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문제 정의
- 본 연구는 우선 BPA의 실제 사람에서의 노출농도에서의 에스트로젠 호르몬 효과를 살펴보기 위해 BPA를 1 ng/ml에서 단독으로 노출시키고 동시에 정향피 물 추출물과 노출시켜 BPA에 의한 세포의 변화를 어떻게 방어하는지를 살펴보았다.
- , 1998). 본 연구에서는 식품용기 포장재로 널리 사용되고 있는 외인성 환경호르몬인 BPA를 이 유방암 세포에 투여하여 에스트로젠 수용체와 결합한 후 얼마 정도의 세포증식 효과가 있는지 살펴보았다. 또한 정향피의 물 추출물이 BPA 의 유방암 증식효과를 얼마나 감소시킬 수 있는지 측정함으로서 내분비계 장애물질의 방어효과를 관찰하였다.
- 위의 결과를 바탕으로 유방암 세포에서 뿐만 아니라 BPA와 정향피의 물 추출물을 미성숙랫드에 3일 동안 반복 투여하여 BPA가 미치는 독성을 평가하고, 이에 대한 정향피의 방어 또는 억제효과를 규명해보고자 하였다. 시험기간 동안 정향피 처치군과 BPA 단독 처치군 등 모든 개체에서 이상 증상이나 행동을 보이지 않았고 체중변화에 있어서도 각 투여군과 용매대조군 간의 유의성이 관찰되지 않았다.
- , in process). 이 유효물질 가운데 50% 이내로 BPA의 활성을 억제하는 정향나무(Syringa velutina)와 껍질를 선별하여 독성억제 기전과 in vitro에서의 효과를 살펴보고자 하였다.
제안 방법
- 정향피의 물 추출물에 의하여 BPA에 노출된 유방암 세포에서 유도된 세포사멸 현상의 과정에서 세포사멸 신호전달계의 중요 신호전달 분자인 p21 단백질과 세포 내 항산화 단백질인 Bcl-2 등의 변화를 Western blotting을 통하여 관찰하였다. 100µg/ml 농도의 정향피 물 추출물을 72시간 동안 BPA와 동시에 MCF-7 세포에 처치한 후 여러 단백질의 발현 변화를 조사하였다. Fig.
- 5% fatal bovine serum(FBS)와 3 ml/l의 PSN antibiotic mixture가 첨가된 phenol red-free D-media를 공급한 MCF-7세포를 5% CO2/ 95% air, 100% humidity, 37℃가 유지되는 incubatoi에서 배양하였다.
- BPA와 정향피가 세포의 성장율에 미치는 영향을 알아보기 위하여 BPA를 16 ng/ml에서 단독으로 노출시키고 동시에 정향피 물 추출물과 BPA를 72시간 동안 처치한 후 세포 변화를 살펴보았다. Fig.
- 1mM sodium orthovanadate, 5mM sodium fluoride}를 첨가하여 세포를 lysis 하였다. Cell lysate를 probe sonicator 로 sonication 한 후 DC protein assay kit(Bio-Rad, USA)로 정량한 후 12.5% polyacrylamide ge로 영동하여 nitrocellulose membrane에 transfer 시킨 후 PARR Bel family 등 apoptosis와 관련된 protein에 대한 항체, 혹은 cyclins, cdks, p21 등 cell cycle progression에 관련된 protein에 대한 항체를 반응시키고, 그에 해당하는 2차 항체를 반응시킨 후 chemiluminescent detection reagent를 이용하여 X-ray film에 노출시켜 현상하였다.
- Sprague-Dawley female rat 17일령을 Ⅰ군(용매대조군, 시험물질과 동량의 corn oil), Ⅱ군(정향피의 물 추출물 50 mg/day/100 g-body weight), Ⅲ군(정향피의 물 추출물 10 mg/day/100 g-body weight), Ⅳ군 (정향피의 물 추출물 50 mg/day/100 g-body weight+BPA 400 mg/day/100 g-body weight), Ⅴ군(정향피의 물 추출물 10 mg/day/100 g-body weight+BPA 400 mg/day/ 100 g-body weight), Ⅵ군(BPA 400 mg/day/100 g-body weight)으로 구성된 6개 군에 군 당 3마리씩 체중범위에 따라 무작위로 배정하였다.
- 24시간 후 medium을 제거하고 모든 compounds는 5% dextran-coated charcoal-stripped FBS(DCC_FBS; Hyclone, USA)와 3ml PSN antibiotic mixture(test media)/L Medium에 희석하여 공급한 배지에서 37℃, 3일 동안 incubation하였다. 그 기간동안 test medhjm은 한번 교체해주고 수거한 cellar spectrophotometer OD 260nm에서 DNA content를 측정하였다.
- 본 연구에서는 식품용기 포장재로 널리 사용되고 있는 외인성 환경호르몬인 BPA를 이 유방암 세포에 투여하여 에스트로젠 수용체와 결합한 후 얼마 정도의 세포증식 효과가 있는지 살펴보았다. 또한 정향피의 물 추출물이 BPA 의 유방암 증식효과를 얼마나 감소시킬 수 있는지 측정함으로서 내분비계 장애물질의 방어효과를 관찰하였다. Schafer et al에 의해 10-5의 BPA는 MCF-7 세포에서 무처치 군에 비해 약 3배의 증식효과를 보였으며(Schafer et a!.
- 실험동물이 준비되면 3일 동안 BPA와 정향피 용액을 피하경로로 동시 처치한 후, 마지막 투여일로부터 24시간 후에 체중을 측정한 후에 경추탈구하였다. 부검 시, 자궁에 있는 액체나, 지방을 깨끗이 분리한 다음, 무게를 측정하고, 10% 포르말린에 고정한 다음 통상적인 방법을 거쳐 조직표본을 작성하고 병리조직학적 검사를 실시하였다.
- 실험동물은 Sprague-Dawley female rat 17일령을 한림실험동물(주)에서 구입하여 1일 동안 순화시킨 후 시험에 사용하였다. 시험기간 동안 온도 22±3℃, 상대습도 55±5%, 환기횟수 10~12회/hr, 명암주기 12시간, 조도 150~200lux로 유지하였으며 호르몬의 영향이 배제된 AIN-76A Diet를 섭취 시켰으며, 음수는 상수도를 자유롭게 섭취할 수 있도록 하였다.
- 배양이 끝나면 PBS로 3회 washing하고 4% paraformaldehyde solution으로 30~ 60분 고정한 후 1µg/ml의 Hoechst 33258 solution을 첨가하여 30~60분 염색하였다. 염색이 끝나면 PBS로 3회 washing 한 후 fluorescence microscope에 UV filter를 적용하여 관찰하였다.
- 이것을 증명하기 위해서 정향피의 물 추출물이 BPA에 의해 증식된 유방암 세포에서 어떠한 기전으로 성장을 억제하고 세포의 proliferation이 감소하였는지를 알아보기 위하여 세포의 사멸 형태 중 가장 빈번히 발생하는 핵의 손상과 사멸을 알아보기 위한 방법으로서 대표적인 Hoechst 33258 staining을 실시하여 세포사멸을 관찰하였다. 스크리닝을 거쳐 탐색된 유방암 세포의 성장을 억제하는 정향피 물 추출물과 BPA를 48시간 처치 후 Hoechst 33258으로 염색하였더니 대조군과 유의적인 차를 보였다.
- 정향피의 물 추출물에 의한 BPA의 유방암 세포에서의 증식억제의 특징적인 현상인 핵산분절을 유도하였기 때문에 그 작용기전을 확인하기 위하여 세포의 성장조절 인자인 p21 단백질과 세포 내 항산화 단백질인 Bcl-2 등의 변화를 Western blotting을 통하여 관찰하였다. 최근에 세포사멸기작에서 caspase로 이름 붙여진 interleukin-1-b-converting enzyme(ICE) family cystein protease가 사멸 과정의 중심 역할을 하고 이 효소가 poly(ADP- ribose)polymerase(PARP) 같은 기질을 분해하는 것으로 알려져 있어(Simbulan-Rosenthal et al.
- 정향피의 물 추출물이 BPA에 의해 증식된 유방암 세포에서 어떠한 기전으로 성장을 억제하고 세포의 proliferation이 감소하였는지를 알아보기 위하여 세포의 사멸의 특징 중인 핵의 손상을 관찰하기 위하여 같은 농도에서 48시간 정향피를 BPA와 처치한 후 Hoechst 33258 staining을 실시하였다. 염색 후, 정향피의 물 추출물은 100ug/ml의 농도에서 단독으로 처치하였을 때 (B)와 16ng/ml의 BPA와 동시에 노출시켰을 때 (C), 모두 육안적으로 유방암 세포의 proliferation이 줄어듬과 동시에 세포사멸이 일어나면서 핵의 분절이 관찰되었다(Fig.
대상 데이터
- 본 실험에 사용된 Bisphenol-A(BPA)는 Sigma(USA)에서 구입하여 사용하였고, MCF-7 cell assay에서는 100% EtOH 그리고 immature uterotrophic assay에서는 corn oiKSigma, USA)에 용해하여 사용하였다. 정향피의 물 추출물은 한국식품개발연구원(경기도 성남시)에서 Table 1에서 기재된 방법으로 조제된 동결건조 분말을 입수하여 100% EtOH에 용해하여 Stock(16µg/ml)을 만들어 사용하였다.
- 실험동물은 Sprague-Dawley female rat 17일령을 한림실험동물(주)에서 구입하여 1일 동안 순화시킨 후 시험에 사용하였다. 시험기간 동안 온도 22±3℃, 상대습도 55±5%, 환기횟수 10~12회/hr, 명암주기 12시간, 조도 150~200lux로 유지하였으며 호르몬의 영향이 배제된 AIN-76A Diet를 섭취 시켰으며, 음수는 상수도를 자유롭게 섭취할 수 있도록 하였다.
- 이전 연구의 시험방법 (Kang et a/., 2000)에 따라, 실험동물로는 수유기를 고려하여 생후 17일령을 구입하고 1일 간 순화시킨 후 생후 18일의 미성숙랫드을 사용하였다. 실험동물이 준비되면 3일 동안 BPA와 정향피 용액을 피하경로로 동시 처치한 후, 마지막 투여일로부터 24시간 후에 체중을 측정한 후에 경추탈구하였다.
- 본 실험에 사용된 Bisphenol-A(BPA)는 Sigma(USA)에서 구입하여 사용하였고, MCF-7 cell assay에서는 100% EtOH 그리고 immature uterotrophic assay에서는 corn oiKSigma, USA)에 용해하여 사용하였다. 정향피의 물 추출물은 한국식품개발연구원(경기도 성남시)에서 Table 1에서 기재된 방법으로 조제된 동결건조 분말을 입수하여 100% EtOH에 용해하여 Stock(16µg/ml)을 만들어 사용하였다.
데이터처리
- 시험 중 측정된 시험동물의 체중 등에 관한 자료의 통계학적 분석을 위하여 one-way AN OVA를 실시하여 P=0.05 수준에서 군 간 유의성을 검정하였고 유의성이 인정되면, Dunnetts t-test를 실행하여 대조군과 시험군 간의 통계학적 유의성을 검정하였다(P<0.05).
이론/모형
- 그러므로 본 연구에서는 내분비계 장애물질에 대한 독성방어 물질 개발의 일환으로 정향피의 물 추출물이 BPA 에 의한 사람의 유방암세포와 미성숙랫드에서의 독성을 방어 또는 억제하는지 알아보기 위하여 식품의약품안전청의 의약품 등의 독성시험기준(KGLR 1999)과 비임상시험 관리기준(KGLP 200이에 준하여 시험을 실시하였다.
- 정향피의 물 추출물에 의하여 BPA에 노출된 유방암 세포에서 유도된 세포사멸 현상의 과정에서 세포사멸 신호전달계의 중요 신호전달 분자인 p21 단백질과 세포 내 항산화 단백질인 Bcl-2 등의 변화를 Western blotting을 통하여 관찰하였다. 100µg/ml 농도의 정향피 물 추출물을 72시간 동안 BPA와 동시에 MCF-7 세포에 처치한 후 여러 단백질의 발현 변화를 조사하였다.
성능/효과
- BPA 400mg/100g을 3일 동안 투여한 군은 질과 자궁 모두 용매대조군에 비해 유의적인 증가가 관찰되었다. 질의 습중량의 경우 용매대조군 ⑶ .
- BPA를 16 ng/ml의 농도에서 72시간 동안 처치하였을 때 MCF-7 세포의 성장을 1.5배 촉진시키는 것을 관찰할 수 있었다. 그러나 정향피의 물 추출물 100µg/ml과 동시에 처치하였을 때 BPA에 의한 세포의 성장은 오히려 무처치군의 83%에 이르는 등 BPA의 사람 유방암 세포에서 증식을 방어하는 효과를 보였다.
- , 2000). BPA와 정향피 물 추출물 병행 투여군에 있어서는 고농도 투여군과 저농도 투여군 모두 BPA 단독 투여군에 비해 질의 습중량이 유의적인 감소되는 것이 관찰되었다. 또한 질습중량/체중비율에서 저농도의 정향피 추출물을 BPA와 병행 투여하였을 때 BPA 투여군에 비해 유의적인 감소를 보였다.
- 그러나 정향피의 물 추출물 100µg/ml과 동시에 처치하였을 때 BPA에 의한 세포의 성장은 오히려 무처치군의 83%에 이르는 등 BPA의 사람 유방암 세포에서 증식을 방어하는 효과를 보였다. 게다가 정향피의 물 추출물을 72시간 동안 단독으로 처치하였을 때 100µg/ml에서 무처치군과 비교하면 세포의 성장이 76%까지 감소하여 유방암의 억제능력 또한 가지고 있다고 사료되었다. 이러한 결과는 BPA가 에스트로젠과 유사한 작용을 하여 사람의 유방암 세포 증식을 유발하지만 정향피의 물 추출물은 이러한 독성기작을 저해하며 동시에 유방암 세포에 특이적으로 증식을 억제할 수 있는 활성성분을 가지고 있어 암세포의 사멸 또한 유도하는 것으로 생각되어졌다.
- 결론적으로 사람의 유방암 세포에서 BPA 16ng/ml은 약 1.5배의 세포증식을 유발하며, 정향피 물 추출물 100µg/ml을 병행하여 처치하면 72시간 후 정상세포와 동일한 수치로 세포증식을 억제시키는 것으로 확인되었다. 이것은 pro-apoptotic 단백질인 Bcl-2와 그 이외의 알려지지 않은 여러 요인에 의한 세포사멸에 의한 것으로 사료된다.
- , 1999) PARP의 발현정도 또한 관찰하였다. 그 결과 정향피의 물 추출물은 PARP 기질을 85kD에서 분해시켜 세포사멸로 이끌어가는 것이 관찰되었다. 그리고 세포 사멸을 조절하는 세포 안밖의 여러 가지 인자들이 밝혀져 있는데, 그 중에서 Bcl-2 family 단백질들은 세포 사멸 촉진하거나(Bad, Bax) 억제하는 것(Bcl-2, Bcl-XL)으로 알려져 있으며, 이 단백질들이 서로 어떻게 결합하는가에 따라 세포사멸 억제 또는 촉진한다고 밝혀졌다(Burlacu, 2003).
- 4)에 비해 7정도의 증가가, 자궁습중량체중비율에서도 약 7의 비율 증가가 관찰되었다. 그러나 BPA와 정향피 물 추출물 병행 투여군에 있어서는 고농도 투여군(50mg/100g)과 저농도(10mg/100g) 투여군 모두 BPA 단독 투여군(53.36±4.31g)에 비해 질의 습중량이 유의적인 감소되는 것이 관찰되었다. 또한 질습중량/체중비율에서 저농도(10mg/10g)의 정향피 추출물을 BPA와 병행 투여하였을 때 BPA 투여군에 비해 유의적인 감소를 보였다.
- 5배 촉진시키는 것을 관찰할 수 있었다. 그러나 정향피의 물 추출물 100µg/ml과 동시에 처치하였을 때 BPA에 의한 세포의 성장은 오히려 무처치군의 83%에 이르는 등 BPA의 사람 유방암 세포에서 증식을 방어하는 효과를 보였다. 게다가 정향피의 물 추출물을 72시간 동안 단독으로 처치하였을 때 100µg/ml에서 무처치군과 비교하면 세포의 성장이 76%까지 감소하여 유방암의 억제능력 또한 가지고 있다고 사료되었다.
- 시험기간 동안 정향피 처치군과 BPA 단독 처치군 등 모든 개체에서 이상 증상이나 행동을 보이지 않았고 체중변화에 있어서도 각 투여군과 용매대조군 간의 유의성이 관찰되지 않았다. 그러나, 질의 습중량, 자궁의 습중량, 질습중량/체중비율, 자궁습중량/체중비율은 BPA 400mg/ 100g을 3일 동안 투여한 군은 용매대조군에 비해 통계학적 유의한 증가를 나타냈다. 이 결과는 Yamasaki et al.
- 이것은 pro-apoptotic 단백질인 Bcl-2와 그 이외의 알려지지 않은 여러 요인에 의한 세포사멸에 의한 것으로 사료된다. 그리고 미성숙랫드에 내분비계 장애물질인 BPA를 400 mg/100 g을 3일 동안 투여하면 체중의 변화는 없지만 질과 자궁의 유의적인 증가가 관찰되고, 정향피의 물 추출물 10 mg/100g을 BPA 400 mg/100g과 병행하여 투여하면 유의적으로 BPA의 독성을 억제 또는 방어해주는 것으로 확인되었다.
- 정향피의 물 추출물은 100µg/ml의 농도에서 단독으로 처치하였을 때, 16ng/ml의 BPA와 동시에 노출시켰을 때, 모두 육안적으로 유방암 세포의 proliferation이 줄어듬과 동시에 세포사멸이 일어나면서 핵의 분절이 관찰되었다. 따라서 정향피의 물 추출물은 사람의 유방암 세포의 사멸(apoptosis}을 유도하여 BPA에 의한 유방암에서의 생리활성을 저해하는 것으로 판단되어졌다.
- 47배 증가시키지만, 정향피의 물 추출물 100 ng/ml과 BPA를 동시에 처치하였을 때 세포의 성장은 현저하게 감소하여 BPA에 의한 유방암 세포에서 증식을 저하시켰다. 또한 정향피의 물 추출물을 사람의 유방암 세포에 단독으로 처치하였을 때, 100)ig/ml의 정향피가 무처치군과 비교하여 유방암 세포의 성장을 76%까지 감소하는 것으로 관찰되었다.
- 31g)에 비해 질의 습중량이 유의적인 감소되는 것이 관찰되었다. 또한 질습중량/체중비율에서 저농도(10mg/10g)의 정향피 추출물을 BPA와 병행 투여하였을 때 BPA 투여군에 비해 유의적인 감소를 보였다. 정향피 물 추출물을 단독으로 처치한 군에서는 질과 자궁의 습중량이 용매대조군에 비해 감소가 관찰되었으나 유의적이지 않고 정향피 투여용량과도 무관하므로 개체차에 의한 것이라 사료된다.
- BPA와 정향피 물 추출물 병행 투여군에 있어서는 고농도 투여군과 저농도 투여군 모두 BPA 단독 투여군에 비해 질의 습중량이 유의적인 감소되는 것이 관찰되었다. 또한 질습중량/체중비율에서 저농도의 정향피 추출물을 BPA와 병행 투여하였을 때 BPA 투여군에 비해 유의적인 감소를 보였다.
- 3을 보면 정향피의 물 추출물은 단독으로 처치했을 때와 BPA를 동시에 처치했을 때 모두 PARP 기질을 85kD에서 분해시켜 세포사멸로 이끌어가는 것이 관찰되었다. 또한, 세포사멸을 억제하는 Bcl-2의 발현을 감소시켜 BPA에 의한 MCF-7 세포의 증식억제와 세포사멸을 유도하는 것으로 판단되었다. 그러나 성장조절 인자인 p21과 세포사멸을 유도하는 Bax의 발현에는 변화가 없었다.
- 이것을 증명하기 위해서 정향피의 물 추출물이 BPA에 의해 증식된 유방암 세포에서 어떠한 기전으로 성장을 억제하고 세포의 proliferation이 감소하였는지를 알아보기 위하여 세포의 사멸 형태 중 가장 빈번히 발생하는 핵의 손상과 사멸을 알아보기 위한 방법으로서 대표적인 Hoechst 33258 staining을 실시하여 세포사멸을 관찰하였다. 스크리닝을 거쳐 탐색된 유방암 세포의 성장을 억제하는 정향피 물 추출물과 BPA를 48시간 처치 후 Hoechst 33258으로 염색하였더니 대조군과 유의적인 차를 보였다. 정향피의 물 추출물은 100µg/ml의 농도에서 단독으로 처치하였을 때, 16ng/ml의 BPA와 동시에 노출시켰을 때, 모두 육안적으로 유방암 세포의 proliferation이 줄어듬과 동시에 세포사멸이 일어나면서 핵의 분절이 관찰되었다.
- 위의 결과를 바탕으로 유방암 세포에서 뿐만 아니라 BPA와 정향피의 물 추출물을 미성숙랫드에 3일 동안 반복 투여하여 BPA가 미치는 독성을 평가하고, 이에 대한 정향피의 방어 또는 억제효과를 규명해보고자 하였다. 시험기간 동안 정향피 처치군과 BPA 단독 처치군 등 모든 개체에서 이상 증상이나 행동을 보이지 않았고 체중변화에 있어서도 각 투여군과 용매대조군 간의 유의성이 관찰되지 않았다. 그러나, 질의 습중량, 자궁의 습중량, 질습중량/체중비율, 자궁습중량/체중비율은 BPA 400mg/ 100g을 3일 동안 투여한 군은 용매대조군에 비해 통계학적 유의한 증가를 나타냈다.
- 정향피의 물 추출물이 BPA에 의해 증식된 유방암 세포에서 어떠한 기전으로 성장을 억제하고 세포의 proliferation이 감소하였는지를 알아보기 위하여 세포의 사멸의 특징 중인 핵의 손상을 관찰하기 위하여 같은 농도에서 48시간 정향피를 BPA와 처치한 후 Hoechst 33258 staining을 실시하였다. 염색 후, 정향피의 물 추출물은 100ug/ml의 농도에서 단독으로 처치하였을 때 (B)와 16ng/ml의 BPA와 동시에 노출시켰을 때 (C), 모두 육안적으로 유방암 세포의 proliferation이 줄어듬과 동시에 세포사멸이 일어나면서 핵의 분절이 관찰되었다(Fig. 2). 이상의 결과에서 사람의 유방암 세포에서의 유도된 BPA에 의한 세포증식을 정향피가 세포사멸을 통해 억제하는 것으로 확인할 수 있었다.
- 게다가 정향피의 물 추출물을 72시간 동안 단독으로 처치하였을 때 100µg/ml에서 무처치군과 비교하면 세포의 성장이 76%까지 감소하여 유방암의 억제능력 또한 가지고 있다고 사료되었다. 이러한 결과는 BPA가 에스트로젠과 유사한 작용을 하여 사람의 유방암 세포 증식을 유발하지만 정향피의 물 추출물은 이러한 독성기작을 저해하며 동시에 유방암 세포에 특이적으로 증식을 억제할 수 있는 활성성분을 가지고 있어 암세포의 사멸 또한 유도하는 것으로 생각되어졌다.
- 2). 이상의 결과에서 사람의 유방암 세포에서의 유도된 BPA에 의한 세포증식을 정향피가 세포사멸을 통해 억제하는 것으로 확인할 수 있었다.
- 그리고 세포 사멸을 조절하는 세포 안밖의 여러 가지 인자들이 밝혀져 있는데, 그 중에서 Bcl-2 family 단백질들은 세포 사멸 촉진하거나(Bad, Bax) 억제하는 것(Bcl-2, Bcl-XL)으로 알려져 있으며, 이 단백질들이 서로 어떻게 결합하는가에 따라 세포사멸 억제 또는 촉진한다고 밝혀졌다(Burlacu, 2003). 정향피의 물 추출물은 세포사멸을 억제하는 Bcl-2의 발현을 감소시켜 BPA에 의한 MCF-7 세포의 증식억제와 세포사멸을 유도하는 것으로 판단되었다. 그러나 성장조절 인자인 p21 과 세포사멸을 유도하는 Bax의 발현에는 변화가 없어 정향피 물 추출물의 작용기전에는 관계가 없는 것으로 사료된다.
- 30g)은 약 30g의 변화가 관찰되었다. 질습중량/체중비율에서도 용매대조군(6.79±2.4)에 비해 7정도의 증가가, 자궁습중량체중비율에서도 약 7의 비율 증가가 관찰되었다. 그러나 BPA와 정향피 물 추출물 병행 투여군에 있어서는 고농도 투여군(50mg/100g)과 저농도(10mg/100g) 투여군 모두 BPA 단독 투여군(53.
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