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문제 정의
- 본 연구에서는 99mTc-GSA의 이러한 단점을 개선시킨 새로운 ASGPR 영상용 방사성의약품인 환원형 LSA#28)를 이용하여, 인위적으로 간손상을 일으킨 생쥐를 대상으로 하여, 체내분포를 알아보고, 이를 통하여 "mTc-LSA가 간세포의 ASGPR 발현 정도의 평가에 이용될 수 있는지와 조직학적 간손상 정도를 비침습적 평가 하는데 이용될 수 있지를 알아보고자 하였다.
- 그러나 99mR-GSA가 가지는 몇 가지 단점들로 인하여, 이를 극복한 새로운 ASGPR 영상용 방사성 의약품인 락토즈 인혈청 알부민(lactosylated serum albumin: LSA)이 최근 개발되었다. 본 연구는 인위적으로 간손상을 발생시킨 생쥐에서 "mTc 표지 LSA ("mR-LSA)의 체내분포를 알아보고, 99mTc-LSA7> 간세포의 ASGPR 발현 정도의 평 가에 이용될 수 있는지 와 조직 학적 간손상 정도를 비 침습적 평가 하는데 이용될 수 있는 방사성의약품인지를 알아보았다.
제안 방법
- 꼬리를 가열하였다. 그동안 주사할 방사성의약품이 들어 있는 주사기의 무게를 먼저 측정하였고, 꼬리정맥이 확장된 것을 확인한 후, 미리 준비한 방사성의약품 0.2 ml를 27 게이지 바늘이 장착된 1 ml 주사기를 이용하여 주입하였다. 주입이 끝난 후 빈 주사기의 무게를 다시 측정하여, 각 생쥐에게 투여된 방사성의약품의 무게를 구하였다.
- 대조군 생쥐 및 간손상이 발생한 생쥐들을 실험대로 옮긴후 정맥이 확장될 수 있도록 백열전구를 이용하여 15초 정도동안 꼬리를 가열하였다. 그동안 주사할 방사성의약품이 들어 있는 주사기의 무게를 먼저 측정하였고, 꼬리정맥이 확장된 것을 확인한 후, 미리 준비한 방사성의약품 0.
- 심한 간 손상을 일으키기 위해서 DEN을 생쥐 체중 kg 당 180 mg의 용량으로 주당 1회씩 2주간 복강 내로 주사하였고 2회 주사 다음날 실험을 시행하였다. 또한 급성 간손상을 일으키기 위하여 thioacetamide (TAA) (Sigma, USA)를 생쥐체중 kg당 50 mg의 용량으로 주사한 다음, 6시간, 24시간, 48시간 및 72 시간 후 실험을 시작하였다. 실험을 시행하기 전까지 실험동물들은 23±2 ℃, 습도 55±5 %로 유지되는 항온항습 사육실에서 충분한 양의 먹이와 물을 공급받으면서 사육되었다.
- 효창 사이언스로부터 구입하여 사용하였다. 미약한 간 손상을 일으키기 위하여, diethylnitrosamine (DEN) (Sigma, USA) 을 생 쥐 체중 kg당 60 mg의 용량으로 주당 1회씩 5주간 복강 내 주사하였고 실험은 6주째 시행하였다. 심한 간 손상을 일으키기 위해서 DEN을 생쥐 체중 kg 당 180 mg의 용량으로 주당 1회씩 2주간 복강 내로 주사하였고 2회 주사 다음날 실험을 시행하였다.
- 방사능 계수측정은 5 ml용 그린튜브에 검사재료를 넣은 후 Cobra # Auto- Gamma Counting System (Model 5005, Packard, USA) 을 이용하여 2분간 계수를 시행하여 측정하였다. 이때 에너지 준위는 140±20 keV로 하였고, #기의 반감기를 6.
- 주입이 끝난 후 빈 주사기의 무게를 다시 측정하여, 각 생쥐에게 투여된 방사성의약품의 무게를 구하였다. 방사성 의약품 투여한 후 10분, 30분, 2시간, 6시간에 생쥐를 희생시켜 혈액, 간, 비장, 창자, 위장, 갑상선, 신장 폐장 뼈 및 골수를 분리시켜 그린튜브에 넣고, 동시에 표준화 주사기의 방사능을 50배로 희석하여 그 중 1 ml를 채취하여 그린튜브에 넣어, 장기가 들어있는 그린튜브와 함께 CobraU 계수기를 이용하여 방사능 계수를 구하였다. 표준화 주사기에서 얻어진 방사능량을 기준으로 하여 각 생쥐에 투여된 전체 방사능량을 추정하고, 추정한 전체 방사능량에 대한 각각 장기들의 상대적인 방사능 분포정도를 알아보았다.
- 낮아 간독성 동물 모델에서 자주 이용되고 있다. 본 연구에서는 생쥐 체중 kg 당 60 mg 정도의 낮은 용량으로 주당 1회 5차례 투여한 예와 180 mg의 높은 용량을 주당 1회 2차례 투여한 예가 있는데, 낮은 용량을 투여한 경우 간세포의 미약한 풍선화 변성과 소량의 염증세포의 침윤 등이 소견의 전부였다. 그러나 높은 용량을 투여한 생쥐는 광범위한 간세포 괴사와 염증세포 침윤을 동반한 급성 간손상 상태를 보였다.
- 표준화 주사기에서 얻어진 방사능량을 기준으로 하여 각 생쥐에 투여된 전체 방사능량을 추정하고, 추정한 전체 방사능량에 대한 각각 장기들의 상대적인 방사능 분포정도를 알아보았다. 분석 자료로는 투여된 전체 방사능량에 대한 해당 장기에 모인 방사능량을 백분율로 구하여, 이를 장기의 무게와 생쥐의 무게로 보정하여 사용하였다.
- "mTc 은 Dupont사에서 구입한 발생기에서 얻었으며. 비방사능을 높이기 위하여, 방사능 표지 30분 이내에 착유를 시행하여 얻은 #11Tc-pertechnetate를 사용하였다. 각 생쥐에서 투여되는 방사성의약품은 용액량이 0.
- 실험동물의 혈액을 이용하여 간효소치(AST, ALT)의 상승 여부를 알아보았고, 조직학적 간손상 정도를 평가하기 위해 동물을 희생시킨 후 즉시간을 적출하여 10% formalin용액에 고정하였고, 파라핀을 이용하여 조직절편을 만든 후, hematoxylin-eosin (H-E) 염색을 시행하였다. 이렇게 만들어진 조직으로 DEN 투여 용량에 따른 간손상 형태를 알아보았으며, 간손상에 따른 ASGPR의 발현 변화를 알아보기 위하여 anti-asialoglycoprotein receptor antibody (Calbio- 산lem, Germany)를 이용하여 면역조직화학 검사를 시행하였다.
- 실험을 시행하기 전까지 실험동물들은 23±2 ℃, 습도 55±5 %로 유지되는 항온항습 사육실에서 충분한 양의 먹이와 물을 공급받으면서 사육되었다. 실험에서 사용된 생쥐 수는 총 48마리로 대조군과 두 가지 용량의 DEN 투여군, TAA 투여군으로 분류하였다.
- 미약한 간 손상을 일으키기 위하여, diethylnitrosamine (DEN) (Sigma, USA) 을 생 쥐 체중 kg당 60 mg의 용량으로 주당 1회씩 5주간 복강 내 주사하였고 실험은 6주째 시행하였다. 심한 간 손상을 일으키기 위해서 DEN을 생쥐 체중 kg 당 180 mg의 용량으로 주당 1회씩 2주간 복강 내로 주사하였고 2회 주사 다음날 실험을 시행하였다. 또한 급성 간손상을 일으키기 위하여 thioacetamide (TAA) (Sigma, USA)를 생쥐체중 kg당 50 mg의 용량으로 주사한 다음, 6시간, 24시간, 48시간 및 72 시간 후 실험을 시작하였다.
- 앞서 발표된 논문4)에서와 동일한 방법으로 제작된 LSA cold 바이알에, eTc 을 생리적 식염수로 희석하여 3.7 X 107 Bq/ml로 되도록 만들어 혼합하였고, 15분간 상온에서 반응시켜 표지하였다. "mTc 은 Dupont사에서 구입한 발생기에서 얻었으며.
- (H-E) 염색을 시행하였다. 이렇게 만들어진 조직으로 DEN 투여 용량에 따른 간손상 형태를 알아보았으며, 간손상에 따른 ASGPR의 발현 변화를 알아보기 위하여 anti-asialoglycoprotein receptor antibody (Calbio- 산lem, Germany)를 이용하여 면역조직화학 검사를 시행하였다. 조직검사상 나타난 간손상 정도 및 면역조직화학 검사 결과와 방사성의약품의 체내분포 변화를 비교하여 보았다.
- 이렇게 만들어진 조직으로 DEN 투여 용량에 따른 간손상 형태를 알아보았으며, 간손상에 따른 ASGPR의 발현 변화를 알아보기 위하여 anti-asialoglycoprotein receptor antibody (Calbio- 산lem, Germany)를 이용하여 면역조직화학 검사를 시행하였다. 조직검사상 나타난 간손상 정도 및 면역조직화학 검사 결과와 방사성의약품의 체내분포 변화를 비교하여 보았다.
- 2 ml를 27 게이지 바늘이 장착된 1 ml 주사기를 이용하여 주입하였다. 주입이 끝난 후 빈 주사기의 무게를 다시 측정하여, 각 생쥐에게 투여된 방사성의약품의 무게를 구하였다. 방사성 의약품 투여한 후 10분, 30분, 2시간, 6시간에 생쥐를 희생시켜 혈액, 간, 비장, 창자, 위장, 갑상선, 신장 폐장 뼈 및 골수를 분리시켜 그린튜브에 넣고, 동시에 표준화 주사기의 방사능을 50배로 희석하여 그 중 1 ml를 채취하여 그린튜브에 넣어, 장기가 들어있는 그린튜브와 함께 CobraU 계수기를 이용하여 방사능 계수를 구하였다.
- 방사성 의약품 투여한 후 10분, 30분, 2시간, 6시간에 생쥐를 희생시켜 혈액, 간, 비장, 창자, 위장, 갑상선, 신장 폐장 뼈 및 골수를 분리시켜 그린튜브에 넣고, 동시에 표준화 주사기의 방사능을 50배로 희석하여 그 중 1 ml를 채취하여 그린튜브에 넣어, 장기가 들어있는 그린튜브와 함께 CobraU 계수기를 이용하여 방사능 계수를 구하였다. 표준화 주사기에서 얻어진 방사능량을 기준으로 하여 각 생쥐에 투여된 전체 방사능량을 추정하고, 추정한 전체 방사능량에 대한 각각 장기들의 상대적인 방사능 분포정도를 알아보았다. 분석 자료로는 투여된 전체 방사능량에 대한 해당 장기에 모인 방사능량을 백분율로 구하여, 이를 장기의 무게와 생쥐의 무게로 보정하여 사용하였다.
대상 데이터
- 무균실에서 사육한 생후 4주, 체중 20 gm의 ICR (Institute of Cancer Research, USA) 계 숫컷 생쥐 (mouse)를 효창 사이언스로부터 구입하여 사용하였다. 미약한 간 손상을 일으키기 위하여, diethylnitrosamine (DEN) (Sigma, USA) 을 생 쥐 체중 kg당 60 mg의 용량으로 주당 1회씩 5주간 복강 내 주사하였고 실험은 6주째 시행하였다.
데이터처리
- 사용한 통계 기법으로는 비모수 검정법인 Kruskal- Wallis H 검사를 이용하였으며, p 값이 0.05 미만인 경우를 유의한 것으로 하였다.
성능/효과
- TAA 투여로 간손상을 발생시킨 생쥐에서는 모든 시간대에 간섭취가 감소하는 소견을 보였으며, 조직학적으로 간 손상의 회복시기 인 72시간에는 "mTc-LSA의 섭취도 향상되는 소견을 보여, "mTc-LSA 혈액 제거 및 간내 섭취 평가는 급성 간손상 후 회복과정도 잘 반영해 줄 수 있을 것으로 생각된다.
- 이상의 결과들을 종합적으로 볼 때, "mTc-GSA의 단점을 개선시킨 ASGPR 영상용 방사성의약품인 "mec-LSA는 DEN 및 TAA 투여에 의해 급성 및 만성 간손상 생쥐 모델에서 조직학적 간손상 여부와 정도 예측할 수 있었으며, 또한 간손상 후 그 회복과정을 비침습적으로 보여 줄 수 있는 방사성 의약품인 것으로 나타났다. "mTc-LSA 간 신티그라피가 급성 혹은 만성 간손상이 의심되는 환자에서 간손상 정도르 예측하고 간 손상의 호전 혹은 진행 여부를 판단하는 영상기법으로 사용될 수 있을 것으로 생각한다.
- 48시간에는 중심정맥 주위로 심한 간세포 괴사 소견 및 염증세포의 침윤이 관찰되어 24시간에 비해 심해진 간조직 손상소견을 보였고, 72시간 영상에서는 48시간에 비해 간세포 괴사 및 염증세포 침윤정도가 감소하여 간손상이 회복되는 소견을 보였다(Fig. 3).
- ASGPR 항체를 이용한 면역조직화학검사에서는 정상에서는 염색이 되고, 60 mg으로 간손상을 일으킨 생쥐에서는 염색이 짙게 되어 ASGPR의 발현이 증가된 것으로 나타났으며, 180 mg으로 손상시킨 생쥐에서는 염색상이 낮아져, ASGPR의 발현이 감소된 소견을 나타내었다(Fig. 2).
- 그러나 DEN 투여시 발생하는 것으로 알려진 간의 섬유화 및 재생결절 등의 소견은 관찰되지 않았다. ASGPR에 대한 면역조직화학 검사에서는 저용량의 DEN을 투여한 생쥐는 정상생쥐에 비해 높은 염색상이 보여 간세포의 ASGPR 의 발현이 증가된 양상을 보였는데, 고용량의 DEN을 투여한 생쥐는 염색상이 낮아 ASGPR의 발현이 감소된 것으로 나타났다. ASGPRe 간세포의 분화된 정도를 나타내며, 간세포의 분열시에는 간세포의 분화도가 낮아져 그 발현이 감소되는 것으로 알려져 있다.
- TAA 투여 후 6 시간까지는 조직학적으로 뚜렷한 간손상 소견은 발견되지 않았으나, 24시간에는 중심정맥 주위로 미약한 정도의 초점성 간세포 괴사 및 염증세포 침윤소견이 관찰되었다. 48시간에는 중심정맥 주위로 심한 간세포 괴사 소견 및 염증세포의 침윤이 관찰되어 24시간에 비해 심해진 간조직 손상소견을 보였고, 72시간 영상에서는 48시간에 비해 간세포 괴사 및 염증세포 침윤정도가 감소하여 간손상이 회복되는 소견을 보였다(Fig.
- TAA를 투여하지 않은 생쥐에 비해 TAA를 투여한 생쥐는 실험이 시행된 모든 시간대(6시간, 24시간, 48시간, 72시간)에서 간섭취가 감소되었으며, 혈액내 방사능의 잔류가 높았다. 그중 조직학적으로 간손상정도가 가장 심하였던 TAA 투여 48시간 후에 시행된 실험에서 간장내 섭취정도가 가장 감소되었으며, 혈액내 방사능제거도 낮았다(Fig.
- TAA를 투여한 경우 간효소치는 투여 후 24시간 후 가장 상승된 값을 보였으며, 그 후 시간 경과에 따라 호전되는 경향을 보여, 72시간 후 얻은 결과상 대조군과 비슷한 값을 가지는 것으로 나타났다(Table 1).
- 간세포의 혈청단백 대사에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 asialoglycoprotein 수용체(ASGP receptor: ASGPR) 가간세포의 표면에 발현됨이 알려진 후 이의 정량적인 평가를 이용하면, 현재까지 널리 이용되고 있는 방사능표지 콜로이드보다 간세포 기능을 평가는데 더 유용할 것으로 예측되 었다.
- 이는 간의 조직학적 검사에서 확인된 것처럼 간괴사의 발생이 없어 간세포 절대수의 감소가 없으면서, 면역조직화학 검사에서 보여진 것처럼 간세포의 ASGPR의 염색상이 높아져 있어, ASGPR의 발현이 증가되어 'eTc-LSA가 미약한 간손상에서 오히려 섭취가 증가하는 결과를 발생되게 한 것으로 생각된다. 그러나 넓은 범위에 간세포의 괴사가 발생할 정도의 심한 정도의 간손상이 유도된 생쥐(DEN 180 mg, 2회 TAA 5 mg)는, eTc-LSA의 혈액 내 제거 및 간 섭취 정도가 정상생쥐에 비해 유의하게 감소된 결과를 나타내었다. 이는 괴사로 인한 간세포의 절대 수가 감소와, 간세포의 손상 후 재생과정에서 ASGPR의 발현 감소가 "mTc-LSA 섭취감소 원인이라고 생각된다.
- 높았다. 그중 조직학적으로 간손상정도가 가장 심하였던 TAA 투여 48시간 후에 시행된 실험에서 간장내 섭취정도가 가장 감소되었으며, 혈액내 방사능제거도 낮았다(Fig. 5, Table 3).
- ASGPRe 간세포의 분화된 정도를 나타내며, 간세포의 분열시에는 간세포의 분화도가 낮아져 그 발현이 감소되는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서 간세포의 괴사가 없는 미약한 손상을 일으킨 간조직은 간세포의 분열은 없으면서 원래의 간세포 기능으로 회복하기 위하여 ASGPR의 발현이 증가된 것으로 생각되며, 괴사가 심했던 간조직은 간세포의 ASGPR 발현이 감소되어 있었는데, 이는 간손상 후 분열 과정으로 진행하게 됨으로서 ASGPR의 발현이 감소된 것으로 생각된다.
- 생쥐 체중 kg당 DEN 60 mg을 투여한 생쥐는 대조군 생쥐와 비슷한 정도의 간섭취 정도와 혈액내 잔류를 보였으나, 생쥐 체중 kg당 DEN 180 mg을 투여한 생쥐는 대조군 및 DEN이 60 mg 투여된 생쥐에 비하여 낮은 간섭취와 높은 혈액내 방사능을 보여, 간에서의 LSA 제거가 감소되어 있는 소견을 보였다(Fig. 4, Table 2).
- TAA에 의한 간손상이 간조직에 균일하게 발생하지 않고 주로 중심정맥 주위에 심하게 발생하는 것은 중심정맥 주위에 있는 간세포에 독성대사물의 형성에 관여하는 효소인 cytochrome P-450의 농도가 가장 높고, 34)중심정맥 (central vein) 부위가 혈류를 공급하는 문맥부위(portal triad)에서 가장 멀리 떨어져 있어 영양의 공급이 낮고 간손상 물질에 대한 저항력이 가장 낮은 부위이기 때문이다. 생쥐에게 TAA를 복강 내로 투여한 후 6시간까지는 괴사조직이 관찰되지 않았으나, 24시간에는 중심정맥 주위로 미약한 정도의 초점성 간세포 괴사 및 염증세포 침윤소견이 관찰되었고, 48시간에는 중심정맥 주위로 심한 간세포 괴사 소견 및 염증세포의 침윤이 관찰되어 24시간에 비해 심해진 간조직 손상소견을 보였고, 72시간 영상에서는 48시간에 비해 간세포 괴사 및 염증세포 침윤정도가 감소하여 간손상이 회복되는 소견을 보였다. DEN과 TAA에 의한 간조직손상 소견은 인간에서의 급성 독성간손상에서 흔히 볼 수 있는 소견이어서, DEN과 TAA 유발 간손상 생쥐는 급성간손상 연구를 위한 실험동물 모델로 적절하다고 생각된다.
후속연구
- 것으로 나타났다. "mTc-LSA 간 신티그라피가 급성 혹은 만성 간손상이 의심되는 환자에서 간손상 정도르 예측하고 간 손상의 호전 혹은 진행 여부를 판단하는 영상기법으로 사용될 수 있을 것으로 생각한다.
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