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문제 정의
- 이상의 연구와 같이 일부 천연색소는 색상을 띰과 동시에 약리적 작용이 인정되어 이미 식품 또는 염료로 활용되고 있고 대다수가 특정 색소의 원료를 소재로 하여 다양한 분야에서 기능성을 검증하고 있으나, 그 원료에서 추출한 색소 자체의 특성 및 생리적 기능성 등을 비교한 연구는 미미한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 천연색소 소재로 널리 이용되고 있는 정향, 감, 오배자, 황벽 외에도 치자(Gardenia, Gardenia jasminoides for. grandiflora), 홍화황(Safflower, Carthamus tinctorius L.) 및 아나토(Annatto, Bixa orellana L.) 7종의 색소를 이용하여 항산화 및 항비만 활성을 비교･분석함으로써 향후 이들 소재를 활용한 기능성 식품 개발에 대한 기초자료를 제공하고자 한다.
제안 방법
- 3T3-L1 세포가 confluent 한 상태가 되면 10% fetal bovine serum(FBS, Hyclone), 1 μM dexamethasone(Sigma-Aldrich Co.), 0.5 mM methylisobutylxanthine(IBMX, Sigma-Aldrich Co.), 10 μg/mL insulin(Gibco, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 포함하는 DMEM 배지로 교환한 후 3일 동안 지방세포 분화를 유도하였다.
- 5분간 실온에 방치하고 기질액 5 mM pNPG(p-nitrophenyl-α-glucopyrano-side) 50 μL를 가하여 37℃에서 5분간 반응시킨 후, 다시 405 nm에서 흡광도를 측정하여 흡광도 변화로부터 효소 저해 활성을 계산하였다.
- 96 well plate에 시료액 40 μL, FRAP 기질액 100 μL 및 증류수 40 μL를 차례로 혼합하여 37℃에서 4분간 반응시킨 후 593 nm에서 흡광도를 측정하였으며, ferrous sulfate를 표준물질로 하여 얻은 표준검량선으로부터 계산하였다.
- 25 mL를 첨가하여 37℃에서 20분간 진탕배양 하였다. Acetone 5 mL로 반응을 정지시킨 후 5% cupric acetate 1 mL를 첨가하여 혼합한 뒤 상온에서 정치하여 상층액 1 mL를 취해 720 nm에서 흡광도를 측정하여 대조군의 흡광도 값과 비교하여 저해율을 계산하였다.
- Lipase 저해 활성 측정: Lipase 저해 효과 측정은 Saisu-buramaniyan 등(27)의 방법을 변형하여 시료액 0.25 mL에 800 unit/mL lipase 0.5 mL와 0.05 M potassium phos-phate buffer(pH 6.5) 0.5 mL를 혼합하여 37℃에서 15분간 전 처리한 후 10%로 isooctane에 용해시킨 olive oil 1.25 mL를 첨가하여 37℃에서 20분간 진탕배양 하였다. Acetone 5 mL로 반응을 정지시킨 후 5% cupric acetate 1 mL를 첨가하여 혼합한 뒤 상온에서 정치하여 상층액 1 mL를 취해 720 nm에서 흡광도를 측정하여 대조군의 흡광도 값과 비교하여 저해율을 계산하였다.
- Triglyceride 함량은 triglyceride colorimetric assay kit(Cayman, Ann Arbor, MI, USA)을 이용하여 확인하였다. 세포는 PBS(pH 7.
- 그 후 2일 간격으로 10% FBS, 1% penicillin/streptomycin, 10 μg/mL의 insulin이 포함된 DMEM 배지를 이용하여 시료 추출물과 함께 처리한 다음 분화가 완성되는 시점에서 insulin을 포함하지 않은 DMEM 배지로 교환하여 분화시켰다.
- 그 후 5 mg/mL의 MTT 시약을 10 μL씩 처리하여 2시간 동안 배양시킨 후 상층액을 제거하고 dimethyl sulfoxide(DMSO, AMERSCO, Solon, OH, USA)를 100 μL 넣어 10분간 교반한 다음 570 nm에서 ELISA reader(Epoch, BioTek Instrument, Winooski, VT, USA)로 이용하여 흡광도를 측정하였다.
- 이때 각 blank로는 효소액 첨가 후 기질을 넣기 전에 DNS 발색시약을 먼저 넣은 것을 사용하였다. 반응액은 540 nm에서 흡광도를 측정하여 각 blank와의 차이를 구한 후 대조군과 비교하여 저해율을 계산하였다.
- 정향, 감, 오배자, 황벽, 치자, 홍화황 및 아나토와 같은 천연식물로부터 얻어진 색소 추출물의 항산화 및 항비만 활성을 비교･분석하였다. 총 페놀 함량은 오배자 추출물에서 2,441.
- 천연 식물 소재로부터 색소 성분을 분리하고 추출물을 제조하기 위하여 각각의 건조 시료 1 kg에 10 L의 물을 가한 후 catalase(BiotouchⓇCAT200, AB Enzymes, Rajamäaki, Finland) 및 alcalase(AlacalaseⓇ, Novozymes, Dittingen, Switzland)를 1% 농도로 첨가하고 45℃에서 10시간 동안 반응시킨 다음 80℃로 조절된 추출기(Cosmos660, Kyungseo, Incheon, Korea)를 이용하여 2시간 동안 추출하였다.
- 그 후 추출물을 여과하여 농축기(rotavapor R-220, BUCHI, Flawil, Switzerland)로 농축한 다음 분무건조기를 이용하여 분말화해 실험용 시료로 사용하였다. 추출물 제조에 사용된 건조 시료량 대비 완성 분말의 양(w/w)으로부터 추출 수율을 산정하였다.
- 용액 1 mL씩을 가한 다음 혼합하고 실온의 암실에서 1시간 정치하여 760 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로 gallic acid(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)를 사용하여 시료와 동일한 방법으로 분석하여 얻은 검량선으로부터 총 페놀 함량을 계산하였다.
대상 데이터
- 3T3-L1 세포배양 및 분화: 실험에 사용된 지방전구세포인 3T3-L1 세포는 American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA)에서 분양받아 10% bovine calf serum(BCS, Hyclone, Logan, UT, USA), 1% penicillin/streptomycin(Sigma-Aldrich Co.)을 첨가한 Dulbecco's modified Eagle medium(DMEM, Gibco, Grand Island, NY, USA) 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다.
- FRAP(ferric reducing antioxidant power)법에 의한 항산화 활성은 Benzie와 Strain(24)의 방법에 따라 300 mM acetate buffer(pH 3.6), 40 mM HCl에 용해한 10 mM TPTZ(2,4,6-tripyridyl-s-triazine) 용액 및 20 M ferric chloride를 각각 10:1:1(v/v/v)의 비율로 혼합하여 37℃의 수욕상에서 가온한 것을 FRAP 기질액으로 사용하였다. 96 well plate에 시료액 40 μL, FRAP 기질액 100 μL 및 증류수 40 μL를 차례로 혼합하여 37℃에서 4분간 반응시킨 후 593 nm에서 흡광도를 측정하였으며, ferrous sulfate를 표준물질로 하여 얻은 표준검량선으로부터 계산하였다.
- 천연색소 소재로 정향, 감, 오배자, 황벽, 치자, 홍화황 및 아나토는 한약건재상에서 건조된 것을 구입하여 시료로 사용하였다. 천연 식물 소재로부터 색소 성분을 분리하고 추출물을 제조하기 위하여 각각의 건조 시료 1 kg에 10 L의 물을 가한 후 catalase(BiotouchⓇCAT200, AB Enzymes, Rajamäaki, Finland) 및 alcalase(AlacalaseⓇ, Novozymes, Dittingen, Switzland)를 1% 농도로 첨가하고 45℃에서 10시간 동안 반응시킨 다음 80℃로 조절된 추출기(Cosmos660, Kyungseo, Incheon, Korea)를 이용하여 2시간 동안 추출하였다.
데이터처리
- 각 시료군에 대한 유의차 검정은 분산분석을 한 후 P<0.05 수준에서 Duncan's multiple range test에 따라 분석하였다.
- 각 실험은 3~5회 반복 실험한 결과에 대하여 SPSS 12.0(SPSS, Inc., Chicago, IL, USA)을 사용하여 통계처리 하였으며, 각각의 시료에 대해 평균±표준편차로 나타내었다.
이론/모형
- α-Glucosidase 저해 활성 측정: Watanabe와 Kawabata(25)의 방법에 따라 10 mg/mL 농도의 시료액 10 μL를 0.7 unit/mL α-glucosidase 효소액 50 μL와 혼합하여 405 nm에서 반응 전의 흡광도를 측정하였다.
- ABTS[2,2-azinobis-(3-ethylbenzo-thiazoline-6-sulphonate)] 라디칼 소거 활성은 Re 등(23)의 방법에 따라 7 mM의 ABTS 용액에 potassium persulfate를 2.4 mM이 되도록 용해시킨 다음 암실에서 12~16시간 동안 반응시킨 후 415 nm에서 흡광도가 1.5가 되도록 증류수로 조정한 ABTS 용액을 사용하였으며, ABTS 용액에 동량의 시료액을 혼합하여 실온에서 10분간 반응시켜 415 nm에서 흡광도를 측정하였다. 라디칼 소거 활성은 시료 무첨가구에 대한 시료 첨가구의 흡광도비로 계산하여 그 활성이 50% 감소되는 데 필요한 시료의 농도(inhibition concentration, IC50, μg/mL)로 표기하였다.
- DPPH 라디칼 소거 활성은 Blois(22)의 방법에 따라 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH)에 대한 전자공여 활성으로 나타내었다. 즉 추출물과 DPPH 용액(5 mg/100 mL methanol)을 동량으로 혼합한 다음 실온에서 20분간 반응시킨 후 525 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 세포독성 측정: 시료 추출물이 3T3-L1 세포의 생존율에 미치는 영향을 확인하기 위해 MTT(3-4,5-dimethylthia-zole-2-yl-2,5-di-phenyl-tetrazolium bromide) assay를 수행하였다. 96 well plate에 3T3-L1 세포를 5×104 cells/well 농도로 37℃, 5% CO2 조건에서 24시간 배양한 후 각 시료 추출물을 농도별(1~100 μg/mL)로 처리하여 24시간 동안 다시 배양하였다.
- 지방 축적율 및 triglyceride 함량 측정: 3T3-L1 세포 내 지방 축적율은 Oil Red-O staining법으로 측정하였다. 분화된 세포를 먼저 PBS로 세척한 다음 10% formalin으로 1시간 동안 고정하였다.
- 총 페놀 함량은 Folin-Denis법(21)에 따라 각 추출물 1 mL에 Foline-Ciocalteau 시약 1 mL를 넣고 3분 후 10% Na2CO3 용액 1 mL씩을 가한 다음 혼합하고 실온의 암실에서 1시간 정치하여 760 nm에서 흡광도를 측정하였다.
성능/효과
- α-Amylase 및 lipase에 대한 저해 활성 역시 감 추출물 처리 시 각각 49.45% 및 61.01%로 높은 활성을 보였다.
- α-Amylase에 대한 저해 활성은 감 추출물이 49.45%로 positive control로 사용한 acarbose(49.60%)와 유사한 수준으로 높은 저해 활성을 나타내었으며, 오배자와 정향 추출물은 각각 40.27% 및 31.91%로 acarbose보다는 낮은 수준이었다.
- α-Glucosidase에 대한 천연색소 추출물의 저해 활성을 IC50값으로 측정한 결과, 감 추출물이 22.83 μg/mL로 저해 효과가 가장 높았으며, 다음으로 오배자 추출물이 67.37 μg/mL,정향 추출물이 248.69 μg/mL 순이었다.
- 20 μg/mL 농도로 처리 시 3T3-L1 세포 내 지방 축적율은 감, 정향 및 아나토 추출물 처리군에서 각각 81.54%, 83.36% 및 85.70%로 대조군에 비해 유의적으로 낮았다.
- 20 μg/mL 농도로 처리 시 지방 축적율은 감 추출물이 81.54%, 아나토 추출물이 85.70%, 정향 추출물이 83.36%로 대조군에 비해 유의적으로 지방 축적이 감소됨을 확인하였다.
- 250 μg/mL 농도로 조절한 천연색소 추출물의 환원력을 FRAP법으로 측정한 결과, 오배자(1,016.42 μM) 및 정향(657.75 μM) 추출물의 활성이 타 시료에 비해 월등히 높았다.
- 3T3-L1 세포 내에 생성된 지방의 양을 정량적으로 평가하기 위해 염색된 지방을 추출하여 triglyceride 함량을 측정한 결과(Table 6), 지방 축적율과 유사한 경향으로 감 및 정향 추출물에서 triglyceride 함량이 유의적으로 감소되었는데, 특히 정향 추출물이 66.11%로 가장 낮았고 감 추출물은 88.88%로 나타났다. 그 외 추출물에서는 대조군과 비교하여 유의차가 없었다.
- ABTS 라디칼 소거 활성은 DPPH 라디칼 소거 활성과 유사한 경향으로 오배자 추출물의 IC50 값이 8.18 μg/mL로 라디칼 소거 활성이 가장 높았다.
- DPPH 라디칼 소거 활성은 오배자 추출물의 IC50 값이 20.50 μg/mL로 가장 높았으며, 다음으로 정향 추출물(28.36 μg/mL), 황벽 추출물(71.02 μg/mL)의 라디칼 소거 활성이 높았다.
- 48 mg/kg으로 높았다. DPPH와 ABTS 라디칼 소거 활성 및 환원력을 이용한 항산화 활성은 오배자 추출물에서 가장 높았다. α-Glucosidase에 대한 저해 활성은 감 추출물에서(IC50=22.
- 추출수율은 오배자, 정향, 치자가 30% 이상으로 높았으며, 감은 수율이 가장 낮아 4%에 불과하였다. Gallic acid를 기준물질로 하였을 때 천연색소 성분 중 총 페놀 화합물의 함량은 오배자 추출물에서 2,441.45 mg/kg으로 가장 높게 정량되었으며, 다음으로 정향 추출물에서 1,346.48 mg/kg으로 높았다. 감, 황벽 및 홍화황 추출물은 447.
- 각 추출물을 5 μg/mL 농도로 조절하여 처리 시 모든 시료에서 지방의 축적이 감소되는 효과를 보이지 않았으나, 각 추출물을 10 μg/mL 농도로 처리 시 감 추출물에서 87.91%로 대조군에 비해 지방 축적율이 유의적으로 낮았다.
- 그러나 본 연구에서는 페놀 함량 및 항산화 활성이 높았던 오배자와 정향 추출물보다는 감 추출물에서 높은 저해 활성을 나타내었는데, 감 추출물은 여타 추출물에 비해 α-glucosidase 저해 활성이 높고, α-amylase도 acarbose와 유사한 수준의 높은 저해 활성을 보였다.
- 대조군과 비교하여 각 시료 추출물을 1 μg/mL 농도로 처리 시 아나토 추출물을 제외하고는 88.95~98.17% 생존율을 보여 독성이 적은 것으로 나타났다.
- 아나토 추출물의 경우 5 μg/mL 농도 이상의 범위에서는 80% 미만으로 세포의 생존율이 크게 감소하는 경향이었고, 오배자 추출물도 10 μg/mL 농도 이상의 범위에서는 80% 미만으로 세포의 생존율이 감소하였는데, 특히 100 μg/mL 농도에서 아나토 및 오배자 추출물은 70.43% 및 71.92%로 시료 중 세포에 대한 독성이 다른 시료에 비해 상대적으로 높았다.
- 천연색소 추출물의 pancreatic lipase 저해 활성을 측정한 결과 감 추출물이 61.01%로 가장 높은 활성을 나타내었고, 다음으로 오배자 추출물이 46.69%, 아나토 추출물이 32.91% 순이었다. 치자와 정향 추출물은 20% 미만으로 활성이 낮았다.
- 88%로 유의적으로 낮았다. 천연식물류로부터 추출한 색소 원료 중 오배자 추출물이 높은 항산화 활성을 나타내었으며, 감 추출물은 소화효소 저해 활성과 3T3-L1 세포 내의 지방 축적 억제 효과를 가짐으로써 항비만 활성을 나타내는 것으로 판단된다.
- 정향, 감, 오배자, 황벽, 치자, 홍화황 및 아나토와 같은 천연식물로부터 얻어진 색소 추출물의 항산화 및 항비만 활성을 비교･분석하였다. 총 페놀 함량은 오배자 추출물에서 2,441.45 mg/kg으로 가장 높았고, 다음으로 정향 추출물에서 1,346.48 mg/kg으로 높았다. DPPH와 ABTS 라디칼 소거 활성 및 환원력을 이용한 항산화 활성은 오배자 추출물에서 가장 높았다.
- 7종의 천연식물 유래 색소 소재의 추출수율 및 총 페놀 화합물의 함량을 측정한 결과는 Table 1과 같다. 추출수율은 오배자, 정향, 치자가 30% 이상으로 높았으며, 감은 수율이 가장 낮아 4%에 불과하였다. Gallic acid를 기준물질로 하였을 때 천연색소 성분 중 총 페놀 화합물의 함량은 오배자 추출물에서 2,441.
- 치자 및 황벽 추출물은 11% 이하로 활성이 낮았으며, 홍화황 추출물은 α-amylase에 대한 저해 활성이 없는 것으로 나타났다.
후속연구
- 본 실험 결과 감 추출물과 정향 추출물은 3T3-L1 지방세포에 대하여 독성이 없으며 지방세포 분화 시 관찰되는 지방의 축적율과 지방세포 내의 triglyceride 함량도 억제시키는 것으로 확인되어 비만을 예방하는 데 도움을 줄 것으로 사료되나, 이와 관련된 전사 인자 및 단백질 발현에 관련된 연구는 좀 더 진행되어야 할 것으로 생각된다.
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