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문제 정의
- 본 연구는 돼지 정액을 간편하고 실용적인 방법으로 동결시킬 수 있는 방법을 확립하기 위하여 돼지 정액 동결 시 예비동결온도, 동결속도 및 융해방법이 돼지 정자의 일반성상에 미치는 영향을 검토함과 동시에 동결 정액을 이용하여 인공수정을 실시할 경우 수태율에 대한영향을 간접적으로 검토하기 위하여 동결정액을 이용한 돼지 체외수정란의 체외발육율을 검토하였다.
제안 방법
- 1차 동결액은 11% a-lactose 용액에 20% 난황을 첨가하여 제조하였고, 2차 동결액은 1차 동결액에 1.5% Or- vus Es Paste(OEP ; Nova Chem., USA) 와 9% glycerol 을 첨가하여 준비하였다.
- B. Straw 제작 후 LN2 표면에서 10 및 5 cm 위에서 6, 4분 또는 3, 2분 동안 정치 후 LN2 내로 침적하였다(2-step 방법).
- C. Straw 제작 후 LN2 표면에서 17, 10 및 5 an 위에서 각각 2, 2, 1분 및 4, 4, 2분 정치 후 LN2 내로 침적하였다(3-step 방법).
- Makler Counting Chamber (Sefi-Medical Instruments, Islael)를 이용하여 위상차현미경 하에서 사멸정자, 진자운동 정자, 회전운동정자 등을 조사하고 -20 ℃ 에서 20분간 동결시킨 후 융해하여 총 정자수를 계산하여 전진 운동 비율을 계산하였다.
- Na-dtrate 2HQ와 fructose가 혼합된 150 mOsm의저장액을 만든 후 저장액 1 ml에 정자 부유액 100 μl 를 혼합하여 37℃에서 30분간 배양시킨 후 표본을 제작하여 위상차 현미경 하에서 정자 미부의 굴곡 여부를 관찰하였다. 정자의 원형질막 기능성 검사의 기준은 미부가 감겨 있거나, 나선형으로 감겨 있는 정자는 정자 원형질막의 기능이 손상되지 않은 것으로 판단하였다.
- 동결된 각 정액 straw를 LN2 용기에서 수일동안 보관 후 37℃ 및 52℃에서 10초와 45초 동안 융해하여 정액의 일반 성상을 검사하였다.
- 모든 처리구별 정액동결방법은 원정액과 희석액(Mulberry HI, Belgium)을 1:3으로 희석하여 cell freezer (FHK, Japan)를 이용하여 25℃에서 15℃까지 1시간 동안 냉각시킨 후 원심분리(406g, 20분, 15℃)시킨 후 상층 액을 제거하였고, 그 후 1차 동결액을 첨가하여 정자수가 lxlO9 정자/ml이 되도록 조정하였다. 그 후 5℃까지 2시간 동안 냉각시킨 후 2차 동결액을 1차 동결액의 1/2를첨가, 혼합시킨 후 straw를 제작하여 처리구별로 동결하였다.
- 배양 후, 10 pl의 정자 부유액에 동량의 DA- BCO(l, 4-Diazabicyclo-[2, 2, 2 octate) 와 혼합시킨 후 표본을 제작하고 형광현미경(Zeiss, Germany)하에서 푸른색 정자(사멸정자)와 붉은색 정자(생존정자)를 관찰하여 생사 유무를 판명하였다.
- 스티로폼 통을 이용하여 간편하게 1단계 방법으로 돼지 정액을 동결할 때 정치온도와 시간이 융해 후 돼지 정자의 생존율에 미치는 영향에 대한 결과를 표 2에 요약하였다. Styrofoam box 내 액체질소 표면 8 cm 상단 (-102℃)에서 10분간 정치 후 동결시킨 처리구의 융해 후 정자의 생존율이 74.
- 정자 pellet에 3.7% paraformaldehyde 용액을 첨가하여 30분간 고정, 원심분리하여 상층액을 제거한 후, PBS 를 첨가하여 혼합시킨 정자 부유액을 slide glass에 도말하고 0.25% Coomassie Brilliant Blue 용액으로 염색한 후 위상차현미경 (x400) 하에서 정자 첨체부위의 염색 유무를 조사하여, 두부가 푸르게 염색된 정자는 정상, 염색되지 않은 것은 이상정자로 구분하였다.
- 정자를 동결시키기 위한 냉각온도의 측정은 각각 styrofoam box에 액체질소를 6 cm 채우고 액체질소 위의 온도를 자동온도 측정기 (Fluke; USA)를 이용하여 측정하였다.
- 즉, 정자 부유액 50 μl를 도말하고, 실온에서 완전건조시킨 후 Rose-Bengal 염색액으로 염색한 후 건조시켜 위상차 현미경(x400) 하에서 기형정자를 관찰하였다.
- 체외수정 후 NCSU23 배양액(Peeters 등, 1993)에 2% bovine serum albumin(BSA ; Sigma)을 첨가하여 6~9일 동안 체외배양을 시킨 후 체외발육율을 조사하였다.
- A. Straw 제작 후 LN? 표면에서 5 및 10 cm 위에서 각각 5분과 10분간 정치 후 동결시킨 다음 LN2 내로 침적하였다(1-step 방법).
대상 데이터
- 강원도 원주시 원주 A-I center의 종모돈에서 수압 법으로 농후정액만을 분리하여 정액을 채취하여 돼지정액 보관고에 옮겨 25℃의 온도를 유지하면서 3시간 이내에 실험실로 운반하여 실험에 이용하였다.
데이터처리
- 본 실험에서 얻어진 결과에 대한 통계적 분석은 SAS package의 최소 유의차 검정 (least significant different test ; LSD test) 과 General linear model(GLM)을 이용하여 분석하였고, 처리 평균 간 비교는 Duncan의 다중검정법에 의하여 처리 간 유의차를 검정하였다.
이론/모형
- Rose-Bengal 염색방법을 이용하여 정자의 기형율을 측정하였다. 즉, 정자 부유액 50 μl를 도말하고, 실온에서 완전건조시킨 후 Rose-Bengal 염색액으로 염색한 후 건조시켜 위상차 현미경(x400) 하에서 기형정자를 관찰하였다.
- 돼지난자의 체외수정은 최 등(2002)의 방법에 준하여 실시하였다.
성능/효과
- 8%로 나타났으나 유의적인 차이는 인정되지 않았다(B 방법). 3단계 동결법(C 방법) 중에는 액체질소 위 17, 10, 5 an 위에서 2, 2, 1분 정치 후 동결한 정액의 융해 후 생존율이 22.0%, 4, 4, 2분간 정치 후 동결한 성적이 33.0%로 나타났으나 유의적인 차이는 인정되지 않았다.
- Styrofoam box 내 액체질소 표면 8 cm 상단 (-102℃)에서 10분간 정치 후 동결시킨 처리구의 융해 후 정자의 생존율이 74.0%로서 10 an(-8rC) 위에서 10 분(58.0%)과 15분48.3%)간 정치 후 동결시킨 처리구와 12 cm(-74℃) 위에서 10분(21.2%)간 및 15 cm(-59℃) 위에서 10분(33.3%)과 15분(38.3%)간 정치시킨 후 동결시킨 처리구보다 유의적으로 높은 결과를 나타냈다(F< 0.05).
- 1에 요약하였다. Table 1에서 나타난 바와 같이 A 방법, 즉 액체질소 5 an와 10 cm에서 각각 5분 또는 10 분간 정치 후 동결한 1단계 동결법의 정자의 생존율은 각각 13.0, 16.0, 21.0 및 54.0%로서 10 cm 위에서 10분간 정치 후 동결한 방법이 가장 좋게 나타났다(F<0.05). 액체질소 10 및 5 an 위에서 각각 3, 2분 또는 6, 4분 정치 후 동결한 2단계 동결법 중에는 정액의 융해 후 생존율이 각각 30.
- 0%로서 동결 방법에 따른 차이는 인정되지 않았다. 그림 1의 CTC 검사에서 나타난 바와 같이 수정능 획득 및 첨체반응이 일어나지 않은 비율(F) 은 1 step및 3-step 동결방법에서 각각 32.3과 34.4%로서 차이가 없었지만, 수정능 획득은 일어났지만 첨체 반응은 일어나지 않은 비율(B)의 경우 3-step의 성적이 39.7%로 서 l-step(32.5%)보다 유의적으로 높게 나타났으나(P< 0.05), 첨체반응이 일어난 비율(AR)에서는 3-step이 25.3 %와 1-step 이 38.8%로서 3-step 이 유의적으로 낮게 나타났다 (F<0.05).
- 동결정액을 37℃에서 10 및 45초 동안 융해한 결과 융해 후 정자의 생존율이 각각 49.5와 71.4%로서 37℃에서 45초간 융해한 정자의 생존율이 유의적으로 높았으며(P<0.05), 52℃ 에서 10 및 45초간 융해한 정자의 생존율은 각각 53.5와 7.8%로서 52 ℃ 에서 10초간 융해한 것이 유의적으로 높은 성적을 나타냈다(F<0.05). 한편, 37 및 52 ℃ 에서 융해시킨 후 정자의 평균 생존율은 37℃에서 융해한 정액이 60.
- 상실배까지의. 발육율은 1-step에서 21.3%로서 3-step의 10.3% 보다 유의적으로 높은 성적을 나타냈으나(F<0.05), 배반포까지 발육율은 각각 6.3%와 5.9%로서 커다란 차이는 인정되지 않았다.
- 그러나 Kumar 등 (2003)은 straw 제작 후 분당 -1, -30, -50 ℃ 로 냉각했을 경우 정자 융해 후 정자의 서존율에는 다소 차이는 인정되었지만 유의적인 차이는 없었다고 보고하였다. 본 실험의 결과 여러가지 동결방법 중 3단계 동결법보다는 1단계 동결방법이 융해 후 생존율이 양호하였다. 1단계 동결 방법 중 15℃에서 1차 동결액을 첨가시키고, 2시간에 걸쳐 분당 0.
- 본 실험의 결과 체외 수정에 이용되는 동결정액은 동결 방법에 따라 체외수정란의 체외발육에 다소 영향을 미치는 것으로 나타났다. 본 실험의 결과는 Almhd 등(1996)과 다소 상이한 결과를 나타냈다.
- Almlid 등(1996)은 Flatpack에 보관된 동결 정액을 이용하여 체외 수정을 실시한 경우 투명대 침입율은 증가하였으나 수정율 및 발육율에는 차이가 없었다고 보고하였다. 본 실험의 결과, 1 또는 3-step의 동결 방법으로 동결시킨 정액을 사용하여 체외수정을 실시한 결과분 할 율과 상실배 이상의 발육된 체외발육 성적은 1-step 의 결과가 3-step보다 높은 성적을 나타냈으나, 배반포까지의 발육에는 커다란 차이가 인정되지 않았다.
- 이와 같은 차이는 체외수정과정 자의 동결방법의 차이에 기인되는 것으로 사료된다. 본 실험의 결과를 종합해 보면 돼지 정액 동결 방법은 5℃에서 straw를 제작한 후, -102℃에서 10분간 정치시킨 후 동결 보존하는 Lstep 방법이 가장 좋은 것으로 사료된다.
- 임 등(1973)은 동결이 정자 두부에 미치는 효과를 조사하였는데, 융해 후 두부가 상해를 입은 정자는 전체 이상정자의 60% 이상을 차지한다고 보고하였으며, 加藤 등(1976)은 동결융해 후 정자의 두부 손상은 20% 정도였다고 보고하였다. 본 실험의결과 동결정액의 융해 후 동결방법에 따른 정자의 일반적 특성은 커다란 차이를 나타내지 않았으며, 첨체의 손상은 3-step 방법이 유의적으로 높게 나타났다.
- 수정란의 분할율은 49.7%와 41.5%로서 1- step이 유의적으로 높은 분할율을 나타내었다(P<0.05). 상실배까지의.
- 운동성, 유효정자율 및 기형율은 l-step에서 각각 74.5, 64.6 및 16.3%이었으며, 3-stepe 72.5, 59.5 및 16.9%로서 처리구별 커다란 차이는 인정되지 않았다. 정자의 첨체 정상성(CBB 염색법), 생존율(H258/PI 염색법) 및 HOST 양성 반응율은 1-step과 3-step에서 각각 87.
- 정자의 원형질막 기능성 검사의 기준은 미부가 감겨 있거나, 나선형으로 감겨 있는 정자는 정자 원형질막의 기능이 손상되지 않은 것으로 판단하였다.
- 9%로서 처리구별 커다란 차이는 인정되지 않았다. 정자의 첨체 정상성(CBB 염색법), 생존율(H258/PI 염색법) 및 HOST 양성 반응율은 1-step과 3-step에서 각각 87.1, 74.1, 22.1%와 88.1, 71.9, 21.0%로서 동결 방법에 따른 차이는 인정되지 않았다. 그림 1의 CTC 검사에서 나타난 바와 같이 수정능 획득 및 첨체반응이 일어나지 않은 비율(F) 은 1 step및 3-step 동결방법에서 각각 32.
- 05). 한편, 37 및 52 ℃ 에서 융해시킨 후 정자의 평균 생존율은 37℃에서 융해한 정액이 60.5% 로서 52℃에서 융해한 정액의 생존율(30.7%)보다 유의적으로 높은 성적을 나타났다(P<0.05).
후속연구
- 그러나 신선 정액의 이용은 체외에서 단기간 보존할 수밖에 없는 한계성이 있어, 동결 정액을 이용한 돼지의 개량의 필요성이 대두되고 있다. 돼지 정액의 체외 보존 한계성을 극복할 수 있는 최선의 방법은 돼지정액의 동결보존 기술을 향상시키는데있으며, 손쉽고 간편한 방법으로 돼지 정액을 동결할 수 있는 기술의 개발이 실용화 될 수 있다면 돼지 인공수정기술은 진보할 수 있을 것으로 기대된다.
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