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문제 정의
- 최근 텔로미어의 길이와 텔로머레이스의 활성에 대한 많은 연구들은 광범위하게 진행되어 왔지만 닭에서는 매우 제한적으로 연구되어왔다. 따라서 본 연구에서는 한국 재래닭에서 발육, 성장 및 노화 단계별 간, 뇌, 심장, 신장, 정소 및 백혈구 세포에 대한 텔로미어의 양 적 분포와 텔로머레이스 활성도를 분석 고찰하고자 하였다. 텔로미어의 함량 분석은 telomeric DNA probe를 이용하여 Q-FISH 법으로 수행하였고, 텔로머레이스 활성도 분석은 TRAP 방법을 이용하였다.
- 따라서, 본 연구에서는 닭의 세포 분화 및 세포 활성의 특이성과 개체의 발육, 성장 및 노화의 생물학적 특성을 구명하고자 한국 재래닭을 대상으로 발생에서부터 생산수명에 이르기까지 주령별 각 조직에 대한 세포들의 텔로미어의 함량을 Qualitative Fluorescence in situ Hybridization(Q-FISH) 방법으로 분석하고, 텔로머레이스의 활성도를 telomeric repeat amplification protocol(TRAP) 방법으로 분석 제시하였다.
- 분석 방법은 RGB의 intensity를 이용하여 PI의 적색(red) 대비 FITC의 녹색(green)의 상대적 비를 계산하는 것이다. 즉, 배경 염색에 이용된 PI는 핵 물질 전체를 나타내고, 핵 내 FITC의 형광 sigale telomeric DNA의 접합 양상을 나타내는 것으로 이들의 상대적 비로텔로미어의 함량을 간접적으로 분석하는 것이다.
제안 방법
- FISH용 probe 제작을 위하여 (CCCTAA)으로 구성된 42 mers 단일 oligomers를 primer로 이용하여 Polymerase Chain Reartion(PCR) 을 수행하고 이의 증폭된 산물을 PCR-DIG Probe Synthesis Kit(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN, USA)로서 digoxigenin labeling을 하였다.
- 개체의 각 조직들로부터 세포 표본을 제작하기 위하여 발생시, 10주령, 30주령, 60주령 및 120주령 각 10수씩 도살하여 간, 뇌, 심장, 신장 및 정소조직을 채취하였다. 채취한 조직은 D-PBS(Gibco, Invitrogen Corp.
- 닭의 성장, 발육 및 노화 단계별 텔로미어 양적 분석과 텔로머레이스 활성도 분석을 .위하여 진주산업대학교 종합농장에서 사육중인 한국 재래계 황갈색 계통 암수 100수를 이용하였다.
- 1 kb가 길었다는 보고를 재 입증하는 결과라 할 수 있겠다. 따라서 증식성 세포로 알려진 정소 조직과 비 증식성 세포인간, 뇌, 심장 조직의 telomeric DNA의 분포율을 분석함으로서 조직별 세포의 분화 및 증식 특이성과 텔로미어 함량간의 밀접한 상관성을 확인하였다.
- 고정된 세포는 냉장 보관된 슬라이드에 3~4 방울 떨어뜨려 표본을 제작하고 slide war- mer에서 3~4시간 건조 후 곧 바로 FISH에 공시하였다. 백혈구 세포 표본의 제작은 개체의 날개 정맥으로부터 약 5 mL의 혈액을 채취하여 백혈구만 순수 분리하여 이용하였다. 순수 백혈구의 분리는 손과 류(1999)가 제시한 Ficoll(Amer- sham Bioscience, Uppsala, Sweden)을 이용한 분리방법으로 시행하였고 분리된 세포는 0.
- XBradrd, 1976). 분리된 ribonucleoprotein을 대상으로 PCR을 수행하였고 이의 조건은 30℃에서 30분간 TS-telo- merase product를 신장시킨 다음 94℃ 30초, 59℃ 30초 및 72 ℃에서 30초간 3단계로 35 사이클을 실시하였다. 증폭된 텔로머레이스는 15% polyacrylamide 겔 (Promega, Madison, WI, USA) 전기영동을 통해 75V에 이어 100V에서 2시간 동안 실시하고 ethidium bromide(EtBr, Sigma Chem, St Louis, MO,USA)로 염색한 후 ladder를 확인하였다.
- 저장된 상은 이미지 분석프로그램(Image analyzer program, MetaMorph, UIC, Pennsylvania, USA)을 이용하여 핵 대비 telomeric DNA 분포량을 분석하였다. 분석 방법은 RGB의 intensity를 이용하여 PI의 적색(red) 대비 FITC의 녹색(green)의 상대적 비를 계산하는 것이다. 즉, 배경 염색에 이용된 PI는 핵 물질 전체를 나타내고, 핵 내 FITC의 형광 sigale telomeric DNA의 접합 양상을 나타내는 것으로 이들의 상대적 비로텔로미어의 함량을 간접적으로 분석하는 것이다.
- 백혈구 세포 표본의 제작은 개체의 날개 정맥으로부터 약 5 mL의 혈액을 채취하여 백혈구만 순수 분리하여 이용하였다. 순수 백혈구의 분리는 손과 류(1999)가 제시한 Ficoll(Amer- sham Bioscience, Uppsala, Sweden)을 이용한 분리방법으로 시행하였고 분리된 세포는 0.06M KCl(Sigma Chem, St Louis, MO, USA)을 이용하여 실온에서 15분간 저장 처리하였다 저장처리가 끝나면 methanol과 acetic acid가 3:1로 혼합된 고 정 액을 10 방울 정도 첨가한 후 원심분리하고 이후 동일 고정액으로서 3회 정도 반복 처리한 후 슬라이드 표본을 제작 하였다.
- 처리된 슬라이드를 형광 현미경으로 관찰한 후 100배의 대물렌즈 하에서 평균 5개의 간기 상을 한 프레임으로 하여 디지털 카메라(Model DP-70, Olympus, Tokyo, Japan)로 촬영하고 이를 컴퓨터에 저장하였다. 저장된 상은 이미지 분석프로그램(Image analyzer program, MetaMorph, UIC, Pennsylvania, USA)을 이용하여 핵 대비 telomeric DNA 분포량을 분석하였다. 분석 방법은 RGB의 intensity를 이용하여 PI의 적색(red) 대비 FITC의 녹색(green)의 상대적 비를 계산하는 것이다.
- 분리된 ribonucleoprotein을 대상으로 PCR을 수행하였고 이의 조건은 30℃에서 30분간 TS-telo- merase product를 신장시킨 다음 94℃ 30초, 59℃ 30초 및 72 ℃에서 30초간 3단계로 35 사이클을 실시하였다. 증폭된 텔로머레이스는 15% polyacrylamide 겔 (Promega, Madison, WI, USA) 전기영동을 통해 75V에 이어 100V에서 2시간 동안 실시하고 ethidium bromide(EtBr, Sigma Chem, St Louis, MO,USA)로 염색한 후 ladder를 확인하였다.
- 처리된 슬라이드를 형광 현미경으로 관찰한 후 100배의 대물렌즈 하에서 평균 5개의 간기 상을 한 프레임으로 하여 디지털 카메라(Model DP-70, Olympus, Tokyo, Japan)로 촬영하고 이를 컴퓨터에 저장하였다. 저장된 상은 이미지 분석프로그램(Image analyzer program, MetaMorph, UIC, Pennsylvania, USA)을 이용하여 핵 대비 telomeric DNA 분포량을 분석하였다.
- 한국 재래닭의 발육, 성장, 노화 단계별 각 조직에 대한 텔로머레이스 활성도를 비교 분석하기 위하여 발생시, 10주령, 30주령, 60주령 및 120주령 각 개체의 간, 뇌, 심장, 신장, 정소 조직을 대상으로 TRAP을 시행하였다. TRAP 방법은 3, 말단 substrate oligonucleotide 에 telomeric repeat가 반복되고, TS와 RP primer를 이용하여 PCR로 확장된 산물이 증폭되는 원리를 이용한 것이다.
- 한국 재래닭의 발육, 성장, 노화 단계의 각 조직에 대한 텔로미어의 양적 분포 양상을 분석하기 위하여 발생시, 10주령, 30주령, 60주령 및 120주령 개체들의 간, 뇌, 심장, 신장, 정소 및 혈액 세포에 대한 QFISH를 수행하였다. 분석 결과 주령별 각 조직의 세포들에 대한 평균 telomeric DNA의 함유율은 Table 1에 제시된 바와 같고 이의 변화 양상을 Fig.
대상 데이터
- 닭의 성장, 발육 및 노화 단계별 텔로미어 양적 분석과 텔로머레이스 활성도 분석을 .위하여 진주산업대학교 종합농장에서 사육중인 한국 재래계 황갈색 계통 암수 100수를 이용하였다.
- 배경 염색은 propidium iodide solu- tion(Sigma Chem, St Louis, MO, USA)을 떨어뜨린 후 커버글라스를 덮고 암소에서 건조시킨 후 검경하였다. 형광 접합 발현 양상은 523 nm 파장대의 필터(WIB filter)를 부착한 형광 현미경 (Model AX-70, Olyrrpus, Tokyo, Japan)을 이용하였다
데이터처리
- 닭의 조직간 및 성장 주령 간 세포 내 telomeric DNA 함량을 비교 분석하기 위하여 SAS 통계 패키지(SAS, 2000)를 이용하여 ANOVA/Turkey법으로 분석하였다.
이론/모형
- 텔로머레이스 활성도의 분석은 Kim과 Wu(1997)가 제시한 TRAP 방법을 이용하였다. TAM의 수행은 Telomerase Detection Kit(Intergen Company, Purchase, NY, USA)를 이용하여 제조사의 지침에 따라 다음과 같이 실시하였다. 채취한 각 조직들은 3-cholamidopropyl dimethylammonio- 1-propane-sulfa- nate(CHAPS) lysis buffer를 이용하여 단백질을 분리하고 정량하였다.
- 본 연구에서 수행한 FISH 방법은 조 등(2005)이 제시한 닭의 초기 배자 및 발생 조직에 대한 telomeric DNA 분석을 위한 HSH 법과 동일하게 실시하였다. 이를 간단하게 소개하면 슬라이드 표본을 RNase(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN, USA)로 RNA를 제거한 후 초자수로 세척하고 에탄올로 탈수 건조시켰다.
- 텔로머레이스 활성도의 분석은 Kim과 Wu(1997)가 제시한 TRAP 방법을 이용하였다. TAM의 수행은 Telomerase Detection Kit(Intergen Company, Purchase, NY, USA)를 이용하여 제조사의 지침에 따라 다음과 같이 실시하였다.
- 따라서 본 연구에서는 한국 재래닭에서 발육, 성장 및 노화 단계별 간, 뇌, 심장, 신장, 정소 및 백혈구 세포에 대한 텔로미어의 양 적 분포와 텔로머레이스 활성도를 분석 고찰하고자 하였다. 텔로미어의 함량 분석은 telomeric DNA probe를 이용하여 Q-FISH 법으로 수행하였고, 텔로머레이스 활성도 분석은 TRAP 방법을 이용하였다. 분석 결과, 닭 염색체상 텔로미어는 모든 염색체 양 말단부에 나타나며 특히 1, 2 및 3번 염색 체에서는 양 말단 외 interstitial telomeric DNA가 존재하였다.
성능/효과
- 분석 결과, 닭 염색체상 텔로미어는 모든 염색체 양 말단부에 나타나며 특히 1, 2 및 3번 염색 체에서는 양 말단 외 interstitial telomeric DNA가 존재하였다. 닭의 조직별 세포들의 telomeric DNA 함량을 분석한 결과 성장 및 노화가 진행됨에 따라 대부분의 세포들에서 텔로미어 함유율이 유의적으로 감소하였고, 조직 간 텔로미어 함유율에서도 많은 차이를 보였는데 특히 증식성 세포인 정소 내 세포들이 다른 비 증식성 세포들에 비해 월등히 높게 나타났다. 텔로머레이스 활성도는 간, 뇌, 심장 등 대부분의 조직에서 성장 및 노화가 진행됨에 따라 활성이 감소되거나 없 어지나 생식선 조직인 정소세포는 연령과 무관하게 지속적으로 높은 활성을 나타내었다.
- 이상의 결과를 종합하면, 닭의 발육, 성장, 노화 단계별 텔로머레이스 활성도는 주령 및 조직에 따라 각기 다른 활성 양상을 보이며, 증식성 세포는 지속적인 활성(constitutive ac- tivity)을 나타내었고, 비 증식성 세포는 성장이 진행됨에 따라 텔로머레이스 활성도가 떨어지는 down-regulation 양상을 보였다. 따라서 닭의 조직별 세포의 분화 및 증식성 특이성과 텔로머레이스 활성도 간에는 매우 밀접한 관련이 있으며, 더불어 텔로미어의 양적 분포와도 매우 높은 상관관계가 있는 것으로 사료된다.
- 이는 텔로미어가 노화와 밀접한 관련을 지닌다는 여러 보고들을 재입증하는 것으로 닭에 있어서도 생리적 연령에 따른 세포 내 텔로미어의 감소를 재확인하는 것이다(Harley, 1991; Counter, 1996; Engelhardt와 Martens, 1998; Cottliar와 Slavutsky, 2001; Sohn 등, 2002; Shay와 Wright, 2005). 또한 본 연구에서 제시한 닭의 주령별 각 조직의 텔로미어 함량 분석 결과는 De- lany 등(2003)이 분석한 닭의 이배체 내 텔로미어 함유율 3- 4%보다는 다소 낮은 수치이기는 하나 이는 분석 방법의 차 이인 것으로 생각되며, 사람이나 포유류에 비해서는 월등히 높은 함유율을 나타낸다는 보고와는 일치된 결과이다. 한편 동일 연령에서 조직 간에도 텔로미어 함유율의 유의적인 차이를 보이고 있는데 증식성 세포인 정소내의 함유율이 비 증식성 세포들에 비해 월등히 높은 분포율을 나타내었다.
- 3은 동일 주령 내 조직 간 및 동일 조직 내 주령 간 텔로미어의 분포 양상을 비교 제시한 그림으로서 60주령 개체의 정소 세포와 간 세포 및 10주령과 120주령의 백혈구 세포의 대표적 FISH 양상이다. 본 그림의 백혈구 세포에서 나타난 바와 같이 연령이 증가함에 따라 telomeric DNA의 분포양상은 극단적으로 감소됨을 확인할 수 있었고, 동일 연령에서 정소 세포와 간 세포의 비교에서 정소 조직 내 세포들의 텔로미어 함유율이 간 세포에 비해 월등히 높은 분포 비율을 나타내고 있음을 알 수 있다.
- 텔로미어의 함량 분석은 telomeric DNA probe를 이용하여 Q-FISH 법으로 수행하였고, 텔로머레이스 활성도 분석은 TRAP 방법을 이용하였다. 분석 결과, 닭 염색체상 텔로미어는 모든 염색체 양 말단부에 나타나며 특히 1, 2 및 3번 염색 체에서는 양 말단 외 interstitial telomeric DNA가 존재하였다. 닭의 조직별 세포들의 telomeric DNA 함량을 분석한 결과 성장 및 노화가 진행됨에 따라 대부분의 세포들에서 텔로미어 함유율이 유의적으로 감소하였고, 조직 간 텔로미어 함유율에서도 많은 차이를 보였는데 특히 증식성 세포인 정소 내 세포들이 다른 비 증식성 세포들에 비해 월등히 높게 나타났다.
- 본 그림 에서 가장 아래의 층은 primer-dimer이고, 그 윗층은 36 bp 위치의 substrate internal control(S-IC)을 나타내며, 이후 50 bp부터 텔로머레이스 활성도가 증가할 때마다 6 bp씩 telomeric DNA의 band가 부가하여 나타난다. 분석 결과, 발생 이전 모든 조직의 세포들에서 텔로머레이스의 활성도를 나타내고 있으나 발생 이후 성장 단계가 진행됨에 따라 이의 활성도가 서서히 약해지면서 10주령시 정소 조직을 제외하고는 모든 조직에서 미약한 텔로머레이스 활성을 보였다. 그러나 성 성숙 이후 노화 단계에서는 정소 조직을 제외한 다른 조직들에서는 거의 텔로머레이스 활성이 없는 것으로 나타났다.
- 텔로머레이스 활성도는 간, 뇌, 심장 등 대부분의 조직에서 성장 및 노화가 진행됨에 따라 활성이 감소되거나 없 어지나 생식선 조직인 정소세포는 연령과 무관하게 지속적으로 높은 활성을 나타내었다. 이상의 결과로부터 닭의 조직별 세포 분화 및 증식성 특이성과 텔로미어의 함량 및 텔로머레이스 활성도 간에는 매우 밀접한 관련이 있으며, 텔로머레이스 활성도와 텔로미어 함유율 간에 매우 높은 상관이 있었다.
- 이상의 결과를 종합하면, 닭의 발육, 성장, 노화 단계별 텔로머레이스 활성도는 주령 및 조직에 따라 각기 다른 활성 양상을 보이며, 증식성 세포는 지속적인 활성(constitutive ac- tivity)을 나타내었고, 비 증식성 세포는 성장이 진행됨에 따라 텔로머레이스 활성도가 떨어지는 down-regulation 양상을 보였다. 따라서 닭의 조직별 세포의 분화 및 증식성 특이성과 텔로머레이스 활성도 간에는 매우 밀접한 관련이 있으며, 더불어 텔로미어의 양적 분포와도 매우 높은 상관관계가 있는 것으로 사료된다.
- 닭의 조직별 세포들의 telomeric DNA 함량을 분석한 결과 성장 및 노화가 진행됨에 따라 대부분의 세포들에서 텔로미어 함유율이 유의적으로 감소하였고, 조직 간 텔로미어 함유율에서도 많은 차이를 보였는데 특히 증식성 세포인 정소 내 세포들이 다른 비 증식성 세포들에 비해 월등히 높게 나타났다. 텔로머레이스 활성도는 간, 뇌, 심장 등 대부분의 조직에서 성장 및 노화가 진행됨에 따라 활성이 감소되거나 없 어지나 생식선 조직인 정소세포는 연령과 무관하게 지속적으로 높은 활성을 나타내었다. 이상의 결과로부터 닭의 조직별 세포 분화 및 증식성 특이성과 텔로미어의 함량 및 텔로머레이스 활성도 간에는 매우 밀접한 관련이 있으며, 텔로머레이스 활성도와 텔로미어 함유율 간에 매우 높은 상관이 있었다.
- 1과 같다. 한국 재래닭 염색체의 텔로미어의 분포 양상은 모든 염색체 양 말단부에 이의 분포가 확인되었고, 1번, 2번 및 3번 염색체에는 양 말단뿐만 아니라 interstitial telo- meres가 존재함을 확인하였다. 본 연구 결과에서 나타난 한국 재래계 염색체의 텔로미어의 분포 양상은 Nanda 등(2002)이 제시한 닭의 염색체상 텔로미어 분포 양상과 거의 일치하였으며, 닭에 있어 interstitial telomeric DNA의 존재 양상은 Nanda와 Schmid(1994) 및 Nanda 등(2002)이 보고한 바 있다.
- 또한 본 연구에서 제시한 닭의 주령별 각 조직의 텔로미어 함량 분석 결과는 De- lany 등(2003)이 분석한 닭의 이배체 내 텔로미어 함유율 3- 4%보다는 다소 낮은 수치이기는 하나 이는 분석 방법의 차 이인 것으로 생각되며, 사람이나 포유류에 비해서는 월등히 높은 함유율을 나타낸다는 보고와는 일치된 결과이다. 한편 동일 연령에서 조직 간에도 텔로미어 함유율의 유의적인 차이를 보이고 있는데 증식성 세포인 정소내의 함유율이 비 증식성 세포들에 비해 월등히 높은 분포율을 나타내었다. 이는 정소 조직의 경우 이를 구성하는 세포들이 증식성 분열 세포들이기 때문에 지속적인 텔로머레이스의 영향을 받고, 연령이 증가하더라도 세포 증식성은 유지하기 때문이다.
- 특히 발육, 성장이 완료되는 30주령 단계와 노화 단계라고 할 수 있는 120 주령시 텔로미어의 함유율은 이전 단계에 비해 급진적 감소됨을 나타내고 있다. 한편 조직간 telomeric DNA 함유율에 있어서도 많은 차이를 보이는 바 특히 정소와 백혈 구세포 내의 텔로미어 함유율은 모든 주령에서 다른 조직내 세포에 비하여 상대적으로 높은 수준의 함유율을 나타내었다. Fig.
후속연구
- 최근에는 닭의 telomerase RNA 유전자에 대한 유전자 지도가 작성되고, telomere-binding protein인 TRF 2의 유전자가 cloning되 었으며, 이의 발현이 배아 상태에서 매우 높게 나타남을 밝힌 바 있다(Swanberg와 Delany, 2005). 이러한 결과들은 텔로미어와 텔로머레이스의 분석이 생명 현상의 기작을 밝히는데 매우 중요한 자료라 사료되어지며 특히 세포의 분화, 노화 등에 대한 중요한 정보를 제공해 줄 수 있을 것으로 생각된다. 그러나 아직까지 닭의 성장 단계별 각 조직의 텔로미어 분포 양상이나 텔로머레이스의 활성도에 대한 연구는 매우 제한적이며 부분적 연구만이 이루어지고 있는 실정이다.
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