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문제 정의
- 그러나 특정 유산균의 생장을 촉진시키는 프리바이오틱스로서의 역할과 상승효과에 관련된 연구는 전무한 설정이다. 따라서 본 연구에서는 CT를 첨가한 우유를 L. gasseri 505로 발효한 발효유의 면역조절 활성을 확인하고자 하였으며, real-time PCR, ELISA 및 western-blotting 분석을 통해 면역조절 사이토카인의 생성량 및 단백질 발현을 측정하였다.
제안 방법
- , Santa Cruz, CA)를 처리하였다. 2차 항체 처리 후 ECL(BioRad Laboratories, Hercules, CA)를 이용해서 단백질 밴드를 검출하고, Bio-rad ChemiDoc MP imaging system과 quantified with ImageJ software(National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA)를 이용하여 정량화하였다.
- 50 μL 배양 상층액에 Griess 시약 (25 μL 1% sulfanilamide in 5% H3PO4 solution, 25μL 0.1% NED solution)을 첨가하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 7 cells을 (1×106 cells/well)로 96 well-plate에 도포하였으며, 12시간 후 무혈청DMEM 배지로 교체 후 12 시간 뒤에 샘플처리를 실시하였다. RAW 264.7 cells에 동결건조한 Control, CT, FCT 파우더를 무혈청 DMEM 배지를 이용하여 10 mg/mL, 5 mg/mL, 2.5 mg/mL, 1.25 mg/mL 농도로 처리하여 24시간 동안 반응하였다. 배양액을 제거한 후, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT, Sigma, USA) 용액(48 μL)을 첨가하여 37℃, 5% CO2에서 4시간 동안 배양하였다.
- RAW 264.7 cells을 (1×106 cells/well)로 96 well-plate에 도포하였으며, 12시간 후 무혈청DMEM 배지로 교체 후 12 시간 뒤에 샘플처리를 실시하였다.
- RAW 264.7 cells을 1×106 cells로 6 well-plate에 분주하여 배양한 후, 샘플(동결 건조한 Control, CT and FCT 파우더)을 무혈청 DMEM 배지를 이용하여 10 mg/mL, 5 mg/mL, 2.5 mg/mL, 1.25 mg/mL 농도로 처리하여 37℃, 5% CO2에서 24시간 동안 반응하였다.
- 그 후, Trans blot Turbo transfer pack(BioRad Laboratories, Hercules, CA)에 전이하였다. Tris-buffered saline with 0.05% Tween-20과 무지방 분유로 blocking한 후에 iNOS, COX-2의 1차 항체(Cell Signaling Technology, Boston, MA, USA)와 2차 항체(Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA)를 처리하였다. 2차 항체 처리 후 ECL(BioRad Laboratories, Hercules, CA)를 이용해서 단백질 밴드를 검출하고, Bio-rad ChemiDoc MP imaging system과 quantified with ImageJ software(National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA)를 이용하여 정량화하였다.
- 25 mg/mL 농도로 처리하여 37℃, 5% CO2에서 24시간 동안 반응하였다. 배양 후 배양 상층액을 이용하여 사이토카인을 측정하였다. 배양 상층액은 측정 전까지 —70℃에서 보관하였다.
- 염증 과정에서 대식세포는 외래 또는 감염 인자를 제거하고, TNF-α, IL-1β, IL-6, 산화 질소를 포함하는 성장 인자 및 염증 매개체의 방출을 방지하기 위해 방어 분자의 발현에 중요한 역할을 한다. 본 연구에서는 신바이오틱스 발효유의 면역증강 활성 정도를 LPS와 비교하여 NO, 면역조절 사이토카인의 발현을 통해 확인하였다.
- 배양 상층액은 측정 전까지 —70℃에서 보관하였다. 사이토카인은 Enzyme-linked immunosorbent assay kits는 ELISA MAX Deluxe Set(BioLegend Inc., San Diego, CA, USA)을 사용하여 측정하였다.
- 사이토카인을 측정하기 위해서(전 염증성/ 항 염증성 사이토카인) RAW 264.7 cell (1×106 cells/96 well plates) RAW 264.7 cells에 동결 건조한 Control, CT, FCT 파우더를 무혈청 DMEM 배지를 이용하여 10 mg/mL, 5 mg/mL, 2.5 mg/mL, 1.25 mg/mL 농도로 처리하여 37℃, 5% CO2에서 24시간 동안 반응하였다.
- 상층액을 제거하고 dark formazan crystals을 100 μL DMSO와 100 μL D.W을 첨가 후, Synergy H1 plate reader(Bio-Tek Instruments Inc.)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 우유(Control)와 동결건조한 꾸지뽕잎 추출물 [0.2% (g/g)]을 첨가한 우유(CT)는 85℃에서 15분간 살균하였으며, 냉각 후 L. gasseri 505를 3%로 접종하였다(ca. 1×107 CFU/mL).
- iNOS 및 COX-2와 같은 전 염증성 매개체가 염증 반응을 조절하는 중요한 역할을 한다. 전 염증성 매개인자의 단백질 발현을 평가하기 위해 RAW 264.7 cell에 Control, CT, FCT를 처리하였다. Control과 CT에서는 iNOS와 COX-2의 단백질 발현이 측정되지 않았다.
대상 데이터
- Lactobacillus gasseri 505(Korean Culture Center of Microorganisms, Seoul, Korea; KCCM 11766P)은 유아분변 유래 유산균으로 Man, Rogosa and Sharpe(MRS) (Difco Laboratories, MI, USA) agar로 37℃에서 48시간 배양하였다. MRS agar 배지에서 배양된 각각의 colony를 10 mL의 MRS broth로 옮겨져 37℃에서 18시간 2회 계대배양하였다.
- RAW 264.7 대식세포는 American Type culture Collection(Rockville, MD, USA)으로부터 구입하였으며, 1% penicillin/streptomycin(GE healthcare Life Sciences, Logan, Utah, USA) 와 10% fetal bovine serum(FBS) (GE healthcare Life Sciences, Logan, Utah, Australia) 가 포함된 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM) (GE healthcare Life Sciences, Logan, Utah, USA)을 이용하여 5% CO2, 37℃ 조건에서 배양하였다.
- 꾸지뽕잎은 전라북도 순창에서 구매하였으며, 추출물을 동결 건조하여 사용하였다. 우유(Control)와 동결건조한 꾸지뽕잎 추출물 [0.
이론/모형
- 면역 활동에 의한 사이토카인의 정략적 측정을 위해 본 연구에서는 ELISA를 실행하였다. CT의 경우, TNF-α, IL-1β, IL-10에서 Control과 비교하였을 때 생성량에 유의적이 차이가 있었으나, IL-6의 경우에는 발현되지 않았다.
성능/효과
- 10 mg/mL 농도의 FCT는 5 ng/mL의 LPS를 처리한 군과 IFN-γ, IL-2와 IL-12 생성량을 비교하였을 때 유의적인 차이가 없는 것으로 확인되었다.
- Control, CT와 FCT 비교 결과, FCT가 유의적으로 가장 높은 NO 생성량(40.63 μM)을 나타내었으며, 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인하였다(Fig. 1A).
- FCT를 처리한 RAW 264.7 cells에서 Control과 CT를 처리한 RAW 264.7 cells와 비교하여 TNF-α, IL-1β, IL-6 and IL-10 등의 사이토카인 생성량이 유의적으로 증가한 것을 확인되었다 (Fig. 2).
- FCT를 처리한 군에서 농도 의존적으로 IFN-γ, IL-2, IL-12 분비가 증가한 것을 확인하였다(Fig. 3).
- 25 mg/mL의 Control과 CT를 모두 처리한 군에서는 IL-6이 검출되지 않았다. IL-10 생성량 측정 결과, FCT 10 mg/mL를 처리한 군에서 IL-10의 생성량(162 pg/mL)이 5 ng/mL LPS를 단독으로 처리한 군(39.1 pg/mL)보다 4배나 높게 발현된 것을 확인하였다. FCT를 처리한 군에서 농도 의존적으로 IFN-γ, IL-2, IL-12 분비가 증가한 것을 확인하였다(Fig.
- , 1994). RAW 264.7 세포에서 FCT에 의한 iNOS의 발현 결과, 단백질 수준에서 FCT가 높은 발현을 나타내었다.
- 결론적으로, 본 연구에서는 프리바이오틱스 소재인 꾸지뽕 잎 추출물과 L. gasseri 505 의 발효물이 염증 조절에 있어 높은 활성을 갖는 것을 확인하였다. 전 염증성 사이토카인인 TNF-α, IFN-r, IL-1β, IL-2, IL-6 와 Treg 로부터 분비된 IL-10 은 단백질 수준에서 FCT 가 가장 높은 발현을 나타내었다.
- 대식세포의 면역활성 정도를 확인할 수 있는 NO 생성량을 측정한 결과, CT의 경우, 10 mg/mL에서 Control과 차이가 미비하였다. 그러나 발효과정을 거친 FCT의 경우 유의적으로 가장 높은 NO 생성 활성을 보이는 결과를 통해 면역활성을 높인다는 것을 확인할 수 있었다. 더불어 농도 의존적인 활성을 보였으므로 활성의 제어가 용의할 것으로 사료된다.
- NO는 선천면역의 대표적인 세포인 대식세포에 의해 생성되어 면역계에서 외부물질에 대한 방어작용을 하는 중요한 신호 전달 물질이다. 대식세포의 면역활성 정도를 확인할 수 있는 NO 생성량을 측정한 결과, CT의 경우, 10 mg/mL에서 Control과 차이가 미비하였다. 그러나 발효과정을 거친 FCT의 경우 유의적으로 가장 높은 NO 생성 활성을 보이는 결과를 통해 면역활성을 높인다는 것을 확인할 수 있었다.
- 따라서 FCT가 TNF-α, IL-1β, IL-6를 증강시킨 결과를 통해 면역반응을 조절하는 작용과 항암기능을 가지고 있을 것으로 사료된다.
- 전 염증성 사이토카인인 TNF-α, IFN-r, IL-1β, IL-2, IL-6 와 Treg 로부터 분비된 IL-10 은 단백질 수준에서 FCT 가 가장 높은 발현을 나타내었다. 또한, iNOS 및 COX-2 와 같은 염증 매개인자도 FCT 에서 농도 의존적으로 가장 높은 발현을 나타내었다. 따라서, 꾸지뽕잎 추출물과 L.
- 10 mg/mL 의 FCT의 경우, iNOS와 COX-2 발현 정도는 5 ng/mL LPS와 유사하게 측정되었다. 이러한 결과로 볼 때, FCT는 RAW 264.7 cell의 세포 면역활성에 있어서 iNOS 및 COX-2 발현을 높게 증가시키는 것을 확인하였다
- 전 염증성 사이토카인인 TNF-α, IFN-r, IL-1β, IL-2, IL-6 와 Treg 로부터 분비된 IL-10 은 단백질 수준에서 FCT 가 가장 높은 발현을 나타내었다.
- 특히, FCT를 처리한 군에서 TNF-α와 IL-6의 생성량이 다른 사이토카인에 비하여 높은 생성량을 나타낸 것을 확인하였다.
후속연구
- 또한, iNOS 및 COX-2 와 같은 염증 매개인자도 FCT 에서 농도 의존적으로 가장 높은 발현을 나타내었다. 따라서, 꾸지뽕잎 추출물과 L. gasseri 505 로 발효한 신바이오틱스는 향후 식품 및 유가공 산업에서 면역조절 기능성 유제품으로서의 활용 가능성이 높을 것으로 사료된다.
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