The absorption of a P-gp substrate, rhodamine 123, from a liposomal dosage form was investigated across Caco-2 cell monolayers, rat intestines and rat intestinal Peyer's patches in Ussing chamber, Rhodamine 123 was incorporated into liposomes according to the standard evaporation method, which led t...
The absorption of a P-gp substrate, rhodamine 123, from a liposomal dosage form was investigated across Caco-2 cell monolayers, rat intestines and rat intestinal Peyer's patches in Ussing chamber, Rhodamine 123 was incorporated into liposomes according to the standard evaporation method, which led to a production of liposomes with a mean diameter of 71.3 nm. The permeability (Papp of rhodamine 123 from a water solution across the monolayer was $2.45{\times}10^{-6}$ cm/s for $A{\leftrightarrow}B$ (apical to basal) and $14.0{\times}10^{-6}$ cm/s for $B{\leftrightarrow}A$ (basal to apical) directions, consistent with the fact that rhodamine 123 is one of the P-gp substrates. The transport of rhodamine 123 from the liposomal dosage form was much lower for both directions compared to the solution of rhodamine 123. The transport of rhodamine 123 across the rat intestine was also significantly decreased for both directions, I.e., influx and efflux, by the liposomal incorporation of the compound. The transport of rhodamine 123 across the Peyer's patch was substantially reduced by liposomal incorporation. No difference was found in the transport between the Peyer's patch and non-Peyer's patch. These observations suggest that the contribution of transport via Peyer's patches in the uptake of liposomes may be minimal, especially for rapidly absorbed compounds like rhodamine 123. Therefore, the increased absorption of P-gp substrates does not appear to be feasible by incorporating the compounds in liposomes, due to negligible involvement of Peyer's patches in the uptake of particulate dosage forms like liposomes. Liposomes may rather represent a sustained release dosage form of incorporated compounds.
The absorption of a P-gp substrate, rhodamine 123, from a liposomal dosage form was investigated across Caco-2 cell monolayers, rat intestines and rat intestinal Peyer's patches in Ussing chamber, Rhodamine 123 was incorporated into liposomes according to the standard evaporation method, which led to a production of liposomes with a mean diameter of 71.3 nm. The permeability (Papp of rhodamine 123 from a water solution across the monolayer was $2.45{\times}10^{-6}$ cm/s for $A{\leftrightarrow}B$ (apical to basal) and $14.0{\times}10^{-6}$ cm/s for $B{\leftrightarrow}A$ (basal to apical) directions, consistent with the fact that rhodamine 123 is one of the P-gp substrates. The transport of rhodamine 123 from the liposomal dosage form was much lower for both directions compared to the solution of rhodamine 123. The transport of rhodamine 123 across the rat intestine was also significantly decreased for both directions, I.e., influx and efflux, by the liposomal incorporation of the compound. The transport of rhodamine 123 across the Peyer's patch was substantially reduced by liposomal incorporation. No difference was found in the transport between the Peyer's patch and non-Peyer's patch. These observations suggest that the contribution of transport via Peyer's patches in the uptake of liposomes may be minimal, especially for rapidly absorbed compounds like rhodamine 123. Therefore, the increased absorption of P-gp substrates does not appear to be feasible by incorporating the compounds in liposomes, due to negligible involvement of Peyer's patches in the uptake of particulate dosage forms like liposomes. Liposomes may rather represent a sustained release dosage form of incorporated compounds.
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문제 정의
따라서 이 약물은 특정 세포주의 P-gp 발현정도를 검사하거나, ") 신물질의 P-gp 저해제로서의 가능성을 평가하는 도구로 쓰일 수 있다.'淑9)따라서 본 연구에서는 로다민 123을 모델 약물로 하여 리포솜 봉입이 약물의 장관흡수에 미치는 영향을 알아보았다.
소장관의 Peyer's patch는 큰 입자를 유입하는 성질이 있음이 알려져 있으므로 Peyer's patch에서 리포솜의 흡수가 흡수상피에서보다 높은지 검토하고자 하였다. Peyer's patch에서 Eposomal 로다민 123 투과는 흡수상피에서와 유의성있는 차이를 보이지 않았다(Fig.
제안 방법
5 m/ 가하였다. 15, 30, 45, 60, 75, 90, 105분에 transwell 을 1.5 m2의 새 배지가 들어있는 well로 옮긴 후 basaM에서 0.5 m昭 취하였다. B-A 방향의 수송 실험은 위와 마찬가지로 진행하되 로다민 123, 로다민 123의 리포솜 액을 transwell의 basal측에 각각의 시점에 apical导에서 0.
5 m/ 가하였다. 15, 30, 45, 60, 75, 90, 105분에 transwell을 1.5 m/의 새 배지가 들어있는 well로 옮긴 후 basal side에서 0.5n”씩 취하였다. 시료 0.
24시간 절식시킨 SD male rat(8~14주, 300~400 g)을 에테르 마취시켜 수술판에 고정하고 개복하여 소장을 적출하였다. 적출한 장을 ice cold salinee 두 번 씻은 후 장 상부 12 cm는 절단하여 버리고 나머지 부분에서 Peyer's patch를 포함하는 부분과 포함하지 않는 부분을 골라 적당한 길이로 자르고 중앙선을 따라 잘라 펴서 Ussing chamber0]] moun하였다.
배지는 5% fetal bovine serum, 1% non-essential amino acid, 100 unit/m/ penicillin, lOOmg/mZ streptomycin을 포함하는 Dulbeco's modified eagle's medium (DMEM)을 사용하였으며 2일에 한번 배지를 교체해주었다. 3일마다 계대 배양하였다. 수송 실험을 하기 위해 collagen coating 한 polycarbonate membrane 위에 세포를 심고 18~28일 사이에 실험에 사용하였으며 TEER value 300QXCm2 이상인 것만을 사용하였다.
실험을 하였다. A-B 방향의 수송 실험은 로다민 123, 로다민 123의 리포솜액을 transwell의 apical side에 0.5 ml 가하고 basal side에는 투과 실험용 배지를 1.5 m/ 가하였다. 15, 30, 45, 60, 75, 90, 105분에 transwell 을 1.
5 m昭 취하였다. B-A 방향의 수송 실험은 위와 마찬가지로 진행하되 로다민 123, 로다민 123의 리포솜 액을 transwell의 basal측에 각각의 시점에 apical导에서 0.4 m2를 취하고 같은 양의 배지를 보충하여 주었다. P-gp의 기질인 verapamil(200mM)에 의한 영향도 관찰하였다.
투과 실험용 배지는 HBSS용액을 사용하였다. Caco-2 세포 단층을 투과실험용 배지로 세 번 씻어준 후 14C-mannitol(specific activity 50 mCi/mmol), 3H-taurocholate(specific activity 3.47 Ci/mmol)을 transwell의 apical side에 0.5 nd 가하고 basal side에는 투과실험용 배지를 1.5 m/ 가하였다. 15, 30, 45, 60, 75, 90, 105분에 transwell을 1.
4 m2를 취하고 같은 양의 배지를 보충하여 주었다. P-gp의 기질인 verapamil(200mM)에 의한 영향도 관찰하였다. 로다민 123의 농도를 spectrofluorometer로 정량하였으며 (入</入对=485/530) 겉보기 투과계수 Papp는 다음의 식에 의하여 구하였다.
5 m2를 넣고 이 tubing 을 HBSS 1 가■ 든 비이커에 담그고 상온에서 외상의 농도가 평형에 이를 때까지 교반하며 방치했다. 경시적으로 외상에서 0.5 m2씩 sampling 하여 외상의 로다민 123 농도를 측정하였다. 제조한 리포솜액은 실험에 쓸 때까지 4℃ 냉장고에 보관하였다.
또한 mannitol 누출을 확인하기 위해 14C-mannitol 용액으로 수송 실험을 실시하였으며 Caco-2 cell에 수송계가 잘 발현되어 있는지를 확인하기 위하여 3H-taurocholate5- 수송 실험을 실시하였다. 투과 실험용 배지는 HBSS용액을 사용하였다.
로다민 123 함유 리포솜의 제조 - 50 m/ 둥근 바닥 플라스크에 로다민 123 50 mg과 인지질 5 mg(egg phosphatidyl choline : cholesterol=3 :1)을 녹인 메탄을 3 ml를 넣고 회전 감압 농축기에서 감압 하에 2시간 이상 메탄올을 날려 약물과 인지질의 박막을 만들었다. 그 다음 둥근 바닥 플라스크를 고정한 후 질소가스로 남아있는 유기용매를 가능한 한 제거하였다.
로다민 123의 수송 실험 - Caco-2 세포 단층을 투과 실험용 배지로 세 번 씻어준 후 로다민 123 용액 또는 로다민 123 리포솜 액으로 Apical-Basal(A-B)방향과 Basal-Apical(B-A)방향으로 수송 실험을 하였다. A-B 방향의 수송 실험은 로다민 123, 로다민 123의 리포솜액을 transwell의 apical side에 0.
리포솜 액을 주사용수로 희석하여 용액의 강도(intensity)를 200~300으로 맞춘 후 세포 안에 넣어 크기를 측정하였다. 리포솜의 봉입효율은 투석과 초원심분리의 두 가지 방법으로 측정하였다.
리포솜 액을 주사용수로 희석하여 용액의 강도(intensity)를 200~300으로 맞춘 후 세포 안에 넣어 크기를 측정하였다. 리포솜의 봉입효율은 투석과 초원심분리의 두 가지 방법으로 측정하였다. 투석법의 경우 봉입되지 않은 약물을 제거하기 위해 투석하였을 때 외상의 농도가 평형에 도달한 시점에서 투석을 멈추고 내상의 리포솜 액을 50 ml 취하여 적당히 희석한 후 리포솜을 깨기 위해 Triton X-100 2% 용액을 가하였다.
리포솜의 크기 및 봉입률 측정 - 리포솜의 크기는 NicompTM 370 submicron particle sizer를 이용하여 측정하였다. 리포솜 액을 주사용수로 희석하여 용액의 강도(intensity)를 200~300으로 맞춘 후 세포 안에 넣어 크기를 측정하였다.
에서 배양호]였다. 배지는 5% fetal bovine serum, 1% non-essential amino acid, 100 unit/m/ penicillin, lOOmg/mZ streptomycin을 포함하는 Dulbeco's modified eagle's medium (DMEM)을 사용하였으며 2일에 한번 배지를 교체해주었다. 3일마다 계대 배양하였다.
이것을 extrusion device를 이용해 두 장의 polycarbonate membrane(pore size 100 nm)에 3~5번 통과시켜서 크기를 고르게 하였다. 이렇게 만들어진 리포솜액에서 봉입되지 않은 약물을 제거하기 위해 24시간 동안 투석하였다. 5.
적출한 장을 ice cold salinee 두 번 씻은 후 장 상부 12 cm는 절단하여 버리고 나머지 부분에서 Peyer's patch를 포함하는 부분과 포함하지 않는 부분을 골라 적당한 길이로 자르고 중앙선을 따라 잘라 펴서 Ussing chamber0]] moun하였다. Ussing chamber의 양측에 Krebs-bicarbonate buffer(K-B buffer; MgCl2 1.
대상 데이터
(Nevada, USA) 제품을 사용하였다. 14C-mannitol(specific activity 50 mCi/ mmol) 과 JH-taurocholate(specific activity 3.47 Ci/mmol) 는 New England Nuclear(Boston MA, USA)사에서 , Fetal bovine serum(FBS)는 Hyclone(Logan UT, USA)사에서 구입하였으며 기타 시약들은 Sigma(St. Louis MO, USA)사에서 구입하여 사용하였다.
3일마다 계대 배양하였다. 수송 실험을 하기 위해 collagen coating 한 polycarbonate membrane 위에 세포를 심고 18~28일 사이에 실험에 사용하였으며 TEER value 300QXCm2 이상인 것만을 사용하였다. 수송 실험에 사용한 세포의 계대 수는 40~48이었다.
성능/효과
또한 verapamil처리에 의한 P-gp 저해현상이 리포솜과 solution 양 쪽 모두에서 관찰되었다. 리포솜에 봉입된 약물이 소장관에서 흡수되려면 1) 리포솜으로부터 방출된 후 흡수되거나 2) 리포솜이 그대로 장관 상피세포 등에 유입된 후 리포솜 자체가 serosal side 로 이동하거나, 약물이 cell 안에서 리포솜으로부터 방출 된 후 흡수되어야 한다.
Caco-2 세포, 2) 쥐 소장의 흡수상피, 3) 쥐 소장의 Peyer's patch 투과는 모두 solution 에 비하여 감소하였으며 liposomal 로다민 123의 쥐 소장과 쥐 소장의 Peyer's patch 투과는 크게 다르지 않았다. 또한 verapamil처리에 의한 P-gp 저해현상이 리포솜과 solution 양 쪽 모두에서 관찰되었다.
TEER 값과 14C-mannitol 수송에서 단층 세포의 tight junction이 유지됨을 확인하였다. Caco-2 monolayer의 기능성을 평가하기 위해 taurocholate 수송 실험을 수행하였을 때 taurocholate 수송은 A-B 투과가 Bf A 투과보다 훨씬 높아서 (Papp, A-B, 7.08±0.14 X10-6 cm/s; Papp, B-A, 9.91± 0.27X 10项 cm/s), Caco-2 단층 세포에 담즙산 수송계가 발현됨을 시사하였다(Fig. 2B).
또한 이 값은 문헌치2°)와 비교해 보았을 때 유사한 값이었다. TEER 값과 14C-mannitol 수송에서 단층 세포의 tight junction이 유지됨을 확인하였다. Caco-2 monolayer의 기능성을 평가하기 위해 taurocholate 수송 실험을 수행하였을 때 taurocholate 수송은 A-B 투과가 Bf A 투과보다 훨씬 높아서 (Papp, A-B, 7.
3). 또한 verapamiH- 전 처리하였을 때 로다민 123의 A— B 투과는 증가, AA 투과는 감소하는 P-gp 저해효과도 solution과 리포솜 투과시에 모두 관찰되었다(Fig. 4). 즉 리포솜에 봉입된 로다민 123는 리포솜에서 서서히 방출된 후 free drug 상태로 투과되기 때문에 투과 속도가 감소한 것으로 생각된다.
수단 IV mannitol 등 투과가 거의 전혀 안 되는 약물을 리포솜에 봉입하여 Caco-2 세포나 소장관에서의 흡수나 투과를 본다면 좀 더 확실한 결론을 얻을 수 있을 것으로 생각된다. 또한 위의 실험 결과에서 로다민 123 처럼 소장 상피세포 투과성이 높은 물질을 리포솜에 봉입하면, 그 물질의 위장관 흡수를 지속시킬 수 있다는 사실을 알았다. 이는 리포솜에 봉입된 약물이 유리되어 나와 free drug 상태로 흡수되며 , 약물이 봉입된 리포솜은 그 상태로는 거의 소장관 상피세포를 투과하지 못하기 때문으로 생각된다.
로다민 123를 리포솜에 봉입하였을 때 Caco-2 투과성esolution 에서보다 A-B, B—A 양 방향 모두 현저히 낮아졌다 (Fig. 3). 또한 verapamiH- 전 처리하였을 때 로다민 123의 A— B 투과는 증가, AA 투과는 감소하는 P-gp 저해효과도 solution과 리포솜 투과시에 모두 관찰되었다(Fig.
홉수상피세포에서 endocytosis 등 제 3의 경로를 통한 흡수는 없거나, 있더라도 그 기여는 매우 적을 것으로 생각된다. 이로부터 투과성이 좋은 약물을 리포솜에 봉입하면, 리포솜으로부터 봉입된약물이 방출되어 나오는데 걸리는 시간만큼, Caco-2 단층 세포를 투과하는 시간이 지연됨을 알 수 있었다. 이는 리포솜을 흡수성이 좋은 약물의 지속성 경구투여제형으로 응용할 수 있음을 시사한다.
3nm였다(number Gaussian analysis). 제조 후 시간이 지날수록 크기는 천천히 증가하여 30 일째는 평균 직경이 148nm에 이르렀다. 이로부터 제조된 리포솜은 시간이 지날수록 서로 융합하여 크기가 커지는 것으로 추정된다.
투석 (dialysis)시 외상의 로다민 123 농도는 증가하다가 8 시간 이후로는 평형에 도달하였다(Fig. 1). 이때 내상의 농도(1.
후속연구
게다가 로다민 123은 흡수가 매우 잘되는 약물이기 때문에 로다민 123 리포솜이 유입되었을 때 그 정도가 적다면 방출된 free drug의 흡수와 비교하여 이것을 평가하는 것은 어렵다. 수단 IV mannitol 등 투과가 거의 전혀 안 되는 약물을 리포솜에 봉입하여 Caco-2 세포나 소장관에서의 흡수나 투과를 본다면 좀 더 확실한 결론을 얻을 수 있을 것으로 생각된다. 또한 위의 실험 결과에서 로다민 123 처럼 소장 상피세포 투과성이 높은 물질을 리포솜에 봉입하면, 그 물질의 위장관 흡수를 지속시킬 수 있다는 사실을 알았다.
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