돼지정액의 동결에 관한 연구 II. 동결한 돼지정액의 체내, 체외수정능력 Studies on the Freezing of Boar Semen II . In Vitro and In Vivo Fertilizing Capacity of Frozen Boar Spermatozoa원문보기
본 실험은 LEY에 다양한 당류를 첨가한 용액으로 동결보존한 돼지정자의 응해후 생존율과 정상 첨체율, 체외성숙한 난자와의 수정능력과 배 발달 능력 및 인공수정을 통한 수태율과 산자수에 미치는 효과를 조사하기 위해 실시하였다. 융해후의 정상 첨체율은 glucose 농도 증가와 함께 증가되었으나, 생존율에 있어서는 효과가 인정되지 않았다. LEY에 fructose를 단독 또는 glucose와 함께 첨가하면 융해후의 생존율이 유의하게 증가되었으며 (p<0.05), 정상 첨체율에 있어서는 LEY 보존액에 fructose와 glucose를 첨가한 구가 $81.4{\pm}2.3\%$로 control의 $41.6{\pm}0.6\%$에 비하여 유의하게 높았다(p<0.001). 체외성숙 난자와의 수정율, 분할율 및 배반포 발생율은 $70.8\~80.7\%$, $44.6\~45.7\%$ 및 $13.6\~16.0\%$로 glycerol과 fructose 농도 및 정자농도 간에 차이가 인정되지 않았다. 1회 발정당 2회의 인공수정을 하였을 때, 수태율은 $83.3{\pm}0.1\%$, 산자수는 $9.4{\pm}1.7\~10.4{\pm}0.7$두로서 SGI사의 동결정액의 $50.0{\pm}0.1\%(p<0.05)$과 $8.0{\pm}1.1$두에 비하여 높았다.
본 실험은 LEY에 다양한 당류를 첨가한 용액으로 동결보존한 돼지정자의 응해후 생존율과 정상 첨체율, 체외성숙한 난자와의 수정능력과 배 발달 능력 및 인공수정을 통한 수태율과 산자수에 미치는 효과를 조사하기 위해 실시하였다. 융해후의 정상 첨체율은 glucose 농도 증가와 함께 증가되었으나, 생존율에 있어서는 효과가 인정되지 않았다. LEY에 fructose를 단독 또는 glucose와 함께 첨가하면 융해후의 생존율이 유의하게 증가되었으며 (p<0.05), 정상 첨체율에 있어서는 LEY 보존액에 fructose와 glucose를 첨가한 구가 $81.4{\pm}2.3\%$로 control의 $41.6{\pm}0.6\%$에 비하여 유의하게 높았다(p<0.001). 체외성숙 난자와의 수정율, 분할율 및 배반포 발생율은 $70.8\~80.7\%$, $44.6\~45.7\%$ 및 $13.6\~16.0\%$로 glycerol과 fructose 농도 및 정자농도 간에 차이가 인정되지 않았다. 1회 발정당 2회의 인공수정을 하였을 때, 수태율은 $83.3{\pm}0.1\%$, 산자수는 $9.4{\pm}1.7\~10.4{\pm}0.7$두로서 SGI사의 동결정액의 $50.0{\pm}0.1\%(p<0.05)$과 $8.0{\pm}1.1$두에 비하여 높았다.
This experiment was carried out to investigate the effects of saccharide in the lactose-egg yolk(LEY) extender for freezing of boar semen on the viability, normal acrosome, fertilizable of in vitro or in vivo oocyte after thawed. Normal acrosome post-thawed spermatozoa was higher when increasing of ...
This experiment was carried out to investigate the effects of saccharide in the lactose-egg yolk(LEY) extender for freezing of boar semen on the viability, normal acrosome, fertilizable of in vitro or in vivo oocyte after thawed. Normal acrosome post-thawed spermatozoa was higher when increasing of glucose concentration in LEY extender with 3 or $4\%$ glycerol, but viability was not significant. Viability of the post-thawed spermatozoa was higher when fructose or fructose and glucose were added to LEY extender with $3\%$ glycerol than glucose and sucrose or fructose, glucose and sucrose(P<0.05). Rate of normal acrosome of post thawed spermatozoa was higher when both fructose and glucose$(81.4{\pm}2.3\%)$ were added to the LEY extender than saccharide not added$(41.6\pm0.6\%)$ to it(P<0.001). The percentage of fertilization, cleavage and development to blastocyst of oocytes fertilized with post-thawed spermatozoa from freezing by LEY extender were $70.8\~80.7\%$, $44.6\~45.7$ and $13.6\~16.0\%$, respectively. Conception rate by artificial insemination with frozen boa. semen was higher$(83.1{\pm}0.3\%)$ than commercial frozen semen from SGI company$(50.0{\pm}0.1\%,\;P<0.05)$, but litter size were no significant differences between frozen by LEY extender$(9.4{\pm}1.7\~10.4{\pm}0.7head/sow)$ and SGI semen$(8.0{\pm}1.1 head/sow)$.
This experiment was carried out to investigate the effects of saccharide in the lactose-egg yolk(LEY) extender for freezing of boar semen on the viability, normal acrosome, fertilizable of in vitro or in vivo oocyte after thawed. Normal acrosome post-thawed spermatozoa was higher when increasing of glucose concentration in LEY extender with 3 or $4\%$ glycerol, but viability was not significant. Viability of the post-thawed spermatozoa was higher when fructose or fructose and glucose were added to LEY extender with $3\%$ glycerol than glucose and sucrose or fructose, glucose and sucrose(P<0.05). Rate of normal acrosome of post thawed spermatozoa was higher when both fructose and glucose$(81.4{\pm}2.3\%)$ were added to the LEY extender than saccharide not added$(41.6\pm0.6\%)$ to it(P<0.001). The percentage of fertilization, cleavage and development to blastocyst of oocytes fertilized with post-thawed spermatozoa from freezing by LEY extender were $70.8\~80.7\%$, $44.6\~45.7$ and $13.6\~16.0\%$, respectively. Conception rate by artificial insemination with frozen boa. semen was higher$(83.1{\pm}0.3\%)$ than commercial frozen semen from SGI company$(50.0{\pm}0.1\%,\;P<0.05)$, but litter size were no significant differences between frozen by LEY extender$(9.4{\pm}1.7\~10.4{\pm}0.7head/sow)$ and SGI semen$(8.0{\pm}1.1 head/sow)$.
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문제 정의
따라서 본 연구에서는 동결보존액에 당류의 첨가가 돼지정자의 동결 융해후에 생존율과 첨체에 미치는 영향을 형광염색법으로 확인하고, 체외에서 성숙시킨 돼지난자와의 체외수정율과 배발달 및 인공수정을 통한 수태율과 산자수를 확인하여 돼지정액의 동결 보존 기술 개발을 위한 기초자료를 얻기 위해서 실시하였다.
본 실험은 LEY에 다양한 당류를 첨가한 용액으로 동결보존한 돼지정자의 융해후 생존율과 정상 첨체율, 체외성숙한 난자와의 수정능력과 배 발달 능력 및 인공수정을 통한 수태율과 산자수에 미치 는 효과를 조사하기 위해 실시하였다. 융해후의 정상 첨체율은 glucose 농도 증가와 함께 증가되었으 나, 생존율에 있어서는 효과가 인정되지 않았다.
제안 방법
성숙배양이 완료된 난자를, 동결보존한 정액을 47℃에서 10초간 융해시킨 다음, 수정용 용액(mTBM + lmM caffeine+ 1.0mg/ml BSA)으로 원심분리하여 세척하고 1乂1。5마리, 5xl05마리 및 lx105마리/㎖ 로 조절하여 준비한 정자 drop에 넣어 6시간 공배양하여 수정을 시켰다. 수정완료후 20시간에 일부 난자를 orcein 염색하여 정자 침입율에 의한 수정율을 조사하고, 나머지의 난자는 주변의 난구세포와 정자를 제거하고 NCSU-23액에 BSA (4.
첨체 검사는 융해하여 희석한 정액 30㎕ 를 무형광 slide glass에 도말하고 상온에서 건조시킨 후, 2분간 0℃의 methyl alcohol에 침지하여 고정하고, 다시 상온에서 건조하였다. 건조된 도말 sample에 150(d 의 FITC-PSA(Sigma, L- 0770)와 2.4mM의 PI 75를 각각 떨 어 뜨리 고 그 위에 투명 필름을 덮어 염색액이 slide glass 전체에 퍼지도록 하고 암실에서 20분간 염색을 하였다. 염색이 종료된 후, 투명필름을 제거하고 증류수에 10분간 침지시켜 탈염색하고 풍건시킨 다음, 다시 antifading solution을 50 yl 떨어뜨리고 slide glass와 같은 크기 의 cover glass를 덮어 압착시 킨 다음, 형광현미경하에서 1, 000배율로 200개의 정자를 관찰하여, 노란색으로 염색된 첨체가 적색으로 염색 된 두부에 밀착한 정자만을 정상적인 첨체로 하고, 나머지는 손상된 첨체로 판단하였다(Fig.
LEY 1차 희석액으로 희석을 완료한 농후 정액 을 90분간에 걸쳐서 25℃에서 5℃까지 냉각을 하였다. 냉각개시후 온도가 18℃에 도달하였을 때,LEY 2차 희석액(LEY 1차 희석액 +1.5% Orvus ES paste)에 glycerol 3 또는 4%와 glucose 0, 15, 31, 62.5 및 125mM, 또는 3% glycerol과 각각 10mM씩의 fructose, glucose, sucrose를 단독 또는 조합)을 최종 희석량의 10%, 13℃, 10℃ 및 8℃로 냉각되었을 때 20%, 30% 및 40%를 첨가하여 정 자의 최종농도를 12xl08/ml 이 되도록 하고, 5℃까지 냉각후 한쪽 끝을 steel ball로 봉인한 5ml의 macrotube straw(Minitube, Germany)에 주사기를 이용하여 주입한 다음, 선단을 color plastic ball로 봉인하고 스티로폼 상자에 준비한 액체질소 상면 5cm에서 20분간 두어 예비동결을 시켰고, 이어서 액체질소 중에 침지시켜 동결을 완료하였다.
동결을 위한 정액은 천안연암대학 유전자원센터에서 액상 정액 공급을 목적으로 사육하고 있는 종모돈을 이용하여 수압법으로 농후 정액만을 분리하여 채취하고 30℃로 유지시켰다. 채취한 농후 정 액을 Table 1의 용액으로 등량 희석하고 25℃로 조절한 원심분리기에서 3,000rpm, 5분간 원심분리후 상층액을 제거하고, Lactose-Egg Yolk(LEY) 의 1차 희석액(11% lactose, 20% egg yolk)으로 최종 희석량(2차 희석액 포함)의 1/2량까지 희석하고 5℃로 준비한 방안에서 25℃로 설정한 program 동결기(FHK, ETIN, Japan)에 넣어 냉각준비를 하였다.
동결보존한 정액을 47℃의 온수에서 10초간 녹인 다음, 35℃로 가온하여 준비한 NTS-1 액으로 20배 희석하였다. 생존율과 첨체검사는 Maxwell과 Johnson(1997)의 방법에 준하여, NTS-1 액으로 희석한 정액 500μl를 1.5ml의 tube에 담고, 여기에 SYBR-14(Molecular Probe, USA, L-7011) 5 W1 (O.lrnM)와 Propidium lodide(PI) 3M(2.4mM)을 각각 첨가하고 암실의 상온에서 20분간 방치하여 형광염색을 실시한 다음, 암실에서 염색한 정액 10㎕를 무형광 slide glass에 올리고 cover glass를 덮은 다음, 형광현미경하에서 400배율로 200개의 정자를 관찰하여 녹색과 적색으로 염색된 정자를 계산하고, 녹색으로 염색된 정자는 생존한 것으로, 적색으로 염색된 것은 사멸한 정자로 하여 생존율을 계산하였다(Fig. 1). 첨체 검사는 융해하여 희석한 정액 30㎕ 를 무형광 slide glass에 도말하고 상온에서 건조시킨 후, 2분간 0℃의 methyl alcohol에 침지하여 고정하고, 다시 상온에서 건조하였다.
0mg/ml BSA)으로 원심분리하여 세척하고 1乂1。5마리, 5xl05마리 및 lx105마리/㎖ 로 조절하여 준비한 정자 drop에 넣어 6시간 공배양하여 수정을 시켰다. 수정완료후 20시간에 일부 난자를 orcein 염색하여 정자 침입율에 의한 수정율을 조사하고, 나머지의 난자는 주변의 난구세포와 정자를 제거하고 NCSU-23액에 BSA (4.0mg/ml)를 첨가한 배양액에서 배양을 하였으며, 수정후 48시간, 72시간 및 144시간에 분할율, 6~8 세포기 및 배반포배로의 발달율을 조사하였다.
4mM의 PI 75를 각각 떨 어 뜨리 고 그 위에 투명 필름을 덮어 염색액이 slide glass 전체에 퍼지도록 하고 암실에서 20분간 염색을 하였다. 염색이 종료된 후, 투명필름을 제거하고 증류수에 10분간 침지시켜 탈염색하고 풍건시킨 다음, 다시 antifading solution을 50 yl 떨어뜨리고 slide glass와 같은 크기 의 cover glass를 덮어 압착시 킨 다음, 형광현미경하에서 1, 000배율로 200개의 정자를 관찰하여, 노란색으로 염색된 첨체가 적색으로 염색 된 두부에 밀착한 정자만을 정상적인 첨체로 하고, 나머지는 손상된 첨체로 판단하였다(Fig. 2).
인공수정을 위한 정액은 LEY에 3% glycerol+ 30mM fhictose와 4% glycerol + 15mM fructose-g-첨가한 보존액으로 동결보존한 정액을 47℃에서 10초간 융해후 37℃로 가온하여 준비한 NTS-1 용액으로 20배 희석하여 준비하고, 암컷 중 발정개시 후 28~32시간에 1차, 1차 수정후 6시간에 2차 수정을 실시하였다. 대조구로서 미국의 SGI사에서 수입한 정액을 동일한 조건으로 인공수정을 실시 하였다.
대조구로서 미국의 SGI사에서 수입한 정액을 동일한 조건으로 인공수정을 실시 하였다. 인공수정후 25일째에 화상임신진단기를 이용하여 수태 여부를 확인하고, 화상에 나타난 수를 확인하여 산자수를 결정하였다.
대상 데이터
인공수정을 위한 정액은 LEY에 3% glycerol+ 30mM fhictose와 4% glycerol + 15mM fructose-g-첨가한 보존액으로 동결보존한 정액을 47℃에서 10초간 융해후 37℃로 가온하여 준비한 NTS-1 용액으로 20배 희석하여 준비하고, 암컷 중 발정개시 후 28~32시간에 1차, 1차 수정후 6시간에 2차 수정을 실시하였다. 대조구로서 미국의 SGI사에서 수입한 정액을 동일한 조건으로 인공수정을 실시 하였다. 인공수정후 25일째에 화상임신진단기를 이용하여 수태 여부를 확인하고, 화상에 나타난 수를 확인하여 산자수를 결정하였다.
도축장에서 채취한 돼지난소를 25℃의 생리식 염수에 담아 실험실로 옮겨서 직경 2〜5mm의 난포에서 난자를 채취하고 10㎍/ml의 estradiol, 10IU/ ml 의 hCG와 PMSG 및 10%의 돼지난포액을 포함한 NCSU-23액(Petters와 Wells, ]993)에 넣어 38.5℃, 5% CO2 조건하에서 40〜42시간 동안 성숙배양을 하였다. 성숙배양이 완료된 난자를, 동결보존한 정액을 47℃에서 10초간 융해시킨 다음, 수정용 용액(mTBM + lmM caffeine+ 1.
데이터처리
통계처리는 결과를 종합하여 분산분석(ANOVA)과 Fisherprotected least significant difference (PLSD) test로 실시하였다.
성능/효과
3%의 glycerol를 첨가한 LEY에 다양한 당류를 첨가한 것으로 동결하였을 때, 융해후의 생존율에 있어서는 fructose를 단독 또는 fructose와 glucose를 함께 첨가한 구가 다른 구에 비하여 유의하게 높았으며(p<0.005), 정상첨체율에 있어서는 fructose와 glucose를 첨가한 구가 control 또는 다른 조합의 당류 첨가구에 비하여 유의하게 높았다(p<0.001). 이러한 결과는 당류, 특히 fiuctose는 정자의 동결과정중 정자세포내로의 동해방지제의 침투속도를 조절하여 정자세포내의 소기구를 보호하는 작용을 하여 정자의 생존율을 개선하는 효과가 있기 때문이라고 추측된다.
융해후의 정상 첨체율은 glucose 농도 증가와 함께 증가되었으 나, 생존율에 있어서는 효과가 인정되지 않았다. LEY에 fructose를 단독 또는 glucose 와 함께 첨가하면 융해후의 생존율이 유의하게 증가되었으며 (p<0.05), 정상 첨체율에 있어서는 LEY 보존액에 fiuctose와 glucose< 첨가한 구가 81.4±2.3%로 control의 41.6±0.6%에 비하여 유의하게 높았다 (p<0.001). 체외성숙 난자와의 수정율, 분할율 및 배반포 발생율은 70.
체외수정 기술을 이용하여 정자의 수정능력을 판단하기 위해 사용한 동일한 정액을 이용하여 암컷의 1회 발정에 2회의 인공수정을 실시하여 얻은 수태율과 복당 산자수는 Table 5와 같으며, 상용화 되어 있는 SGI사의 동결정액과의 비교에 있어서, 수태율은 83.3±0.1%로 유의하게 높았으며(p<0.05), 분만전 화상 임신진단에서 확인된 평균 산자수에서도 유의한 차이는 인정되지 않았으나 9.4±1.7〜 10.4士0.7두로서 SGI사의 8.0±1.1두보다 높았고, Jonson(1985)이 보고한 평균 산자수 7.5두보다도 높았다. 그러나 액상 정액과 비교하여 인공수정에 있어서 수태율과 평균 산자수가 낮으므로 이러한 문제점을 해결하기 위해서는 동결을 위한 희석액의 개발과 냉각속도 및 동결정자의 생존시간을 고려한 정확한 수정적기의 판정 등에 관하여 더 많은 연구가 필요하다고 생각된다.
후속연구
5두보다도 높았다. 그러나 액상 정액과 비교하여 인공수정에 있어서 수태율과 평균 산자수가 낮으므로 이러한 문제점을 해결하기 위해서는 동결을 위한 희석액의 개발과 냉각속도 및 동결정자의 생존시간을 고려한 정확한 수정적기의 판정 등에 관하여 더 많은 연구가 필요하다고 생각된다.
Visser와 Salamon(1973)도 fructose/} glucose보다 효과적으로 정자를 보호하며, 첨가되는 당의 농도에 의해 정자 보호 능력에 차이가 인정되며(Salamon 등, 1973a; Wilmut와 Polge, 1977b), maltose의 농도가 증가되면 정자의 생존율은 저하되지만 정상 첨체율은 증가한다고 보고하고 있다. 이러한 것으로 보아 돼지 정액을 동결 보존할 때, 희석액에 첨가하는 당은 그 종류에 따라 보존액 및 세포내의 삼투압 조절능력 또는 막 투과성 조절 능력이 다르며, 이러한 능력은 정자의 세포막을 포함한 정자 내부 세포 물질의 보호에 효과적으로 작용한다고 할 수 있어, 앞으로 다양한 당류 및 그 조합 또는 첨가 농도에 대한 검토가 필요하다고 할 수 있다.
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