore, cell viability was detected by the MTT assay, DNA damage was tested by the comet assay. Cell grown in medium with or without L gasseri lysate$(100\~1,000{\mu}g)$ were treated with $H_2O_2,\;Fe^{2+}$ as an oxidative stimulus. From the result obtained, the supplementation of Jurkat T cells with L. gasseri lysate significantly decreased in MDA production (1,250 vs. 835 nmol/mg protein), and DNA damage(31.6 vs. 22.6 tail moment). Also L gasseri increase cell viability against oxidative damage. We concluded that the L. gasseri KACC 91155 showed a protective effect against oxidative stress.
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문제 정의
따라서 본 연구에서 in vitro 선발 과정을 통해 선발된 항산화 균주인 Lactobacillus gasseri KACC 91155의 Jurkat T cell line에서 항산화 효과를 측정하고자 하였다.
, 1996). 본 연구에서는 L. gasseri 91155의 Jurkat T cell에서의 지질 과산화 억제 효과, 세포 생존율, DNA 손상 억제 정도를 측정하였다.
본 연구에서는 유아의 분변에서 분리한 항산화 효과를 갖는 유산균인 Lactobacillus gasseri KACC 91155의 Jurkat Tcell line에서의 지질 과산화 억제 효과, 세포 보호 효과 및 DNA 손상 억제 효과를 측정하였다. 그 겨과 L.
제안 방법
5)으로 충분히 세척하였다. Comet image 분석을 위해 ethidium bromide(20 "g/mL)로 nucleotides를 염색하여 형광현미경(Leica DMLB, Germany) 에서 관찰하고, CCD 카메라를 통해 comet image analyzing system이 설치된 컴퓨터에서 분석하였다. DNA 손상 정도는 핵으로부터 이동한 DNA 파편의 거리값(tail length, TL)에 tail 내 함유된 DNA% (Tail % DNA)를 곱해준 tail moment (TM)값을 측정하여 나타내었다.
Comet image 분석을 위해 ethidium bromide(20 "g/mL)로 nucleotides를 염색하여 형광현미경(Leica DMLB, Germany) 에서 관찰하고, CCD 카메라를 통해 comet image analyzing system이 설치된 컴퓨터에서 분석하였다. DNA 손상 정도는 핵으로부터 이동한 DNA 파편의 거리값(tail length, TL)에 tail 내 함유된 DNA% (Tail % DNA)를 곱해준 tail moment (TM)값을 측정하여 나타내었다.
L. gasseri 91155의 DNA 손상 억제 효과를 조사하였다. Fig.
L. gasseri 91155의 활성 산소에 의한 MDA 생성 억제 효과를 조사하였다. Fig.
세포의 MDA 함량은 상업적 측정 kit인 Lipid peroxidation assay kit (Calbiochem®, USA)를 사용하여 측정하였다. MDA 함량은 회귀방정식으로 산출된 표준 MDA(1, 1, 3, 3-Tetramethoxy propane)의 직선 방정식에 대입하여 구하였고, nmol MDA/mg protein으로 나타내었다.
높은 항산화 활성을 갖는 Lactobacillus spp. 를 분리하고자 모유를 수유하는 유아 11명의 분변(중앙산부인과, 수원)을멸균 생리식염수로 십진 희석한 후 0.02% sodium azide가 첨가된 MRS agar(Difco, USA)에 도말하고 BBL gas pack anaerobic system(BBL, USA)을 사용하여 37 ℃ 에서 24시간 배양하였다. 생장한 특성적인 단일 균주를 분리하고, 다시 MRS broth(Difco, USA)에서 배양한 17 균주의 항산화 효과를 TBA법으로 측정하였다(Lin and Chang, 2000).
gasseri lysate를 처리하고 1시간 배양 후 100 H2O2를 처리하고 30분간 배양하였다. 세포 사멸억제 효과는 Cell counting kit-8(Dojindo Laboratories, Japan) 를 사용하여 ELISA reader(REF 402-5802, Bio-rad, USA)를 이용하여 450 nm 흡광도에서 측정하였다.
gasseri lysate는 PBS에 희석하여(100~1, 000 "g protein) 첨가하고 1시간 배양 후 100 FeSQ, 100 "MH2O2를 처리하여 세포에 산화적 스트레스를 가하고 30분간 배양 후 cell을 멸균 PBS(Biowhittaker, USA)로 2회 세척 후 초음파 분쇄기를 사용하여 세포를 파쇄(40% power, 20 sec, Vibra cell™, Sonics & Materials INC, USA)하고 원심분리(250xg, 5 min)하여 상등액을 얻었다. 세포의 MDA 함량은 상업적 측정 kit인 Lipid peroxidation assay kit (Calbiochem®, USA)를 사용하여 측정하였다. MDA 함량은 회귀방정식으로 산출된 표준 MDA(1, 1, 3, 3-Tetramethoxy propane)의 직선 방정식에 대입하여 구하였고, nmol MDA/mg protein으로 나타내었다.
유산균이 H2O2 유도 세포 사멸에 방어 효과가 있는지 조사하기 위하여 유산균을 미리 처리한 세포에서 세포 생존성을 측정하고 Fig. 4에 나타내었다. 본 연구에서는 MTT assay 를 사용하여 세포의 생존성을 측정하였다(Han et al.
지질 과산화 정도를 알아보기 위하여 MDA(malondialde-hyde) 함량을 측정하였다. 100 mm dish에 5><104 cell/mL를분주하여 24시간 배양하였다.
대상 데이터
1). 16S rDNA 염기 서열분석 결과 Lactobacillus gasseri로 동정 되 었고 한국농업 미 생물자원센터(수원)에 기탁하여 Lactobacillus gasseri KACC 91155(이하 L. gasseri 91155)의 등록번호를 부여 받았다. Fig.
Jurkat T cell(ATCC TIB-152)은 American Type Culture Collection(Rockville, MD, USA)으로부터 구입하여 10% fetal bovine serum(FBS, Biowhittaker, USA), 2 mmol/L L-glutamine (Biowhittaker, USA), IxlO5 IU/L penicillin(Biowhittaker, USA) 및 100 mg/L streptomycin(Biowhittaker, USA) 을 함유하는 RPMI 1640(Biowhittaker, USA) 배지에서 37℃, 5% CO2 조건으로 배양하였다.
Jurkat T celle L. gasseri 91155와 함께 배양함으로써 H2O2에 의한 세 포 독성 으로부터 보호되어 생 존성 이 증가하였다. Wang 등(2003)은 산화적 손상으로부터 세포의 손상을 보호하기 위해서는 항산화 성분이 세포에 축적되기 위한 충분한 배양 시간이 필요하다고 하였다.
, 2001). 그러나 본 연구에서는 H2O2 단독 처리로는 MDA 생성을 초래하지 못하였기 때문에 Jurkat cell에 산화적 스트레스를 가하기 위하여 일반적으로 in vitro assay 에서 많이 사용되는 산화제인 Fea와 H2O2를 사용하였다. 이 두 산화제는 Fenton reaction을 통하여 매우 반응성이 큰 hydroxyl radicab을 생성한다(Li and Lau, 1993).
데이터처리
사용하여 처리하였다. one-way 분산분석 (ANOVA) 을 시행하였고, 모든 통계적 유의성은p<0.05 수준에서 평가하였다.
측정값은 평균土표준오차로 나타내었고, SPSS-PC+ 통계 package를 사용하여 처리하였다. one-way 분산분석 (ANOVA) 을 시행하였고, 모든 통계적 유의성은p<0.
이론/모형
4에 나타내었다. 본 연구에서는 MTT assay 를 사용하여 세포의 생존성을 측정하였다(Han et al., 2004). 유산균과 활성 산소를 처 리하지 않은 negative control의 세포 생존율을 100%로 보았을 때 유산균을 처리하지 않고 H2O2를 첨가한 positive controls] 생존율은 30.
02% sodium azide가 첨가된 MRS agar(Difco, USA)에 도말하고 BBL gas pack anaerobic system(BBL, USA)을 사용하여 37 ℃ 에서 24시간 배양하였다. 생장한 특성적인 단일 균주를 분리하고, 다시 MRS broth(Difco, USA)에서 배양한 17 균주의 항산화 효과를 TBA법으로 측정하였다(Lin and Chang, 2000). 이들 균주 중 항산화 효과가 높은 단일 균주를 선발하였고, 생명공학연구원 한국유전자원센터(대전)에 의뢰하여 16S rDNA 염기서열로 분석한 결과 Lactobacillus gasseri로 동정되었다.
세포의 DNA 손상 정도 측정을 위해 comet assay를 Singh 등(1998)의 방법에 준하여 실시하였다. 세포에 L.
gasserf의 lysate는 전보(Kim 등, 2005)와 동일한 방법으로 제조하였다. 즉, 분리한 유산균을 MRS broth에서 배양(37 ℃) 후 원심분리 (4, 000xg, 10 min)하여 세포를 회수하였다 회수된 세포는 20 mM sodium phosphate buffer(SPB, pH 7.4)로 2회 세척 후 다시 SPB에 현탁하여 초음파 처리로 파쇄하고 원심분리 (7, 000xg, 10 min)한 다음 상등액을 0.45 acrodisc syringe filter(Life Science, USA)로 여과하였으며, 단백질 함량은 Bradford 법 (Bio-Rad Laboratories, USA)으로 측정하였다.
성능/효과
3에 나타낸 바와 같이 이 균주는 세포 산화에 의해 생성된 지질 과산화물인 MDA의 생성을 방지하였다. 세포의 MDA 함량은 유산균을 처리하지 않은 positive control에서 1, 250±42.7 nmol MDA/mg protein이었으나, L. gasseri 500 "g lysate 처리구는 835±33.9 nmol MDA/mg으로 MDA 생성이 억제되었다.
spp. 중 in vitro 선발 과정을 통하여 선발된 항산화 활성이 가장 우수한 균주로서 34.87±2.68%(500 "g protein) 의 항산화 효과를 나타내었다(Fig. 1). 16S rDNA 염기 서열분석 결과 Lactobacillus gasseri로 동정 되 었고 한국농업 미 생물자원센터(수원)에 기탁하여 Lactobacillus gasseri KACC 91155(이하 L.
gasseri 91155는 세포 산화에 의해 생성된 지질 과산화물인 NOME] 생성을 방지하였으며, 또한 뚜렷하게 세포 생존성을 증가시켰다. 그리고 산화적 손상으로부터 DNA 손상을 줄여주는 효과를 나타내었다.
, 2004). 유산균과 활성 산소를 처 리하지 않은 negative control의 세포 생존율을 100%로 보았을 때 유산균을 처리하지 않고 H2O2를 첨가한 positive controls] 생존율은 30.5±1.5%로 낮았다. 반면 L.
생장한 특성적인 단일 균주를 분리하고, 다시 MRS broth(Difco, USA)에서 배양한 17 균주의 항산화 효과를 TBA법으로 측정하였다(Lin and Chang, 2000). 이들 균주 중 항산화 효과가 높은 단일 균주를 선발하였고, 생명공학연구원 한국유전자원센터(대전)에 의뢰하여 16S rDNA 염기서열로 분석한 결과 Lactobacillus gasseri로 동정되었다.
후속연구
또한 세포의 생존성이 증가한 원인은 항산화 성분이 세포의 superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase(GPX) 등과 같은 항산화 효소의 활성을 증가시켰기 때문이라고 보고하였다. 본 연구에서도 L. gasseri 91155의 H2O2에 의한 손상으로부터 Jurkat T cell의 생존성 증가 효과는 L. gasseri 91155 lysate 성분이 세포의 항산화 효소 활성을 증가시킨 것으로 사료되며 이에 대한 추가적인 실험이 요구된다.
참고문헌 (27)
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