[국내논문]마우스 수정란의 초기 배 발생단계별 Telomeric DNA의 양적 분석과 Telomerase 활성도 분석 Analysis of the Amount of Telomeric DNA and Telomerase Activity on Preimplantation Mouse Embryoic Cells원문보기
텔로미어란 염색체 말단부에 (TTAGGG)n의 반복 염기서열이 단백질과 결합된 형태를 말하는데 이의 역할은 염색체의 안정성에 본질적으로 작용하여 세포의 노화, 사멸 및 암의 발생과 관련이 있다고 알려져 있다. 반면 텔로머레이스는 telomeric DNA 합성에 직접 관여하는 ribonucleoprotein이다. 본 연구에서는 마우스 염색체의 텔로미어 분포 양상을 제시하고, 초기 배 발생단계별 수정란의 텔로미어 함량과 이들 수정란의 텔로머레이스 활성도를 분석하고자 하였다. 본 분석에는 마우스의 섬유아세포, 생식세포, 정자, 난자 및 1세포기, 2세포기, 4세포기, 8세포기, 상실배와 배반포배의 각 단계별 수정란을 대상으로 하였다. 텔로미어의 양적 분석은 human telomeric DNA probe를 이용한 Q-FISH 방법을 이용하였고, 텔로머레이스 활성도는 TRAP 방법을 이용하였다. 분석 결과 마우스 염색체의 텔로미어는 성 염색체를 포함한 모든 염색체의 앙 말단부에 분포되어 있고, 염색체별 다소의 양적 차이를 보이나 대부분의 염색체에서 q-arm 말단이 p-arm 말단에 비해 높은 텔로미어의 함량을 나타내었다. Q-FISH를 이용한 마우스 초기 배 발생단계별 수정란의 텔로미어의 양적 분석에서 수정 직후 1세포기에서부터 상실배까지 거의 비슷한 텔로미어 함유율을 나타내고 있으나 배반포기에서 월등히 증가된 양상을 나타내었다. TRAP 분석을 이용한 초기배아의 텔로머레이스 활성도는 초기 배 발생 모든 단계에서 이의 활성도를 나타내었으며, 특히 상실배 및 배반포기에서 점진적으로 강한 활성을 보였다. 이상의 분석 결과로부터 마우스의 초기 배 분열단계의 각 세포들에 있어 텔로미어의 함유율과 텔로머레이스 활성도는 높은 상관관계가 있는 것으로 나타났다. 따라서 포유동물의 초기 배자에 있어 텔로미어의 함유율과 텔로머레이스 활성도는 배 발생 및 배자의 세포 분화와 매우 밀접한 관련이 있는 것으로 사료되어 텔로미어의 양적 분석 및 텔로머레이스 활성도 분석은 발생학적 연구를 위한 또 다른 좋은 자료로 생각된다.
텔로미어란 염색체 말단부에 (TTAGGG)n의 반복 염기서열이 단백질과 결합된 형태를 말하는데 이의 역할은 염색체의 안정성에 본질적으로 작용하여 세포의 노화, 사멸 및 암의 발생과 관련이 있다고 알려져 있다. 반면 텔로머레이스는 telomeric DNA 합성에 직접 관여하는 ribonucleoprotein이다. 본 연구에서는 마우스 염색체의 텔로미어 분포 양상을 제시하고, 초기 배 발생단계별 수정란의 텔로미어 함량과 이들 수정란의 텔로머레이스 활성도를 분석하고자 하였다. 본 분석에는 마우스의 섬유아세포, 생식세포, 정자, 난자 및 1세포기, 2세포기, 4세포기, 8세포기, 상실배와 배반포배의 각 단계별 수정란을 대상으로 하였다. 텔로미어의 양적 분석은 human telomeric DNA probe를 이용한 Q-FISH 방법을 이용하였고, 텔로머레이스 활성도는 TRAP 방법을 이용하였다. 분석 결과 마우스 염색체의 텔로미어는 성 염색체를 포함한 모든 염색체의 앙 말단부에 분포되어 있고, 염색체별 다소의 양적 차이를 보이나 대부분의 염색체에서 q-arm 말단이 p-arm 말단에 비해 높은 텔로미어의 함량을 나타내었다. Q-FISH를 이용한 마우스 초기 배 발생단계별 수정란의 텔로미어의 양적 분석에서 수정 직후 1세포기에서부터 상실배까지 거의 비슷한 텔로미어 함유율을 나타내고 있으나 배반포기에서 월등히 증가된 양상을 나타내었다. TRAP 분석을 이용한 초기배아의 텔로머레이스 활성도는 초기 배 발생 모든 단계에서 이의 활성도를 나타내었으며, 특히 상실배 및 배반포기에서 점진적으로 강한 활성을 보였다. 이상의 분석 결과로부터 마우스의 초기 배 분열단계의 각 세포들에 있어 텔로미어의 함유율과 텔로머레이스 활성도는 높은 상관관계가 있는 것으로 나타났다. 따라서 포유동물의 초기 배자에 있어 텔로미어의 함유율과 텔로머레이스 활성도는 배 발생 및 배자의 세포 분화와 매우 밀접한 관련이 있는 것으로 사료되어 텔로미어의 양적 분석 및 텔로머레이스 활성도 분석은 발생학적 연구를 위한 또 다른 좋은 자료로 생각된다.
Telomeres consisting of (TTAGGG)n tandem repeat DNA sequences and associated proteins are essential for chromosome stability and related with cell senescence, apoptosis and cancer. The telomerase is a ribonucleoprotein which act as a template for the synthesis of telomeric DNA. This study was carrie...
Telomeres consisting of (TTAGGG)n tandem repeat DNA sequences and associated proteins are essential for chromosome stability and related with cell senescence, apoptosis and cancer. The telomerase is a ribonucleoprotein which act as a template for the synthesis of telomeric DNA. This study was carried out to identify the distribution of telomeres on mouse chromosomes and also to analyze the amount of telomeres and telomerase activity of mouse embryos at early embryonic stages. Germ cells and early embryos from 1 cell to blastocyst stage were analyzed. The amount of telomeres was analyzed by quantitative fluorescence in situ hybridization technique(Q-FISH) using a human telomeric DNA probe, and telomerase activity was measured by telomeric repeat amplification protocol assay(TRAP). In results, the telomeres on mouse chromosomes were distributed at the ends of all autosomes and sex chromosomes. Although the quantity of telomeres varied among chromosomes, most of chromosomes had higher amount in q-arm telomeres than in p-arm telomeres. The results of Q-FISH indicated that the relative amount of telomeres of mouse embryos in each embryonic stage was approximately the same except the higher amount in blastocysts. Using TRAP assay on mouse embryos, telomerase activity was detected in all preimplantation stages from mature oocytes to blastocysts. Especially the telomerase activity was significantly increased at the morula and blastocyst stage. In conclusion, there may be a close association between the amount of telomeres and telomerase activity in early embryonic stages, and analysis of telomere quantity and telomerase activity on early development will be helpful for the investigation of embryogenesis and embryonic cell differentiation in mice.
Telomeres consisting of (TTAGGG)n tandem repeat DNA sequences and associated proteins are essential for chromosome stability and related with cell senescence, apoptosis and cancer. The telomerase is a ribonucleoprotein which act as a template for the synthesis of telomeric DNA. This study was carried out to identify the distribution of telomeres on mouse chromosomes and also to analyze the amount of telomeres and telomerase activity of mouse embryos at early embryonic stages. Germ cells and early embryos from 1 cell to blastocyst stage were analyzed. The amount of telomeres was analyzed by quantitative fluorescence in situ hybridization technique(Q-FISH) using a human telomeric DNA probe, and telomerase activity was measured by telomeric repeat amplification protocol assay(TRAP). In results, the telomeres on mouse chromosomes were distributed at the ends of all autosomes and sex chromosomes. Although the quantity of telomeres varied among chromosomes, most of chromosomes had higher amount in q-arm telomeres than in p-arm telomeres. The results of Q-FISH indicated that the relative amount of telomeres of mouse embryos in each embryonic stage was approximately the same except the higher amount in blastocysts. Using TRAP assay on mouse embryos, telomerase activity was detected in all preimplantation stages from mature oocytes to blastocysts. Especially the telomerase activity was significantly increased at the morula and blastocyst stage. In conclusion, there may be a close association between the amount of telomeres and telomerase activity in early embryonic stages, and analysis of telomere quantity and telomerase activity on early development will be helpful for the investigation of embryogenesis and embryonic cell differentiation in mice.
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문제 정의
따라서 본 연구에서는 우선 마우스 염색체의 텔로미어 분포 양상을 제시하고, 양적 형광접합보인법(quantitative fluorescence in situ hybridization; Q-FISH)을 이용하여 이들의 생식세포 및 초기 배 발생 단계별 수정란의 telomeric DNA 함유량을 분석하며, telomeric repeat amplification protocol(TRAP) 방법으로서 발생 단계별 배자들의 텔로머레이스 활성도를 구명하고자 한다.
제안 방법
5㎕(1mg/㎕)를 섞어 종량이 50㎕이 되게 하였다. PCR은 30℃ 에 서 30분간 TS-telomerase product를 확장시킨 다음 94℃' 30초, 59℃ 30초, 72℃에서 30초간 3단계로 35 사이클을 시행하였다. 증폭된 텔로머레이스는 15% polyacryla mide 겔 전기영동을 통해 75V에 이어 100V에서 2시간 동안 실시하고 ethidium bromide로 염색한 후 결과를 관찰하였다.
수정란을 이용한 표본제작 과정은 손 등(1996) 및 Han 등(2004)이 제시한 방법을 기본으로 다음과 같이 실시하였다. 각 발생 단계별로 채취한 수정란은 D-PBS(Gibco, Invi- trogen Corp., Grand Island, NY, USA)에서 한 번 세척하고, 0.9% sodium citrate에서 1분간 저장처리를 하였다. 이후 0.
Louis, MO, USA)용액을 1:1로 희석한 저장액으로 6분간 저장처리 하였다. 고정처리는 acetic acid와 methanol(l:3, v/v)로서 3회 반복 처리하고, 고정된 세포액 3~4방울을 슬라이드에 떨어뜨려 표본 제작하였다.
마우스는 온도와 명암이 조절되는 곳에서 실험에 사용될 때까지 사육하였으며, 명암의 주기는 14시간:10시간으로 조절하였고, 사료와 물을 무제한으로 급여하였다. 과배란을 유도하기 위하여 암컷 마우스에 5IU의 PMSG(Folligon® Inter vet, Netherland) 와 hCG(Oiorulon®, Intervet, Nether- land)를 48시간 간격으로 복강 주사한 후 수컷과 동숙시켰다. 다음날 질전이 확인된 것을 수정이 되었다고 판단하여 경추 탈구법으로 도살한 다음, 1-세포기, 2-세포기, 4-세포기 및 8-세포기는 수정 후 각 1, 2, 3일째 난관 관류에 의해 수정란을 회수하였으며, 상실배(morula)와 배반포(blasto cyst) 는 수정 후 4일째 자궁관류에 의해 수정란을 회수하였다.
과배란을 유도하기 위하여 암컷 마우스에 5IU의 PMSG(Folligon® Inter vet, Netherland) 와 hCG(Oiorulon®, Intervet, Nether- land)를 48시간 간격으로 복강 주사한 후 수컷과 동숙시켰다. 다음날 질전이 확인된 것을 수정이 되었다고 판단하여 경추 탈구법으로 도살한 다음, 1-세포기, 2-세포기, 4-세포기 및 8-세포기는 수정 후 각 1, 2, 3일째 난관 관류에 의해 수정란을 회수하였으며, 상실배(morula)와 배반포(blasto cyst) 는 수정 후 4일째 자궁관류에 의해 수정란을 회수하였다.
마우스 수정란의 초기 배 발생 단계별 telomeric DNA의 함량분석을 위하여 2-세포기에서부터 배반포기까지 초기 배를 대상으로 각 배자의 할구를 이용하여 핵 내 텔로미어의 함량을 Q-FISH로서 분석하였다. 이를 위하여 우선 각 단계별 26〜78개의 수정란으로부터 할구를 분리하여 표본 제작을 하고, 이들에 대하여 telomeric DNA probe로서 FISH를 수행한 후 각 발생 단계별 FISH 상을 획득하였다.
마우스 염색체의 텔로미어 분포양상을 제시하기 위하여 마우스의 섬유아세포로부터 중기상 염색체를 획득하고 이에 telomeric DNA probe를 이용한 FISH를 수행하였다. Fig.
본 연구에 이용된 공시동물은 진주산업대학교 실험동물 사육장에서 사육중인 ICR 계통의 마우스로써 암컷은 생후 4〜6주령, 수컷은 9〜15주령 개체들을 이용하였다. 마우스는 온도와 명암이 조절되는 곳에서 실험에 사용될 때까지 사육하였으며, 명암의 주기는 14시간:10시간으로 조절하였고, 사료와 물을 무제한으로 급여하였다. 과배란을 유도하기 위하여 암컷 마우스에 5IU의 PMSG(Folligon® Inter vet, Netherland) 와 hCG(Oiorulon®, Intervet, Nether- land)를 48시간 간격으로 복강 주사한 후 수컷과 동숙시켰다.
5°C에서 10분간 배양하였다. 배경 염색으로는 propidium io dide solution을 이용하였으며, 형광접합 발현양상은 523nm 파장대의 필터를 부착한 형광현미경(Olympus AX-70, To kyo, Japan)으로 검경하고, 분석 표본당 최소 50여 개의 상을 디지탈 이미지로 획득하였다(Olympus DP-70 digital camera, Tokyo, Japan). 저장된 각각의 상은 화상분석프로그램 (MetaMorph Imaging System, Universal Imaging Co, PA, USA)을 이용하여 텔로미어의 양을 정량 분석하였다.
, Grand Island, NY, USA)를 주입하고 배양 종료 후 scraper를 이용하여 세포만을 회수 하였다. 분리된 세포에 0.4% sodium citrate 용액과 0.4% KC1(이상 Sigma Chem., St. Louis, MO, USA)용액을 1:1로 희석한 저장액으로 6분간 저장처리 하였다. 고정처리는 acetic acid와 methanol(l:3, v/v)로서 3회 반복 처리하고, 고정된 세포액 3~4방울을 슬라이드에 떨어뜨려 표본 제작하였다.
현미경 하에서 수정란을 관찰하며 me thanol 3: acetic add 1로 조성된 고정액으로 할구를 분리 시켰다. 이를 다시 2차 고정처리액으로 20분간 침지한 후 건조시켜 위상차 현미경을 이용하여 세포의 유무를 확인한 후 실험에 공시하였다.
마우스 수정란의 초기 배 발생 단계별 telomeric DNA의 함량분석을 위하여 2-세포기에서부터 배반포기까지 초기 배를 대상으로 각 배자의 할구를 이용하여 핵 내 텔로미어의 함량을 Q-FISH로서 분석하였다. 이를 위하여 우선 각 단계별 26〜78개의 수정란으로부터 할구를 분리하여 표본 제작을 하고, 이들에 대하여 telomeric DNA probe로서 FISH를 수행한 후 각 발생 단계별 FISH 상을 획득하였다. 획득한 개개의 상은 이미지 분석 프로그램을 이용하여 핵 대비 텔로미어의 분포비를 분석하고 각 발생 단계별 배자들의 평균값으로 이들의 상대적 함량을 제시하였다.
준비된 슬라이드 표본을 50㎕ RNase A (100mg/㎖가 함유된 2xSSC 용액에 넣고 37°C의 항온 수조에서 30분간 처리하여 RNA를 제거한 후 초자수로 세척하 고 80%, 90%, 100% 에탄올로 탈수시켜 상온에서 건조시켰다. 이후 본 실험실에서 제작한 Dig-labelled human telo meric DNA probe를 이용하여 hybridization 용액(13㎕ formamide, 5 ㎕ 4 x hybridization solution 및 telomeric DNA probe 2 ㎕ (400 ng/㎕), 이상 Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN, USA)을 만든 후 슬라이드에 떨어뜨리고 coverslip으로 덮은 후 고무풀로 밀봉하였다. 이를 85°C에서 5분간 처리하여 프로브(probe)와 표본을 변성시키고, 다시 38.
배경 염색으로는 propidium io dide solution을 이용하였으며, 형광접합 발현양상은 523nm 파장대의 필터를 부착한 형광현미경(Olympus AX-70, To kyo, Japan)으로 검경하고, 분석 표본당 최소 50여 개의 상을 디지탈 이미지로 획득하였다(Olympus DP-70 digital camera, Tokyo, Japan). 저장된 각각의 상은 화상분석프로그램 (MetaMorph Imaging System, Universal Imaging Co, PA, USA)을 이용하여 텔로미어의 양을 정량 분석하였다.
형광접합보인법 (Fluorescence in situ Hybridization; FISH)은 Kobayashi 등(1998)이 수행한 방법을 다소 변형하여 시행하였다. 준비된 슬라이드 표본을 50㎕ RNase A (100mg/㎖가 함유된 2xSSC 용액에 넣고 37°C의 항온 수조에서 30분간 처리하여 RNA를 제거한 후 초자수로 세척하 고 80%, 90%, 100% 에탄올로 탈수시켜 상온에서 건조시켰다. 이후 본 실험실에서 제작한 Dig-labelled human telo meric DNA probe를 이용하여 hybridization 용액(13㎕ formamide, 5 ㎕ 4 x hybridization solution 및 telomeric DNA probe 2 ㎕ (400 ng/㎕), 이상 Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN, USA)을 만든 후 슬라이드에 떨어뜨리고 coverslip으로 덮은 후 고무풀로 밀봉하였다.
, Grand Island, NY, USA)-!- 이용하여 세포들을 분리하고 일정량을 분주하여 3회 계대배양하였다. 중기상 유도를 위하여 배양 종료 1시간 전에 colcemid 0.2 ㎍/㎖(Gibco, Invitrogen Corp., Grand Island, NY, USA)를 주입하고 배양 종료 후 scraper를 이용하여 세포만을 회수 하였다. 분리된 세포에 0.
PCR은 30℃ 에 서 30분간 TS-telomerase product를 확장시킨 다음 94℃' 30초, 59℃ 30초, 72℃에서 30초간 3단계로 35 사이클을 시행하였다. 증폭된 텔로머레이스는 15% polyacryla mide 겔 전기영동을 통해 75V에 이어 100V에서 2시간 동안 실시하고 ethidium bromide로 염색한 후 결과를 관찰하였다.
01N HC1에서 투명대가 완전히 녹아내릴 때까지 약 20초〜1분간 처리 후 수정란을 슬라이드 중앙으로 옮겼다. 현미경 하에서 수정란을 관찰하며 me thanol 3: acetic add 1로 조성된 고정액으로 할구를 분리 시켰다. 이를 다시 2차 고정처리액으로 20분간 침지한 후 건조시켜 위상차 현미경을 이용하여 세포의 유무를 확인한 후 실험에 공시하였다.
형광접합보인법 (Fluorescence in situ Hybridization; FISH)은 Kobayashi 등(1998)이 수행한 방법을 다소 변형하여 시행하였다. 준비된 슬라이드 표본을 50㎕ RNase A (100mg/㎖가 함유된 2xSSC 용액에 넣고 37°C의 항온 수조에서 30분간 처리하여 RNA를 제거한 후 초자수로 세척하 고 80%, 90%, 100% 에탄올로 탈수시켜 상온에서 건조시켰다.
이를 위하여 우선 각 단계별 26〜78개의 수정란으로부터 할구를 분리하여 표본 제작을 하고, 이들에 대하여 telomeric DNA probe로서 FISH를 수행한 후 각 발생 단계별 FISH 상을 획득하였다. 획득한 개개의 상은 이미지 분석 프로그램을 이용하여 핵 대비 텔로미어의 분포비를 분석하고 각 발생 단계별 배자들의 평균값으로 이들의 상대적 함량을 제시하였다. 초기 배 발생단계별 각 세포의 telomeric DNA의 상대적 함량비는 Table 1과 같다.
대상 데이터
마우스의 염색체 표본 제작을 위하여 섬유아세포(fibro blast) 배양을 실시하였다. 섬유아 세포는 신장조직으로부터 분리하고 세절된 세포 조직들을 Medium-199을 기본 배양액으로 하여 10% FBS, 1% Penicillin-streptomycm(10,000 U/㎖~ 10,000 ㎍/㎖)(이상 Gibco, Invitrogen Corp.
본 연구에 이용된 공시동물은 진주산업대학교 실험동물 사육장에서 사육중인 ICR 계통의 마우스로써 암컷은 생후 4〜6주령, 수컷은 9〜15주령 개체들을 이용하였다. 마우스는 온도와 명암이 조절되는 곳에서 실험에 사용될 때까지 사육하였으며, 명암의 주기는 14시간:10시간으로 조절하였고, 사료와 물을 무제한으로 급여하였다.
이론/모형
마우스의 생식세포 및 초기배아세포에 대한 텔로머레이스 활성도를 TRAP 방법으로 분석하였다.
수정란을 이용한 표본제작 과정은 손 등(1996) 및 Han 등(2004)이 제시한 방법을 기본으로 다음과 같이 실시하였다. 각 발생 단계별로 채취한 수정란은 D-PBS(Gibco, Invi- trogen Corp.
텔로머레이스 활성도 분석은 Kim과 Wu(1997)가 제시한 telomeric repeat amplification protocol(TRAP) 방법으로 상업용 telomerase detection kit(TRAPEZE®, Intergen Co., Purchase, NY, USA)> 이용하여 제조사의 지침에 따라 다음과 같이 실시하였다. 분석할 조직들은 3-cholamido- propyl dimethylammonio-l-propane-sulfanate(CHAPS) lysis buffer를 이용하여 단백질을 분리하고, 30분 동안 얼음 위에 정치시켰다.
성능/효과
이들은 BALB/c, C57BL/6, C3H, 129 및 DBA/2 inbred line을 이용하여 골수 및 피부 섬유아세포 배양으로 염색체를 분리하고 개개 염색체의 텔로미어 길이를 분석하였다. Q-FISH 분석 결과 각 종간 텔로미어 길이의 다형성이 나타났고, 개개 염색체간에도 p-arm 말단부와 q-arm 말단부간 텔로미어 함유량의 차이를 보였으나, 개체 및 분리 세포와 상관없이 거의 대부분의 염색체에서 q-arm 말단부의 분포량이 많음을 보고하였다. 특히 특정 염색체에서의 텔로미어 길이는 섬유아세포와 골수세포에서 공히 동일한 양상을 보여 동일 개체 내 체세포간에는 텔로미어의 분포량이 유사함을 제시하였다.
이러한 배반포기에서 telomeric DNA의 양적 증가는 본 연구에서 분석된 텔로머레이스의 활성도와 매우 밀접한 관련이 있는 것으로 나타났는데 마우스 수정란의 2세포기부터 배반포기까지 초기 배 발생 단계별 모든 단계에서 텔로머레이스의 활성도를 보였으며, 특히 상실배에서부터 보다 높은 활성도를 나타내었다. 따라서 상실배기 이후 배반포기에서 telomeric DNA의 유의적 증가는 텔로머레이스의 높은 활성도에 기인된 것으로 생각되고, 이러한 현상은 본 단계에서 조직의 분화와 관련되어 보다 높은 세포의 활성화가 요구되기 때문이 아닌가 사료된다.
특히 특정 염색체에서의 텔로미어 길이는 섬유아세포와 골수세포에서 공히 동일한 양상을 보여 동일 개체 내 체세포간에는 텔로미어의 분포량이 유사함을 제시하였다. 본 연구는 신장조직으로부터 섬유아세포를 배양하여 염색체를 분리하고 이들에 대한 QFISH를 수행한 것으로 분석 결과 개체간 텔로미어 함유량의 다형성이나 개체내 세포간 유사성 등은 상기 보고와 거의 동일한 결과이다. 그러나 마우스 염색체상 텔로미어의 분포에 있어 interstitial telomeric DNA의 존재는 연구자들 간에 다소의 이견이 있다.
3-c는 마우스 수정란의 2세포기부터 배반포기까지 의 초기 배 발생 단계별 배자의 텔로머레이스 활성도를 나타낸 것이다. 분석 결과 모든 단계에서 텔로머레이스의 활성도를 보였으며, 특히 상실배에서부터 보다 높은 활성도를 나타내었다. 초기배자의 텔로머레이스 활성도는 수정란의 높은 증식성과 관련된 것으로 상실배와 배반포 단계에서 텔로머레이스의 강한 활성은 연이은 조직의 분화와 밀접한 관련이 있는 것으로 사료되며 또한 본 발생 시점에서 전체 세포수가 급격히 증가된 것이 주된 요인으로 생각된다.
본 그림에서 가장 아래의 ladder는 primer-dimer로 36 bp(substrate in- temal control; S-IC)이며, 그 윗 ladder는 50 bp를 가리키며 텔로머레이스의 활성도가 증가함에 따라 여기서부터 ladder증이 증가하게 되는데 한 ladder가 늘어날 때마다 6 bp씩 telomeric DNA의 증가를 의미한다. 분석 결과 재생 능력이 있는 증식성 세포인 정소에서는 예상했던 바와 같이 텔로머레이스의 활성이 강하게 나타났고, 뿐만 아니라 체세포인 신장과 혈액 세포에서도 강한 텔로머레이스의 활성도를 보였다. 이는 대부분의 포유동물의 체세포에서는 텔로머레이스의 활성이 없는 것으로 보고된 경우와 달리, 마우스의 경우는 특이적으로 체세포에서도 텔로머레이스의 활성이 지속되게 나타난다는 연구 결과와 일치함을 확인하였다(Starling 등, 1990; Kipling, 1997; Zijlmans 등, 1997; Weng과 Hodes, 2000; Dolci 등, 2002).
36%로 배 발생단계에 있어 상실배까지는 일정한 함유량을 보이다가, 배반포기에서 유의적으로 telomeric DNA의 양적 증가를 나타내었다. 이러한 배반포기에서 telomeric DNA의 양적 증가는 본 연구에서 분석된 텔로머레이스의 활성도와 매우 밀접한 관련이 있는 것으로 나타났는데 마우스 수정란의 2세포기부터 배반포기까지 초기 배 발생 단계별 모든 단계에서 텔로머레이스의 활성도를 보였으며, 특히 상실배에서부터 보다 높은 활성도를 나타내었다. 따라서 상실배기 이후 배반포기에서 telomeric DNA의 유의적 증가는 텔로머레이스의 높은 활성도에 기인된 것으로 생각되고, 이러한 현상은 본 단계에서 조직의 분화와 관련되어 보다 높은 세포의 활성화가 요구되기 때문이 아닌가 사료된다.
Q-FISH 분석 결과 각 종간 텔로미어 길이의 다형성이 나타났고, 개개 염색체간에도 p-arm 말단부와 q-arm 말단부간 텔로미어 함유량의 차이를 보였으나, 개체 및 분리 세포와 상관없이 거의 대부분의 염색체에서 q-arm 말단부의 분포량이 많음을 보고하였다. 특히 특정 염색체에서의 텔로미어 길이는 섬유아세포와 골수세포에서 공히 동일한 양상을 보여 동일 개체 내 체세포간에는 텔로미어의 분포량이 유사함을 제시하였다. 본 연구는 신장조직으로부터 섬유아세포를 배양하여 염색체를 분리하고 이들에 대한 QFISH를 수행한 것으로 분석 결과 개체간 텔로미어 함유량의 다형성이나 개체내 세포간 유사성 등은 상기 보고와 거의 동일한 결과이다.
후속연구
이들은 염색체뿐만 아니라 간기 세포 내 텔로미 어의 길이 측정이 가능하며, 다양한 세포에 적용하여 보다 빠르고 정밀한 텔로미어의 양적 분석이 가능하다고 알려져 있다(Slijepcevic, 2001). 이와 같이 세포 내 텔로미어의 양적 분석법이 널리 알려져 있음에도 불구하고 수정란이나 발생 조직의 세포 내 텔로미어의 함량은 거의 보고된 바가 없으며, 더욱이 초기 배자 상태의 발생 단계별 배자내 텔로미어의 함량 분석은 본 연구가 처음인 것으로 사료되어 이에 대한 부가적인 양적 분석에 관한 연구들이 요망된다.
참고문헌 (46)
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