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문제 정의
- 2004). 따라서 본 실험에서는 배지내 구성성분 이 결핍된 상태에서 MeJA 처리가 진세노사이드와 페놀화 합물의 생산에 미치는 영향을 조사하였으며 그에 따른 항 산화활성을 조사하였다. 배지효과는 100 μM MeJA를 신 선 MS배지 (FM)와 40일간 생물반응기에서 배양 후 얻어진 배지 (CM)에서 각각 7일간 부정근을 배양하여 나타내었다.
제안 방법
- 8 g)씩 취하여 각각 0, 50, 100, 150 의 MeJA가 포함된 1 L의 삼각플라스크에 재접종하여 7일간 22 + TC 암조건에서 HO rpm으로 배양하였다. 1 L의 삼각플 라스크에 300 mL의 변형된 신선 MS배지 (MS배지에서 NH4NO3만을 완전제거한 배지; Kim et al. 2004)와 각각 다른 농도의 MeJA에서 7일간 배양한 후 수확된 부정근은 실 험실에서 1시간동안 자연 건조하여 생체중을 측정하였으며, 건물중은 동결건조기 (FEU-1200, EYELA)에서 약 12시간 건조하여 측정하였다.
- 5 L의 생물반응기 (Kim et al. 2004)에서 40일간 배양한 후 clean bench내에서 무균적으로 수확된 부정근을 30 g (건물중 2.8 g)씩 취하여 각각 0, 50, 100, 150 의 MeJA가 포함된 1 L의 삼각플라스크에 재접종하여 7일간 22 + TC 암조건에서 HO rpm으로 배양하였다. 1 L의 삼각플 라스크에 300 mL의 변형된 신선 MS배지 (MS배지에서 NH4NO3만을 완전제거한 배지; Kim et al.
- 0 g를 취하여 80 ℃ 온수욕조에서 80% 메탄올 50 mL로 2회 추출하여 여과 . 농축 후 에틸에 테르 (ethyl ether)로 재추출하여 탈지시킨 다음, 수포화 n- 부탄올로 3회 추출하여 n-부탄올층만을 모두 합하여 증류 수로 1회 세척한 후 수층을 버리고 n-부탄올층만을 감압농 축시켰다. 완전히 농축되어 건조된 분말을 HPLC용 메탄올5 mL에 녹여 0.
- 따라서 본 연구에서는 다양한 MeJA 처리농도에 따른 인 삼 부정근내 진세노사이드와 페놀화합물 함량 및 항산화활 성 변화를 조사하였으며, 항산화활성은 산화스트레스에 의하여 발생되는 free radical (ROO-, RO-)을 포착하는 1, 1- diphenyl-2-picryl hydrazyl (DPPH) 법을 이용하여 측정하였다. 또한 배지내 주요 구성물질의 유.
- 배지의 주요 구성물질의 유 . 무에 따른 MeJA의 효과는 100 μM MeJA를 변형된 신선 MS배지 (FM)와 40일간 생 물반응기에서 배양 후 얻어진 배지 (CM)를 무균적으로 취 하여 이용하였다. 배양조건은 상기와 동일하게 수행되었으 며, 생체중과 건물중의 측정도 동일하게 이루어졌다.
- 또한 배지내 주요 구성물질의 유.무에 따른 MeJA의 효과를 확인하기위하여 신선배지 (fresh medium, FM)와 조건배 지 (conditioned medium, CM)에서의 진세노사이드와 페놀화합물의 함량 변화와 그에 따른 항산화 능력을 조사하였다.
- 농축 후 에틸에 테르 (ethyl ether)로 재추출하여 탈지시킨 다음, 수포화 n- 부탄올로 3회 추출하여 n-부탄올층만을 모두 합하여 증류 수로 1회 세척한 후 수층을 버리고 n-부탄올층만을 감압농 축시켰다. 완전히 농축되어 건조된 분말을 HPLC용 메탄올5 mL에 녹여 0.45 /zm millipore syringe filter (Gelman, USA)로 여과하여 HPLC (Waters 2690 separation module, USA)로 분석하였다 (William et al. 1996). 진세노사이드 정량은 photodiode array (Water 966, USA) 검출기로 수행 하였으며, columne Altec Platinum C18 column (1.
- 인삼 (4년근, 충남 금산)의 세근을 약 0.5 cm의 절편으로자른 후, 2, 4-D 1.0 mg/L, kinetin 0.1 mg/L, sucrose 3% (w/v), gelite 0.2% (w/v)가 첨가된 MS배지에 접종하여 22 ±1℃ 암조건에서 캘러스를 유도하고, 유도된 캘러스를 NAA2.0 mg/L, sucrose 3% (w/v), gelite 0.2% (w/v)가 포함된MS배지에 접종하여 동일한 배양조건에서 4주간 배양하여 인삼 부정근을 유도 . 증식하였다 (Kim 2002).
- 인삼부정근 배양에서 MeJA 처리가 부정근내 진세노사이 드와 페놀화합물의 생산에 미치는 영향과 이러한 이차대사 산물의 증가에 따른 인삼부정근의 항산화활성의 효과를 조 사하였다. 다양한 농도의 MeJA를 인삼부정근에 처리한 결과, 100 μM MeJA에서 부정근내 진세노사이드의 생산은26.
- 1996). 진세노사이드 정량은 photodiode array (Water 966, USA) 검출기로 수행 하였으며, columne Altec Platinum C18 column (1.5 /an, 33X7 mm), 용매는 acetonitrile과 물을 이용하여 처음 10 분은 75;25로 후반부 15분은 63:37의 구배로 조절하였고, flow rate는 1.0 tnL/min로 하여 분석하였다. 총 진세노사이 드 함량은 Rbl, Rb2, Rc, Rd, Re, Rf, Rgl (Karl Roth,Germany) 의 표준품에 의하여 분석된 peak의 합으로 나타내었다.
- 추출된 각 시료의 상등액 0.1 mL에 증류수 2.5 mL와 2 NFolin-Ciocalteu's 시약 (Hammerschmidt and Pratt 1978) 0.1 mL를 첨가하고 20% (w/v) Na2COs 0.5 mL를 가하여 1시간 빙■치 후 spectrophotometer (UVIKON 933, KONT-RON)를 이용하여 750 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준 곡선은 gallic acid (Sigma, USA)를 이용하여 추출용매별로 50, 100, 200, 400 mg/L이 되도록 희석하여 측정하였다.
- 5 mL를 가하여 1시간 빙■치 후 spectrophotometer (UVIKON 933, KONT-RON)를 이용하여 750 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준 곡선은 gallic acid (Sigma, USA)를 이용하여 추출용매별로 50, 100, 200, 400 mg/L이 되도록 희석하여 측정하였다.
이론/모형
- 여과하여, 13, 000 rpm에서 약 15 분간 원심분 리 하였다. 원심분리 후 얻어진 상등액은 총 페놀화합물과 DPPH법에 의한 항산화활성을 측정하는데 이용되었다.
성능/효과
- 생물반응기에서 40일간 배양한 후, 무균적으로 수확된 인 삼 부정근에 다양한 농도의 MeJA를 7일간 처리한 결과, MeJA 처리농도가 증가할수록 부정근의 생체중과 건물중 은 감소하는 것으로 나타났다 (Table 1). MeJA를 처 리하지 않은 대조구에서의 생체중은 접종시 생체중 (30 g)보다 약 20%증가하여 35.8 g를 나타낸 반면에 가장 높은 처리농도 인 150 μM에서 생체중은 접종시보다 약 4%가 증가 (31.1 g)된 것으로 나타났다. 또한, 이러한 MeJA의 높은 처리농 도는 생체중보다 건물중을 더욱 감소시키는 것으로 나타났다.
- 배지효과는 100 μM MeJA를 신 선 MS배지 (FM)와 40일간 생물반응기에서 배양 후 얻어진 배지 (CM)에서 각각 7일간 부정근을 배양하여 나타내었다. Table 2에서 보는 바와 같이, FM배지에서의 MeJA 처리 (FM+MeJA)는 인삼부정근의 생중량을 최초 30 g의 접종량에 비하여 7일간 배양으로 약 5.3 g 증가시켰으나 조 건배지 (CM+MeJA)에서는 약 1.3 g 정도만 증가시킨 것으로 나타났다. 반면에 진세노사이드와 페놀화합물은 생장의 감소와는 다르게 CM+MeJA배지에서 배양하였을 때 증가하는 것으로 나타났다 (Figure 2).
- Ali 등 (2005)의 결과에서도 인삼부정 근에 MeJA 처리가 진세노사이드의 함량을 증가시킴과 동시에 항산화활성이 증가한다는 사실 을 이미 보고한 바 있다. 그러나 본 실험에서 알 수 있듯이 인삼부정근내 항산화활성의 증가는 진세노사이드 생산에 영향을 받기보다는 페놀화합물 생산에 의한 영향이 더욱 큰 것으로 나타났다. 일반적으로 페놀화합물의 증가가 DPPH radical 소거능의 증가를 가져온다는 사실은 이미 다양한 약용식물에서 보고된바 있다.
- 인삼부정근 배양에서 MeJA 처리가 부정근내 진세노사이 드와 페놀화합물의 생산에 미치는 영향과 이러한 이차대사 산물의 증가에 따른 인삼부정근의 항산화활성의 효과를 조 사하였다. 다양한 농도의 MeJA를 인삼부정근에 처리한 결과, 100 μM MeJA에서 부정근내 진세노사이드의 생산은26.6 mg/g dry wt로 대조구보다 약 8배 이상 생산하는 것으로 나타났다. 하지만, MeJA의 처리는 부정근의 생장을 감 소시키는 것으로 나타났다.
- 상기의 결과에서 MeJA 처리가 인삼 부정근의 생장을 억 제하는 것과 반대로 부정근이 생산하는 진세노사이드와 페 놀화합물의 생산은 MeJA 처리농도가 증가할수록 점차 증 가시키는 것으로 나타났다 (Figure 1). 대조구의 총 진세노 사이드 함량은 3.2 mg/g dry wt인 반면에 MeJA의 100과 150 μM 처리에서 총 진세노사이드 함량은 각각 26.6과 28.7 mg/g dry wt로 대조구보다 약 8배 이상 증가된 것으로 나타났다 (Figure 1A). 또한 MeJA 처리는 dammarane계사포닌인 진세노사이드 생산을 증가시킬 뿐만 아니라 비사 포닌 가운데 하나인 페놀화합물의 생산도 증가시키는 것으로 나타났다 (Figure IB).
- 7 mg/g dry wt로 대조구보다 약 8배 이상 증가된 것으로 나타났다 (Figure 1A). 또한 MeJA 처리는 dammarane계사포닌인 진세노사이드 생산을 증가시킬 뿐만 아니라 비사 포닌 가운데 하나인 페놀화합물의 생산도 증가시키는 것으로 나타났다 (Figure IB). 50 "M MeJA 처리에서 페놀화 합물의 생산은 0.
- 1 g)된 것으로 나타났다. 또한, 이러한 MeJA의 높은 처리농 도는 생체중보다 건물중을 더욱 감소시키는 것으로 나타났다. 이들의 생체중에 대한 건물중의 비율 (DW/FW)에서 확인할 수 있듯이, MeJA 무처리 (대조구)에서 DW/FW 비율이 8.
- Figure 1A와 B에서 보는 바와 같이, MeJA 처리는 인삼의 대표적인 이차대사산물인 진 세노사이드와 페놀화합물의 생산을 증가시켰다. 또한, 페놀 화합물 생산은 진세노사이드의 생산보다 낮은 농도의 MeJA 처리가 효과적임을 알 수 있다. 이러한 MeJA 처리에 의한 부정근내 이차대사산물의 증가는 결과적으로 인삼부 정근의 항산화활성을 향상시키는 것으로 나타났다 (Figure 1C).
- 3 g 정도만 증가시킨 것으로 나타났다. 반면에 진세노사이드와 페놀화합물은 생장의 감소와는 다르게 CM+MeJA배지에서 배양하였을 때 증가하는 것으로 나타났다 (Figure 2). 배지성분이 결핍된 CM+ MeJA배지에서의 진세노사이드 생산은 FM+MeJA배지에 growth of ginseng adventitious roots for 7-day elicitation period서 보다 약 1.
- 이러한 MeJA의 처리효과는 조건배 지 (CM)를 이용하는 것이 신선배지 (FM)를 이용하는 것보다 유리한 것으로 나타났다. 배지성분이 결핍된 조건배지에 서의 진세노사이드 생산은 신선배지에서 보다 약 1.7배가 증가한 것으로 나타났으며, 페놀화합물 역시 조건배지에서 약 1.2배가 증가한 것으로 나타났다. 이러한 MeJA 처리에 의한 진세노사이드와 페놀화합물의 증가는 결과적으로 인 삼부정근의 항상화활성을 무처리구인 대조구에 비해서 약 72%이상 증가시키는 것으로 나타났다.
- 상기의 결과에서 MeJA 처리가 인삼 부정근의 생장을 억 제하는 것과 반대로 부정근이 생산하는 진세노사이드와 페 놀화합물의 생산은 MeJA 처리농도가 증가할수록 점차 증 가시키는 것으로 나타났다 (Figure 1). 대조구의 총 진세노 사이드 함량은 3.
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MeJA 처리농도에 따른 진세노사이드와 페놀화합물의 생산
생물반응기에서 40일간 배양한 후, 무균적으로 수확된 인 삼 부정근에 다양한 농도의 MeJA를 7일간 처리한 결과, MeJA 처리농도가 증가할수록 부정근의 생체중과 건물중 은 감소하는 것으로 나타났다 (Table 1). MeJA를 처 리하지 않은 대조구에서의 생체중은 접종시 생체중 (30 g)보다 약 20%증가하여 35.
- 또한, 이러한 MeJA의 높은 처리농 도는 생체중보다 건물중을 더욱 감소시키는 것으로 나타났다. 이들의 생체중에 대한 건물중의 비율 (DW/FW)에서 확인할 수 있듯이, MeJA 무처리 (대조구)에서 DW/FW 비율이 8.9 인 반면에 MeJA의 농도가 50, 100, 150 μM로 증가 하면서 DW/FW의 비율은 각각 8.7, 8.5, 8.4로 점차 감소하는 것으로 나타났다. 이와 같은 결과는 본 저자의 앞선 결과 (Kim et al.
- 또한, 페놀 화합물 생산은 진세노사이드의 생산보다 낮은 농도의 MeJA 처리가 효과적임을 알 수 있다. 이러한 MeJA 처리에 의한 부정근내 이차대사산물의 증가는 결과적으로 인삼부 정근의 항산화활성을 향상시키는 것으로 나타났다 (Figure 1C). 특히 50 MeJA 처리에서 항산화활성은 대조구의 45.
- 2배가 증가한 것으로 나타났다. 이러한 MeJA 처리에 의한 진세노사이드와 페놀화합물의 증가는 결과적으로 인 삼부정근의 항상화활성을 무처리구인 대조구에 비해서 약 72%이상 증가시키는 것으로 나타났다.
- 38 mg/g dry wt로 대조구에 비하여 약 3배 이상 증 가한 것으로 나타났다. 이러한 MeJA의 처리효과는 조건배 지 (CM)를 이용하는 것이 신선배지 (FM)를 이용하는 것보다 유리한 것으로 나타났다. 배지성분이 결핍된 조건배지에 서의 진세노사이드 생산은 신선배지에서 보다 약 1.
- 2004). 이상의 두 실험에서도 알 수 있듯이, 인삼 부정근 배양에서 MeJA 처리는 부정근의 생장을 억제하는 반면에 인삼의 대표적인 이차대사산물인 진세노사이 드와 페놀화합물을 증가시키는 것으로 나타났으며, 이러한 이차 대사산물의 증가 (특히 페놀화합물)는 인삼부정근의 항산 화활성을 상당히 증가시키는 것으로 나타났다. 향후, 인삼부정근의 대형생물반응기 배양 (Hahm et al.
- 이러한 MeJA 처리에 의한 부정근내 이차대사산물의 증가는 결과적으로 인삼부 정근의 항산화활성을 향상시키는 것으로 나타났다 (Figure 1C). 특히 50 MeJA 처리에서 항산화활성은 대조구의 45.5%에서 78.3%로 급격히 증가한 반면에 그 이상의 처리 농도에서는 별다른 변화를 보이지 않은 것으로 보아, DPPH radical 소거능은 인삼부정근내 페놀화합물의 생산경향과 더욱 유사하게 나타나는 것으로 생각된다. Ali 등 (2005)의 결과에서도 인삼부정 근에 MeJA 처리가 진세노사이드의 함량을 증가시킴과 동시에 항산화활성이 증가한다는 사실 을 이미 보고한 바 있다.
- 하지만, MeJA의 처리는 부정근의 생장을 감 소시키는 것으로 나타났다. 페놀화합물의 생산 역시 MeJA 처리에 의하여 증가되는 경향을'나타냈으며 50 μM MeJA 에서 0.38 mg/g dry wt로 대조구에 비하여 약 3배 이상 증 가한 것으로 나타났다. 이러한 MeJA의 처리효과는 조건배 지 (CM)를 이용하는 것이 신선배지 (FM)를 이용하는 것보다 유리한 것으로 나타났다.
후속연구
- 이상의 두 실험에서도 알 수 있듯이, 인삼 부정근 배양에서 MeJA 처리는 부정근의 생장을 억제하는 반면에 인삼의 대표적인 이차대사산물인 진세노사이 드와 페놀화합물을 증가시키는 것으로 나타났으며, 이러한 이차 대사산물의 증가 (특히 페놀화합물)는 인삼부정근의 항산 화활성을 상당히 증가시키는 것으로 나타났다. 향후, 인삼부정근의 대형생물반응기 배양 (Hahm et al. 2003)에서 MeJA와 조건배지를 이용한 이단계배양 (Kim et al. 2004)을 통하여 진세노사이드와 페놀화합물을 포함한 다양한 이 차대사산물을 대량생산하는 것이 가능할 것으로 생각된다.
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