The embryos of marine bivalves have been commonly used in bioassays for the quality assessment of marine environments. Although several standard protocols for developmental bioassay with bivalves have been already proposed, there have been few trials for applying these protocols in environmental ass...
The embryos of marine bivalves have been commonly used in bioassays for the quality assessment of marine environments. Although several standard protocols for developmental bioassay with bivalves have been already proposed, there have been few trials for applying these protocols in environmental assessment, or for developing new protocol with Korean species. So, there is a strong need to establish the standard bioassay protocols using bivalves commonly found in Korean waters. Prior to developing a new protocol, it is essential to know the optimum conditions for the reliable bioassay procedures. Here, we established the purpose of this study to determine the optimum bioassay conditions for successful development of a common mussel, Mytilus galloprovincialis. The conditions considered as critical for developmental bioassay, and determined in this study were; (1) temperature, (2) salinity, and (3) initial density of embryo. The optimal temperature for developmental bioassay of M. galloprovincialis was determined as $15^{\circ}C$. At this temperature, the required time for the embryo to become veliger larva was 48 hr. The acceptable range of salinity for the embryotoxicity test using M. galloprivincialis was from 30 to 35 psu, which was narrower than that of the natural habitat of adult populations. The optimum density of embryo at the beginning of bioassay was 100 embryos/ml. Over this density, the proportion of normally developed larvae decreased significantly. The results obtained in this study will serve as a basis for preparation of the standard bioassay protocol using embryo of M. galloprovincialis.
The embryos of marine bivalves have been commonly used in bioassays for the quality assessment of marine environments. Although several standard protocols for developmental bioassay with bivalves have been already proposed, there have been few trials for applying these protocols in environmental assessment, or for developing new protocol with Korean species. So, there is a strong need to establish the standard bioassay protocols using bivalves commonly found in Korean waters. Prior to developing a new protocol, it is essential to know the optimum conditions for the reliable bioassay procedures. Here, we established the purpose of this study to determine the optimum bioassay conditions for successful development of a common mussel, Mytilus galloprovincialis. The conditions considered as critical for developmental bioassay, and determined in this study were; (1) temperature, (2) salinity, and (3) initial density of embryo. The optimal temperature for developmental bioassay of M. galloprovincialis was determined as $15^{\circ}C$. At this temperature, the required time for the embryo to become veliger larva was 48 hr. The acceptable range of salinity for the embryotoxicity test using M. galloprivincialis was from 30 to 35 psu, which was narrower than that of the natural habitat of adult populations. The optimum density of embryo at the beginning of bioassay was 100 embryos/ml. Over this density, the proportion of normally developed larvae decreased significantly. The results obtained in this study will serve as a basis for preparation of the standard bioassay protocol using embryo of M. galloprovincialis.
* AI 자동 식별 결과로 적합하지 않은 문장이 있을 수 있으니, 이용에 유의하시기 바랍니다.
문제 정의
따라서 본 연구의 목적을 지중해담치의 배아를 이용한 생물 검정의 최적 실험 조건을 찾는 데에 두었고 지중해담치의 배아 로부터 발생하는 정상적인 유생까지의 과정을 관찰하여 각 조 건들의 영향을 살펴보았다.
본 연구를 통해 지중해담치 (Mytilus galloprovincialis) 의 배아를 이용한 생물검정의 최적 실험 조건을 결정하였다. 결정 되어진 조건은 다음과 같다.
가설 설정
그러므로 1 liter 용기의 표면적이 50 ml 용기의 표면적의 20 배 이상 크지 않다면 밀도 종속 효과 는 1 liter 용기에서 더욱 크게 나타날 것이다. 즉, 배양액의 표면적이 넓을수록 정상 발생률은 더욱 더 증가할 것이다.
제안 방법
시료의 최적의 염분 범위를 결정하기 위하여 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 그리고 50 psu 의 10 개 실험구를 준비 하였다. 1 nm 카트리지를 통과한 여과해수를 이용하여 고염 도의 해수를 소요량 이상 제조하고, 초순수 (deionized water) 를 첨가하여 각 염분별 실험구를 준비하였다. 각 실험 구마다 수정란의 밀도를 ml 당 약 100 개가 되도록 조절하여 폴리스티렌 재질의 50-ml 배양용 플라스크 (Falcon) 에 넣고, 15℃에서 48 시간 동안 배양하였다.
6B). 24 psu부터 2 psu 간격으로 아홉 개의 처리구로 실험하였고 기타 발생조건은 선행된 실험과 동일하게 주었다. 24-28 psu까지의 최고 정상 발생비율이 60%에도 이르지 못 하였고 36-40 psu에서도 낮은 정상 발생비율을 나타내었다.
각 실험구마다 수정란의 밀도를 ml 당 약 100 개가 되도록 조절하여 폴리카보네이트 재질의 1-L 투명용 기 (Nalgene) 에 넣고, 각 온도에 해당하는 배양기에 넣어 발 생이 진행되도록 배양하였다. 각 발생 단계별 경과 시간을 알 아내기 위하여 수정 후 120 시간까지 3 시간 간격으로 5 ml 씩 취하여 4% 포름알데히드로 고정하였다. 시료 내의 배아를 현미경으로 (100 배) 관찰하여 5개의 발생단계 (수정란, 2 세 포기-상실기, 포배기, 담륜자유생, 피면자유생) (Fig.
각각의 발생 단계에 해당되는 개체의 비율이 전체의 50% 이상이 되는 시간을 그 단계의 발생시간으로 간주하였다. 각 온도별로 부화한 배아의 백분율 (부화율) 과 정상적으로 발생한 유생의 백분율 (정상 발생률) 을 계산하였다. 그리고 온도와 발생시간의 역수 간의 상관관계로부터 생물학적영도를 계산하였고 생물학적 영도를 이용하여 지중해담치의 적산수온을 계산하였다.
1) 각각 에 해당되는 배아의 백분율을 계산하였다. 각각의 발생 단계에 해당되는 개체의 비율이 전체의 50% 이상이 되는 시간을 그 단계의 발생시간으로 간주하였다. 각 온도별로 부화한 배아의 백분율 (부화율) 과 정상적으로 발생한 유생의 백분율 (정상 발생률) 을 계산하였다.
지중해담 치의 알이 성게의 알보다 더 작은, 즉 표면적이 더 작은 알이다. 그래서 기존의 지중해담치의 배아를 이용한 생물검정 자료 (M 30 embryos/ml) 에서 보다 더 높은 밀도조건에서도 정상 발생에 영향을 주지 않을 수 있다는 가설 하에 예비실험을 실 시하였고, 예비실험의 결과 정상 발생률이 70% 이상이고, 대 조구와 차이가 나지 않는 밀도인 ml당 100 개의 알을 노출하여 실험하였다. 그리고 최적의 염분이 결정되기 이전의 실험에 서는 모체서식환경의 평균염분 (32 psu) 으로 실험하였다.
각 온도별로 부화한 배아의 백분율 (부화율) 과 정상적으로 발생한 유생의 백분율 (정상 발생률) 을 계산하였다. 그리고 온도와 발생시간의 역수 간의 상관관계로부터 생물학적영도를 계산하였고 생물학적 영도를 이용하여 지중해담치의 적산수온을 계산하였다. 각 온도별 부 화율과 정상 발생률 결과에 대하여 분산분석 (ANOVA, 유의 수준 a = 0.
생물학적영도는 어떤 생물의 생물적인 활동 이 모두 정지하는 온도로 생물마다 다르며 이 온도 이하에서는 발생하기 힘든 온도를 말한다. 그리고 이 생물학적영도를 이용하여 각 발생단계별 적산수온을 계산하여 결과를 나타내었다. 적산수온은 발생이 진행됨에 따라 지수함수적으로 증가함을 알 수 있었다.
그래서 기존의 지중해담치의 배아를 이용한 생물검정 자료 (M 30 embryos/ml) 에서 보다 더 높은 밀도조건에서도 정상 발생에 영향을 주지 않을 수 있다는 가설 하에 예비실험을 실 시하였고, 예비실험의 결과 정상 발생률이 70% 이상이고, 대 조구와 차이가 나지 않는 밀도인 ml당 100 개의 알을 노출하여 실험하였다. 그리고 최적의 염분이 결정되기 이전의 실험에 서는 모체서식환경의 평균염분 (32 psu) 으로 실험하였다.
동일한 결과를 얻 는다면 보다 짧은 시간 내에 얻는 것이 더 나을 것이다. 따라서 10℃보다는 15℃가 현실적으로 보다 나은 조건인 것으로 여겨 지며, 본 연구에서는 15℃를 지중해담치 배아를 이용한 생물검 정 실험의 최적 온도로 결정하였다.
이 기준을 본 실험의 결과에 적용하여 보면, 70% 이상의 정상 발생률이 관찰된 염분 조건은 30 psu 및 35 psu의 두 조건뿐이었다. 따라서 본 연구에서는 지중해담치의 배아를 이용한 생물검정의 최적 염분 범위를 30-35 psu로 결정하였다. 하지만 본 실험의 결과는 염분 처리구의 간격이 넓어 생물검정 대상 시료의 염분을 보정 할 때 모호성을 나타낼 우려가 있었다.
발생의 최적 밀도를 결정하기 위하여 수정란의 밀도가 ml 당 25, 50, 100, 200, 400, 800 그리고 1600 개가 되도록 조절 한 7 개 실험구를 준비하였다. 1 카트리지를 통과한 여과 해수를 사용하였고 50-ml 배양용 폴리스티렌 플라스크 (Falcon) 를 배양용기로 하여 15℃에서 48 시간 동안 배양하였다.
1 카트리지를 통과한 여과 해수를 사용하였고 50-ml 배양용 폴리스티렌 플라스크 (Falcon) 를 배양용기로 하여 15℃에서 48 시간 동안 배양하였다. 배양이 종료된 후 시료는 4%의 포름알데히드로 고정하 였고 각 시료마다 정상 발생률을 계산하였다. 각 밀도별 정상 발생률 자료에 대하여 분산분석을 실시하였고, 정상 발생률이 70% 이상인 밀도 범위를 찾아내었다.
각 발생 단계별 경과 시간을 알 아내기 위하여 수정 후 120 시간까지 3 시간 간격으로 5 ml 씩 취하여 4% 포름알데히드로 고정하였다. 시료 내의 배아를 현미경으로 (100 배) 관찰하여 5개의 발생단계 (수정란, 2 세 포기-상실기, 포배기, 담륜자유생, 피면자유생) (Fig. 1) 각각 에 해당되는 배아의 백분율을 계산하였다. 각각의 발생 단계에 해당되는 개체의 비율이 전체의 50% 이상이 되는 시간을 그 단계의 발생시간으로 간주하였다.
시료의 최적의 염분 범위를 결정하기 위하여 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 그리고 50 psu 의 10 개 실험구를 준비 하였다. 1 nm 카트리지를 통과한 여과해수를 이용하여 고염 도의 해수를 소요량 이상 제조하고, 초순수 (deionized water) 를 첨가하여 각 염분별 실험구를 준비하였다.
배양이 종료된 후 시료는 4%의 포름알데히드로 고정하였고 시료 내의 배아를 관찰하여 。자형의 정상적인 피면자유생 (veliger) 의 백분율을 계산하였다. 실험 완료 후 조금 더 세밀한 결과를 얻기 위하여 전과 동일한 실험법으로 24-40 psu 까지 2 psu 간격으로 9 개의 시료를 준비하여 각 시료별 정상발생률을 구하였다. 각각의 모든 염분별 정상 발생률 자료에 대하여 분산분석을 실시하였고, 정상 발생률이 70% 이상인 염분 범위를 찾아내었다.
실험의 초기단계에서 알의 수정 여부는 알 표면에 극체 (polar body) 의 돌기로 인해 수정막이 돌출되어 있는 알을 수정란으로 판단하였다 (Fig. IB). 초기의 수정률은 90% 이상 이었다.
온도실험에서 얻어진 결과를 이용하여 생물학적영도를 구하였다. 온도와 발생시간의 역수간의 상관관계를 나타내는 것이 며 (Fig.
산란을 유도하기 위하여 공기 중에 1시간 가량 간출시킨 후, 1 μm 카트리지를 통과한 여과해수 (20℃, 32 psu) 에 다시 집어넣었다. 이렇게 해서 얻어진 수정란은 100 “m 의 나일론 망을 통과시켜 큰 입자의 이물질을 제거하였고, 40 Am 의 나일론 망 위에서 여 과해수로 약 7 차례 세척하여 정자 및 미세이물질, 그리고 크기가 작은 미성숙란을 제거하였다.
각 실험 구마다 수정란의 밀도를 ml 당 약 100 개가 되도록 조절하여 폴리스티렌 재질의 50-ml 배양용 플라스크 (Falcon) 에 넣고, 15℃에서 48 시간 동안 배양하였다. 배양이 종료된 후 시료는 4%의 포름알데히드로 고정하였고 시료 내의 배아를 관찰하여 。자형의 정상적인 피면자유생 (veliger) 의 백분율을 계산하였다. 실험 완료 후 조금 더 세밀한 결과를 얻기 위하여 전과 동일한 실험법으로 24-40 psu 까지 2 psu 간격으로 9 개의 시료를 준비하여 각 시료별 정상발생률을 구하였다.
대상 데이터
자연적인 산란을 억제하기 위하여 수온을 10℃로 유지하여 4 주 동안 순치시켰다. 실험에 사용된 성체는 패각을 잘 닦아서 이물질을 제거하였고, 남아있는 원생생물과 부착생 물을 제거하기 위하여 담수로 세척하였다. 산란을 유도하기 위하여 공기 중에 1시간 가량 간출시킨 후, 1 μm 카트리지를 통과한 여과해수 (20℃, 32 psu) 에 다시 집어넣었다.
실험의 최적 온도를 결정하기 위하여 1 μm 카트리지를 통 과한 여과해수로 5, 10, 15, 20, 그리고 25Y의 다섯 개 실험 구를 설정하였다. 각 실험구마다 수정란의 밀도를 ml 당 약 100 개가 되도록 조절하여 폴리카보네이트 재질의 1-L 투명용 기 (Nalgene) 에 넣고, 각 온도에 해당하는 배양기에 넣어 발 생이 진행되도록 배양하였다.
지중해담치의 성체는 2004년 2월에 거제도 장목 연안에서 채집하였다. 자연적인 산란을 억제하기 위하여 수온을 10℃로 유지하여 4 주 동안 순치시켰다.
데이터처리
배양이 종료된 후 시료는 4%의 포름알데히드로 고정하 였고 각 시료마다 정상 발생률을 계산하였다. 각 밀도별 정상 발생률 자료에 대하여 분산분석을 실시하였고, 정상 발생률이 70% 이상인 밀도 범위를 찾아내었다.
그리고 온도와 발생시간의 역수 간의 상관관계로부터 생물학적영도를 계산하였고 생물학적 영도를 이용하여 지중해담치의 적산수온을 계산하였다. 각 온도별 부 화율과 정상 발생률 결과에 대하여 분산분석 (ANOVA, 유의 수준 a = 0.05) 을 실시하였고 (Zar, 1984), 정상 발생률이 70% 이상인 온도 범위를 찾아내었다.
실험 완료 후 조금 더 세밀한 결과를 얻기 위하여 전과 동일한 실험법으로 24-40 psu 까지 2 psu 간격으로 9 개의 시료를 준비하여 각 시료별 정상발생률을 구하였다. 각각의 모든 염분별 정상 발생률 자료에 대하여 분산분석을 실시하였고, 정상 발생률이 70% 이상인 염분 범위를 찾아내었다.
성능/효과
그리고 30-34 psu 범위 내에서는 70%를 상회하는 정상발생 비율을 보였으며 통계적으로도 차이가 없었다. 따라서 본 실험 과 추가적인 실험의 결과를 종합해 보면 최적의 염분범위는 30-35 psu라고 할 수 있다.
밀도가 더욱 증가함에 따라 정상 발생률은 지속적으로 감소하 여, 밀도가 ml 당 1600 개인 경우는 정상발생률이 5%에도 미 치지 못하였다. 따라서 지중해담치 배아가 밀도 자체의 영향을 받지 않고 정상적으로 발생할 수 있는 최대 밀도는 ml 당 100 개 정도인 것으로 나타났다.
생물검정 시 노출배양의 온도는 15 ℃ 가 가장 적합하였으며, 이 온도에서 48 시간 노출 이후 실험생물이 피면자 (veliger) 유생단계까지 발생하는 시간이었다.
밀도가 증가하면서 정상 발생률이 감소하는 것은 발생 속도 가 느려졌기 때문인 것으로 여겨진다. 실제로 실험 과정에서 관찰한 결과, ml 당 200 개 이상의 밀도에서 비정상 유생의 대부분이 피면자유생까지 도달하지 못하고 담륜자유생 상태였 다. 실험 중에 지중해담치 배아가 포배기 때 부화한 후 배양액 의 표면에 모여드는 현상을 관찰할 수 있었다.
실제로 실험 과정에서 관찰한 결과, ml 당 200 개 이상의 밀도에서 비정상 유생의 대부분이 피면자유생까지 도달하지 못하고 담륜자유생 상태였 다. 실험 중에 지중해담치 배아가 포배기 때 부화한 후 배양액 의 표면에 모여드는 현상을 관찰할 수 있었다. 즉, 배양액의 총 부피가 50 ml이라고 하지만, 부화 후 운동성을 가지면 50 ml 의 공간을 모두 이용하는 것이 아니라 표면 근처의 일부 공간 만을 이용하는 것이다.
염분 처리구의 발생 실험의 결과, 대조구를 포함한 전체 염 분범위에서 사망개체의 비율은 10% 미만으로 낮았으며, 비교적 낮은 염분인 24 psu와 비교적 높은 염분인 38, 40 psu에서 유사하게 정상적으로 발생하지 못한 개체의 비율이 77% 이상의 결과를 얻었다. 그러나 이러한 결과가 염분이 지중해담치 의 발생에 미치는 영향이 단지 발생속도를 늦추는 것인지 아니 면 더 이상 발생하지 못하고 사멸 할 것인지에 대해서는 추가 적인 연구로 밝혀야 할 것으로 생각된다.
ASTM (1994) 에서는 대조구에서의 정상 발생률이 70% 이상이 될 때 그 생물검정의 결과를 수용할 수 있도록 정해놓고 있다. 이 기준을 본 실험의 결과에 적용하여 보면, 70% 이상의 정상 발생률이 관찰된 염분 조건은 30 psu 및 35 psu의 두 조건뿐이었다. 따라서 본 연구에서는 지중해담치의 배아를 이용한 생물검정의 최적 염분 범위를 30-35 psu로 결정하였다.
따라서 향후 지중해담치의 초기발생단계를 이용하여 해양 환경 시료의 독성 평가에 이용하기에 앞서 시료의 염분이 실험에 적합한 범위에 들어 있는지 여부를 우선적으 로 확인할 필요가 있다. 이러한 연구결과로부터 공장폐수 및 강이나 강 하구지역 같은 곳에서의 시료를 이용한 생물검정을 할 때에는 염분을 적절히 보정하여 사용하는 것이 필요함을 알 수 있었다.
이상의 결과를 종합하면, 지중해담치의 발생이 정상적으로 이루어지는 온도는 10℃와 15℃이다. 부화율과 정상발생률은 이 두 온도에서 차이가 없었다.
그리고 이 생물학적영도를 이용하여 각 발생단계별 적산수온을 계산하여 결과를 나타내었다. 적산수온은 발생이 진행됨에 따라 지수함수적으로 증가함을 알 수 있었다. 피면자유생 단계까지 발생하는데 필요한 적산수온 은 683℃로 계산되었다 (Fig.
25Y의 경우, 부화가 일어 난 이후부터 사망하는 개체가 나타나기 시작하였고, 실험 종료 시에는 전체의 90% 이상이 사망하였다. 즉, 25P는 지중해담 치 유생의 발생에 악영향을 미치는 온도임을 알 수 있었다.
따라서 본 연구에서는 지중해담치의 배아를 이용한 생물검정의 최적 염분 범위를 30-35 psu로 결정하였다. 하지만 본 실험의 결과는 염분 처리구의 간격이 넓어 생물검정 대상 시료의 염분을 보정 할 때 모호성을 나타낼 우려가 있었다. 그래서 염분처리구의 간격을 좁혀 추가적인 실험을 하였다 (Fig.
후속연구
염분 처리구의 발생 실험의 결과, 대조구를 포함한 전체 염 분범위에서 사망개체의 비율은 10% 미만으로 낮았으며, 비교적 낮은 염분인 24 psu와 비교적 높은 염분인 38, 40 psu에서 유사하게 정상적으로 발생하지 못한 개체의 비율이 77% 이상의 결과를 얻었다. 그러나 이러한 결과가 염분이 지중해담치 의 발생에 미치는 영향이 단지 발생속도를 늦추는 것인지 아니 면 더 이상 발생하지 못하고 사멸 할 것인지에 대해서는 추가 적인 연구로 밝혀야 할 것으로 생각된다.
그리고 유생단계 중 이 피면자유생 시기가 약 30일 정도로 가장 길며 섬모를 이용하여 헤엄을 칠 수 있어 환경의 선택적 수용이 가능하다. 따라서 향후 지중해담치의 초기발생단계를 이용하여 해양 환경 시료의 독성 평가에 이용하기에 앞서 시료의 염분이 실험에 적합한 범위에 들어 있는지 여부를 우선적으 로 확인할 필요가 있다. 이러한 연구결과로부터 공장폐수 및 강이나 강 하구지역 같은 곳에서의 시료를 이용한 생물검정을 할 때에는 염분을 적절히 보정하여 사용하는 것이 필요함을 알 수 있었다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.