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문제 정의
- 이와 같이 다방면으로 이용되며 많은 효능이 있는 것으로 알려진 목초액을 식품가공에 적용할 수 있는 방안을 찾고자 함이 본 연구의 최종 목표이며, 우선 목초액이 식중독균에 어떤 영향을 미치는지를 조사하고 total phenol 함량에 대하여 분석하였다.
제안 방법
- 즉, agar plate 에 미리 배양한 균액을 멸균 면봉으로 도말하고 paper disc( 8 mm) 에 각 추출물을 DMSO(dimethylsulfoxide) 에 농도별로 용해하여 30 L씩 흡수시켜 plate 표면에 얹고 30 또는 35 ℃ 에서 24~48시간 동안 배양한 다음 paper disc 주위의 생육저지환의 직경 (mm) 로 항균력을 비교하였다. 대조군으로 DMSO 를 병행 실험하였다.
- 5 g 을 얻어 조 추출물로 하였다. 따로 목초액 1 L 에 3배량의 hexane 을 가하여 분액여두에서 수 회 반복 추출한 후 hexane층을 진공 농축기로 감압 농축하여 hexane 분획물 1.2 g 을 얻고, 이어 동일한 방법으로 ethyl acetate, butanol 등 용매의 극성도를 높여가며 순차적으로 계통 분획하여 ethyl acetate 분획물 32.4 g, butanol 분획물 13.0 g, 물 분획물 1.7 g 을 얻어 항균성 시험의 시료로 사용하였다.
- 목초액 조추출물과 각 용매 분획물의 총페놀성 화합물의 함량은 Folins-Denis 법(25)을 일부 변경하여 측정하였다. 즉, 목초액을 2 ppm으로 희석시킨 다음 0.
- 목초액의 천연보존료로서의 이용성을 검토하기 위하여 기계식 전용탄화로에서 제조된 목초액을 대상으로 항균 활성과 총페놀성 화합물의 함량을 측정하였다.
- 로 시험하였다. 배지와 시료를 microplate 의 well 에넣고 two-fold serial dilution 방법으로 계단 희석한 후 미리 배양한 균액을 가하여 30C 또는 35C 에서 24~48시간 동안 배양한 다음 균 증식유무로 최소저해농도를 측정하였다.
- 2 mL Folin-Ciocalteau phenol reagent 를 첨가하여 잘 혼합하고 실온에서 3분간 방치하였다. 이후 Na2CO3 포화용액 1 mL를 가하여 혼합하고 실온에서 1시간 정치한 후 spectrophotometer (Varian cary 300, Australia) 를 이용하여 725 nm 에서 흡광도를 측정하였고 tannic acid(Sigma, St. Louis, MO) 를 이용하여 작성한 검량 선으로부터 총 페놀화합물의 함량을 구하였다.
- 를 이용한 disc diffusion 법 (23) 으로 시험하였다. 즉, agar plate 에 미리 배양한 균액을 멸균 면봉으로 도말하고 paper disc( 8 mm) 에 각 추출물을 DMSO(dimethylsulfoxide) 에 농도별로 용해하여 30 L씩 흡수시켜 plate 표면에 얹고 30 또는 35 ℃ 에서 24~48시간 동안 배양한 다음 paper disc 주위의 생육저지환의 직경 (mm) 로 항균력을 비교하였다. 대조군으로 DMSO 를 병행 실험하였다.
대상 데이터
- 모든 균주는 계대배양하여 충분히 활성화 시킨 후 실험에 사용하였고 배지는 Mueller-Hinton broth 와 Mueller-Hinton agar(Difco Co., Detroit, MI) 를 사용하였다.
- 본 실험에 사용한 시료는 경상북도 포항시 기계면에 소재하는 거여목초산업(주)의 기계식 전용 탄화로에서 제조된 참나무목초액을 분양 받아 여과지 (Toyo No. 5B)로 여과시킨 것을 공시재료로 사용하였다. 실험에 사용한 시약들은 모두 특급 이상을 사용하였으며, 대부분 Sigma사, Aldrich사, Merck사의 제품을 구입하여 사용하였다.
- 5B)로 여과시킨 것을 공시재료로 사용하였다. 실험에 사용한 시약들은 모두 특급 이상을 사용하였으며, 대부분 Sigma사, Aldrich사, Merck사의 제품을 구입하여 사용하였다.
- 항균성 시험에는 식중독 원인균을 사용하였으며 그람음성균으로 Salmonella enteritidis ATCC 13076, Escherichia coli O157 ATCC 43895, Shigella sonnei ATCC 9290, Yersinia enterocolitica ATCC 27729을, 그람양성균으로 Staphylococcus aureus ATCC 13565, Bacillus cereus ATCC 14579, Listeria monocytogenes ATCC 19115를 공시 균주로 사용하였다. 모든 균주는 계대배양하여 충분히 활성화 시킨 후 실험에 사용하였고 배지는 Mueller-Hinton broth 와 Mueller-Hinton agar(Difco Co.
이론/모형
- 목초액의 ethyl acetate 분획 35.3 g 을 silica gel column chromatography(7x 110 cm) 에 충진하고 (EtOAC : Hexane)-MeOH 용매계로 methanol 농도를 순차적으로 증가시키는 step-wise elution 법으로 정제하여 Table 1과 같이 6개의 획분을 얻었다.
- 목초액의 추출물 및 용매 분획물의 항균성 시험은 paper disc 를 이용한 disc diffusion 법 (23) 으로 시험하였다. 즉, agar plate 에 미리 배양한 균액을 멸균 면봉으로 도말하고 paper disc( 8 mm) 에 각 추출물을 DMSO(dimethylsulfoxide) 에 농도별로 용해하여 30 L씩 흡수시켜 plate 표면에 얹고 30 또는 35 ℃ 에서 24~48시간 동안 배양한 다음 paper disc 주위의 생육저지환의 직경 (mm) 로 항균력을 비교하였다.
- 항균성이 우수하게 나타난 hexane 분획물과 ethyl acetate 분획물의 최소저해농도(minimum inhibitory concentration, MIC) 의 측정은 96 well microplate 를 이용한 broth dilution method(24) 로 시험하였다. 배지와 시료를 microplate 의 well 에넣고 two-fold serial dilution 방법으로 계단 희석한 후 미리 배양한 균액을 가하여 30C 또는 35C 에서 24~48시간 동안 배양한 다음 균 증식유무로 최소저해농도를 측정하였다.
성능/효과
- Hexane 분획은 1,000 Jg/mL의 농도에서 Salmonella enteritidis와 Escherichia coli O157의 생육을 억제시켰고, 500 g/mL 농도에서 Shigella sonnei, Yersinia entercolitica, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus를, 125 g/mL의 농도에서 Listeria monocytogenes의 생육을 억제하였다. 에칠아세테이트 분획은 1,000 g/mL의 농도에서 Salmonella Enteritidis와 Escherichia coli O157를, 500 g/mL 농도에서 Shigella sonnei와 Bacillus cereus를, 250 g/mL의 농도에서 Yersinia entercolitica, Staphylococcus aureus를, 125 Jg/mL 의 농도에서 Listeria monocytogenes의 생육을 억제하였다.
- 분획별로는 ethyl acetate 분획이 hexane 분획에 비해 다소 높은 항균성을 나타내었고, 균종별로는 Listeria monocytogenes. Yersinia enterocolitica, Staphylococcus aureuse 대하여 항균성이 높게 나타났다.
- 같다. 균종별로 살펴보면 그람음성균인 Shigella sonnei 와 Yersinia enterocolitica는 2.0 mg/disc의 농도에서 각각 16 mm, 18 mm 의 clear zone 을 형성하여 다른 미생물에 비하여 상대적으로 높은 항균활성을 나타내었으며, Escherichia coli O157에 대해서는 12 mm의 clear zone을 형성하여 상대적으로 낮은 항균성을 보였다 한편 그람양성균에서는 Listeria monocytogenese} 20 mm, Staphylococcus aureuse} 17 mm, Bacillus cereus 15 mm의 clear zone을 형성하여 그람 음성균에 비해 대체적으로 항균력이 높게 나타났다. 서 등(20)은 일부 식품부패균 및 식중독균을 대상으로 참나무 목초액을 10~50 L 첨가시 항균활성을 조사한 결과 모든 균종에서 농도 의존적으로 항균활성이 나타났다고 하였고, 균종별로는 Escherichia coli, Streptococcus mutans, Salmonella typhimurium, Vibrio parahaemolyticus에 대해서는 clear zone이 10.
- 특히 p-1은 11-32 mm, P-2는 10~27 mm의 clear zone 을 형성하여 항균성이 매우 우수하게 나타났다. 균종별로는 Listeria monocytogenese 경우 모든 분획 에서 항균력을 나타내었으며 P-1 이 32 mm, P-2 과 27 mm의 clear zone 을 형성하여 매우 강한 항균력을 보였고, 나머지 분획에서도 15~25 mm를 형성하여 다른 균주들에 비해 항균 활성이 뛰어남을 볼 수 있었다 그리고 P-1과 P-2은 Staphylococcus aureus 에 대하여 20 mm, 17 mm 의 clear zone 을 나타내어 강한 항균력을 보였고, Bacillus cereus에 대하여서는 14 mm, 13 mm의 clear zone을 보여 다른 분획들보다는 우수한 항균성을 나타내었다. 한편 그람음성균인 Salmonella enteritidis, Escherichia coli O157, Shigella sonnei, Yersinia enterocolitica에 대해서는 P-6 분획은 항균성을 나타내지 않았고 다른 분획들도 9~12 mm 의 clear zone 을 형성하는 등 큰 차이가 없는 것으로 나타나서 그람음성균에는 항균성이 저하하는 것을 알 수 있었다 향후 항균성이 높게 나타난 P-1 과 P-2 에서 항균성 물질을 분리하여 구조를 밝히는 연구가 필요할 것으로 생각된다.
- Table 2와 같다. 목초액을 농축하여 물을 제거한 조 추출물은 전체 무게의 6.7%였고, 조추출물에 대한 각 순차 분획물의 수율은 ethyl acetate 분획물이 47.2%로 가장 높았고, butanol 분획물 18.9%, 물 분획물 2.4%, hexane 분획물이 1.7%의 수율을 보임으로서 대부분의 목초액 분획물은 중간 극성 쪽의 용매분획에서 얻을 수 있음을 알 수 있었다.
- 목초액을 농축하여 얻은 조추출물과 극성에 따라 분획한 용매 분획물의 항균성을 측정한 결과 식중독균인 Salmonella enteritidis, Escherichia coli O157, Shigella sonnei, Yersinia enterocolitica, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Listeria monocytogenes에 대하여 항균성을 나타내었다. 특히 hexane 분획과 ethyl acetate 분획이 다른 분획보다 항균성 이 강하게 나타났으며, 균종별로는 Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes 등 그람 양성균이 그람 음성균에 비하여 항균활성이 높게 나타났다.
- 최소생육저해농도는 Listeria monocytogenes에 대해서는 두 분획 모두 125 g/mL 의 농도에서 생육을 억제하여 가장 높은 항균성을 보였고, Yersinia enterocolitica와 Staphylococcus aureuse 대하여 ethyl acetate 분획은 250 g/mL hexane 분획은 500 g/mL의 농도에서 생육을 억제하였고 대부분의 다른 균에서도 hexane 분획과 ethyl acetate 분획은 500 Jg/mL~ 1,000 i g/mL 농도에서 생육을 억제하였다. 목초액의 ethyl acetate 분획을 silica gel column chromatography 로 정제한 후 항균성을 시험한 결과 P-1과 P-2 fraction 에서 강한 항균성 물질이 존재함을 확인하였다. 목초액의 조추출물과 용매 분획물의 총페놀화합물의 함량을 측정한 결과 ethyl acetate 분획과 hexane 분획이 각각 488.
- 목초액의 ethyl acetate 분획을 silica gel column chromatography 로 정제한 후 항균성을 시험한 결과 P-1과 P-2 fraction 에서 강한 항균성 물질이 존재함을 확인하였다. 목초액의 조추출물과 용매 분획물의 총페놀화합물의 함량을 측정한 결과 ethyl acetate 분획과 hexane 분획이 각각 488.3 mg/g 와 403.8 mg/g 으로 다른 분획에 비해 페놀성 물질의 함량이 높게 나타나 목초액의 항균성 물질은 페놀성 물질일 것으로 판단되었다.
- 0 mg /disc 농도에서 Listeria monocytogenes, Yersinia enterocolitica, Shigella sonnei, Staphylococcus aureuse 대해서 각각 24, 23, 22, 20 mm의 clear zone을 형성하여 매우 강한 항균력을 보였으며, Salmonella enteritidis, Bacillus cereus, Escherichia coli O157 균에 대해서는 18, 18, 13 mm의 clear zone을 형성하는 등 조사 대상 모든 균주에 높은 항균효과를 나타내었다. 물 분획과 butanol 분획은 2.0 mg/disc 의 농도에서는 모든 균주에 항균성을 나타내었으나 0.5 mg/disc 의 농도에서는 항균성을 나타내지 않거나 약한 항균성을 나타내었다 이 결과로 보아 목초액의 항균활성 물질은 중간 극성이거나 비극성에 가까운 성질을 갖는 물질일 것으로 추정되며 여러 분획에서 항균성을 나타내는 것으로 보아 항균성 물질은 다양한 성분들이 혼합되어 나타나는 것으로 판단된다.
- 같다. 시료의 농도를 1.0 mg/disc 가 되도록 paper disc 에 첨가한 후 7종의 공시균주를 대상으로 항균력을 확인한 결과, 분획 P-1, P-2, P-3, P-4는 모든 균주에 대하여 항균성을 나타내었다. 특히 p-1은 11-32 mm, P-2는 10~27 mm의 clear zone 을 형성하여 항균성이 매우 우수하게 나타났다.
- 에칠아세테이트 분획은 1,000 g/mL의 농도에서 Salmonella Enteritidis와 Escherichia coli O157를, 500 g/mL 농도에서 Shigella sonnei와 Bacillus cereus를, 250 g/mL의 농도에서 Yersinia entercolitica, Staphylococcus aureus를, 125 Jg/mL 의 농도에서 Listeria monocytogenes의 생육을 억제하였다. 분획별로는 ethyl acetate 분획이 hexane 분획에 비해 다소 높은 항균성을 나타내었고, 균종별로는 Listeria monocytogenes.
- 4와 같다. 용매 분획별 항균성 시험에서는 농도가 높아질수록 농도 의존적으로 항균성이 증가하였으며, hexane 분획과 ethyl acetate 분획은 0.5 mg/disc 의 농도에서도 실험 균주 7종 모두에 대하여 항균성을 나타내어 항균성이 우수한 것으로 나타났다. 특히 ethyl acetate 분획은 2.
- 법으로 측정한 결과는 Table 7과 같다. 총 페놀성 화합물의 함량은 목초액 농축물이 227.5 mg/g 이었으며, 용매 분획별로는 에틸아세테이트 분획과 헥산 분획이 488.3 mg/g 와 403.8 mg/g 으로 높게 나타났으며 부탄올및 수용성 분획은 각각 83.6 mg/g 와 74.5 mg/g 으로 나타났다. Clark 등(26)이 식물체에 함유된 페놀성 물질이 항균 활성을 나타낸다고 보고한 것과 관련지어 볼 때 본 연구에서도 항균활성이 높게 나타난 에틸아세테이트 분획과 헥산분획에 페놀성 물질을 상대적으로 높게 함유하고 있어 목초액의 항균성은 페놀성 물질에 기인된 것으로 생각된다.
- 특히 hexane 분획과 ethyl acetate 분획이 다른 분획보다 항균성 이 강하게 나타났으며, 균종별로는 Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes 등 그람 양성균이 그람 음성균에 비하여 항균활성이 높게 나타났다. 최소생육저해농도는 Listeria monocytogenes에 대해서는 두 분획 모두 125 g/mL 의 농도에서 생육을 억제하여 가장 높은 항균성을 보였고, Yersinia enterocolitica와 Staphylococcus aureuse 대하여 ethyl acetate 분획은 250 g/mL hexane 분획은 500 g/mL의 농도에서 생육을 억제하였고 대부분의 다른 균에서도 hexane 분획과 ethyl acetate 분획은 500 Jg/mL~ 1,000 i g/mL 농도에서 생육을 억제하였다. 목초액의 ethyl acetate 분획을 silica gel column chromatography 로 정제한 후 항균성을 시험한 결과 P-1과 P-2 fraction 에서 강한 항균성 물질이 존재함을 확인하였다.
- 5 mg/disc 의 농도에서도 실험 균주 7종 모두에 대하여 항균성을 나타내어 항균성이 우수한 것으로 나타났다. 특히 ethyl acetate 분획은 2.0 mg /disc 농도에서 Listeria monocytogenes, Yersinia enterocolitica, Shigella sonnei, Staphylococcus aureuse 대해서 각각 24, 23, 22, 20 mm의 clear zone을 형성하여 매우 강한 항균력을 보였으며, Salmonella enteritidis, Bacillus cereus, Escherichia coli O157 균에 대해서는 18, 18, 13 mm의 clear zone을 형성하는 등 조사 대상 모든 균주에 높은 항균효과를 나타내었다. 물 분획과 butanol 분획은 2.
- 특히 hexane 분획과 ethyl acetate 분획이 다른 분획보다 항균성 이 강하게 나타났으며, 균종별로는 Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes 등 그람 양성균이 그람 음성균에 비하여 항균활성이 높게 나타났다. 최소생육저해농도는 Listeria monocytogenes에 대해서는 두 분획 모두 125 g/mL 의 농도에서 생육을 억제하여 가장 높은 항균성을 보였고, Yersinia enterocolitica와 Staphylococcus aureuse 대하여 ethyl acetate 분획은 250 g/mL hexane 분획은 500 g/mL의 농도에서 생육을 억제하였고 대부분의 다른 균에서도 hexane 분획과 ethyl acetate 분획은 500 Jg/mL~ 1,000 i g/mL 농도에서 생육을 억제하였다.
후속연구
- 균종별로는 Listeria monocytogenese 경우 모든 분획 에서 항균력을 나타내었으며 P-1 이 32 mm, P-2 과 27 mm의 clear zone 을 형성하여 매우 강한 항균력을 보였고, 나머지 분획에서도 15~25 mm를 형성하여 다른 균주들에 비해 항균 활성이 뛰어남을 볼 수 있었다 그리고 P-1과 P-2은 Staphylococcus aureus 에 대하여 20 mm, 17 mm 의 clear zone 을 나타내어 강한 항균력을 보였고, Bacillus cereus에 대하여서는 14 mm, 13 mm의 clear zone을 보여 다른 분획들보다는 우수한 항균성을 나타내었다. 한편 그람음성균인 Salmonella enteritidis, Escherichia coli O157, Shigella sonnei, Yersinia enterocolitica에 대해서는 P-6 분획은 항균성을 나타내지 않았고 다른 분획들도 9~12 mm 의 clear zone 을 형성하는 등 큰 차이가 없는 것으로 나타나서 그람음성균에는 항균성이 저하하는 것을 알 수 있었다 향후 항균성이 높게 나타난 P-1 과 P-2 에서 항균성 물질을 분리하여 구조를 밝히는 연구가 필요할 것으로 생각된다.
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