선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 최근 6-DMMP의 돌연변이의 위험성이 보고되어 추후 규명이 필요할 것으로 생각된다(Katoh 등, 2004; Kim 등, 2004). 본 실험에서 돼지 난모세포의 적절한 활성화 처리 시기와 활성화 방법, 배양액에 대한 검토를 통해 체외에서 돼지 난모세포의 활성화 및 발달 조건을 알아보았다.
- 본 연구는 가축 유전자원의 효율적 보존방법의 개발을 위해 수행되는 체외 정자세포 생산연구의 일부로, 생산된 정자세포의 발생능을 검사하기 위한 체외 배양시스템을 확립할 목적으로 수행되었다. 성숙배양시간을 48시간으로 하여 7% ethanol 로 활성화 처리한 후 TCM199에 10%의 소태아 혈청으로 배양하였을 때 배반포까지 발달하지 못하였으나, NCSU23에 0.
제안 방법
- 상기 방법으로 48시간 이상 성숙배양한 난모세포-난구세포 복합체를 hyaluronidase(Sigma, USA) 300IU가 든 phosphate-buffered saline(PBS)에서 난구세포를 제거한 난자를 신선한 PBS로 씻은 후,7% ethanol(v/v)이든 PBS에서 7분간 활성화시키거나, BTX Electro Cell Manipulator (Biotechnolo gies and Experimental Research, Inc., San Diego, CA)를 이용하여 l~2.0kV/cm, 80㎲, 1 ~2 pulses 전기를 통전하여 활성화시키거나, calcium iono phore 5μM 농도에 6분 동안 처리하여 활성화된 난모세포를 5ug/ml cytochalasin B (CB)가든 TCM 199+10% FCS에서 5시간 노출 후, TCM199+10% FCS 소적이나 NCSU23+0.4% BSA 소적으로 옮겨 5〜7일간 배양하였다.
- 실험실에서 다시 난소를 세척한 후 물기를 제거하고 18G 주사침이 꽂힌 10ml 주사기로 외관상 2〜6nm 직경인 난포들만 골라서 난 포액을 흡입하여 페트리 접시에 옮겼다. 실체현미경 아래에서 여러 겹의 난구세포층이 탄탄하게 잘 부착된 균일한 색깔의 난구세포-난모세포복합체를 선별하여 PBS로 세척하였다. 성숙배양액으로 세척한 후 약 100개의 난구-난모 세포 복합체들을 1ml의 성숙배양에서 배양하였다.
- 실험 1 : 체외성숙을 48시간 동안 시킨 난모세포를 7% ethanol에서 7분간 활성화시키고, 5㎍/ml CB에 5시간 유지시킨 후 TCM199+10% FCS나 NCSU23+0.4% BSA에서 배양하여 배양액에 따른 발달율을 비교하였다.
- 실험 2: 체외성숙을 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72시간 동안 시킨 난모세포를 7% ethanol에서 7분간 활성화시킨 후 5㎍/ml CB를 5시간 유지시킨 후 NCSU23+0.4% BSA에서 배양하여 성숙시간에 따른 발달율을 비교하였다.
- 실험 3: 체외성숙을 68시간 동안 시킨 난모세포를 0.3M mannitol solution에서 1, 1.2, 1.4, 1.6, 1.8,2.0kV/cm, 80㎲, 1 ~2 pulses를 통전하여 활성화시킨 후 NCSU23+0.4% BSA에서 배양하여 통전 전압과 회수에 따른 발달율을 비교하였다.
- 실험 4: 체외성숙을 68시간 동안 시킨 난모세포를 7% ethanol에서 7분간 활성화시키거나, 전기 자극을 1.6kV/cm, 80㎲, 2 pulses를 통전하여 활성화시키거나, calcium ionophore 5uM 농도에 6분 동안 처리하여 활성화시킨 후 NCSU23+0.4% BSA에서 배양하여 활성화 처리에 따른 발달율을 비교하 였다.
대상 데이터
- 도축장에서 암퇘지에서 회수한 난소를 penicillin G(100IU/ml)와 streptomycin(100μg/ml)이 첨가된 식염수에 담근 상태로 보온병의 온도를 30〜 33℃로 유지하여 실험실로 옮겼다. 실험실에서 다시 난소를 세척한 후 물기를 제거하고 18G 주사침이 꽂힌 10ml 주사기로 외관상 2〜6nm 직경인 난포들만 골라서 난 포액을 흡입하여 페트리 접시에 옮겼다.
성능/효과
- 저조한 배발 달율을 향상시키기 위하여 성숙시간을 연장한 후, 활성화를 유기한 결과는 Table 2 와 같다. 48시간 체외성숙 후 활성화를 유기하였을 때 처리한 난모세포의 6%, 분할란의 9.1%가 배반 포기까지 발달하였으며, 52시간 성숙을 유기하였을 때는 총난자수의 10%, 분할란의 14.7%, 56시간 성숙을 유기했을 때는 총 난자수의 18.3%, 분할란의 25.6%, 60시간 성숙을 유기했을 때는 총난자수의 13.3%, 분할란의 25.0%, 64시간 성숙을 유기했을 때는 총난자수의 11.9%, 분할란의 24.2%, 68시간 성숙을 유기했을 때는 총 난자수의 15.7%, 분할란의 30.8%, 72시간 성숙을 유기했을 때 총 난자수의 7.2%, 분할란의 20.8%의 배반 포기 발달율을 얻을 수 있었다.
- 활성화 처리를 달리하여 배 발달율을 비교한 결과는 Table 4와 같다. 7% ethanol로 활성화 처리를 하였을 때 총 난자수의 15.7%, 분할란의 30.8%가 배반 포기로 발달하였으며, 전기적 자극으로 활성화 처리를 하였을 때 총 난자수의 9.5%, 분할란의 19.2%, calcium ionophore로 처리하였을 때 총 난자수의 5.8%, 분할란의 14.9%가 배반 포기로 발달하였다. 7% ethanol로 활성화 처리한 일부 배반포는 부화 단계까지 발달하였다(Fig.
- 전기자극의 강도와 회수를 달리하여 배 발생율을 검토하여 본 결과는 Table 3과 같다. IkV/cm로 1회 통전했을 때 배 발달율이 0%였으며, 2회 통전 했을 총난자수의 10%, 분할란의 21.1%가 배반 포기로 발달했으며, 1.2kV/cm로 1회 통전했을 때 배 발달율이 0%였으나, 2회 통전했을 때 총난자수의 7.5%, 분할란의 14.3%가 배반 포기로 발달하였고, 1.4kV/cm로 1회 통전했을 때 총 난자수의 6.3%, 분할란의 17.4%, 2회 통전했을 때 총 난자수의 7.5%, 분할란의 15%가 배반 포기로 발달하였고, 1.6kV/cm로 1회 통전했을 때 총난자수의 1.5%, 분할란의 6.3%, 2회 통전했을 때 총 난자수의 11.3%, 분할란의 22.5%가 배반 포기로 발달하였으며, 1.8kV/cm로 1회 통전했을 때 0%, 2회 통전했을 때 0%, 2.0kV/cm로 1회 통전했을 때 0%의 배반 포기로의 발달율을 얻을 수 있었다.
- 단위 발생란의 배양액에 따른 발달율은 Table 1과 같다. TCM199+10% FCS로 배양한 결과는 배반 포기까지 발달율이 0%였으나, NCSU23+0.4% BSA 처리구에서는 처리한 난모세포의 3%, 분할란의 7.1%가 배반 포기까지 발달하였다.
- 6kV/cm, 80㎲, 2회 통전이 본 실험조건에서 가장 높은 배발달율을 보였다. 난모세포를 인위적으로 활성화하는 데 주로 이용되는 7%에탄올법, 전기자극법, 그리고 calcium ionophore법을 직접적으로 비교하였을 때 7% 에탄올 법이 15.7%, 전기자극법이 9.5%, calcium ionophore법이 5.8%의 배반포 발달율을 보여, 본 실험조건에서는 7% 에탄올법이 배발달을 활성화시키는 데 가장 효율적인 것으로 나타났다.
- 세포질의 성숙 상태가 노화기일 때는 자체적으로 MPF의 생산이 저하되나(Ware 등, 1989; Hogen 등, 1991; Kikuchi등, 1995), 성숙상태가 피크일 때는 지속적으로 MPF를 생산하기 때문에 이러한 MPF의 지속적인 생산을 유지시키는 CSF의 유지를 막는 처리를 요하게 되며, 이를 위해 단백질 합성 저해제인 cycloheximide, puromycin, 핵산 생산 저해제인 6-di- methylaminopurine(6-DMAP)을 4~6시간 유지시켜 더 이상의 CSF 생산을 억제하게 할 수 있다 (Moses와 Masui, 1994). 돼지 난모세포의 핵성숙율은 44~48시간에 90% 이상이 제2감수 분열중기에 도달하였는데(미발표 자료), 성숙시간을 연장하였을 때 배발 달율이 증가하는 것으로 보아 MPF 의 활성이 저하되는 시점에서 활성화 처리가 배발달을 유기하는 데 유리한 것으로 생각되며, 72시간까지 성숙배양을 지속했을 때 분할율과 배발달율이 떨어지는 결과는 세포질의 노화로 배발달을 지지할 능력이 떨어진 것으로 추정된다. 단위 발생을 위한 활성화 처리는 성숙시간 56시간에서 68시간 이내로 하거나, MPF의 활성을 떨어뜨리는 처리가 필요할 것으로 사료된다.
- 대부분의 연구에서 활성화 정도는 난모세포의 성숙시간이 늘어날수록 증가하는 것으로 알려져 있으며(Bing 등, 2002), 발달에 최적인 난모세포들의 활성화 시기는 핵성숙과 세포질성숙이 완료된 시간과 성숙된 난모세포가 퇴행하는 시간 사이로 추정된다(Bing 등, 2003) .본 실험에서는 에탄올 처리로 활성화시켰을 때 성숙시간이 56〜68시간 사이에 높은 배발달율을 보여 핵성숙과 세포질성숙이 완성되는 시간이 56시간 이후로 예상되며 68시간 이후에는 배발달이 저하되는 것으로 보아 세포질 퇴행이 시작되는 시기로 추정된다. 통전을 연속해서 여러 번 통전하였을 때 더욱 좋은 결과를 보고하고 있는데, 본 실험에서도 전기적 활성화 처리를 68시간에 처리하였을 때, 1kV/cm의 낮은 전압에서는 활성화 정도가 낮았으며, 1.
- 8kV/cm 이상의 높은 전압에서는 세포질이 충격을 받아 퇴행하는 난모세포의 수가 높아지는 경향을 보였으며, 1회 통전에서는 배발 달율이 낮았으나, 2회 통전에서 배발 달율이 높아져 Zhu 등(2002)의 결과와 유사한 경향을 보이고 있다. 본 실험의 조건에서는 통전 지속시간을 80㎲로 했을 때 1.6kV/cm, 2회 통전이 실험 처리 중 가장 높은 발생능을 유기하였다.
- 4% 소혈청알 부민으로 배양하였을 때 3%의 활성화된 난모세포가 배반 포기까지 발달하였다. 성숙시간을 연장하여 48, 52, 56, 60, 64, 68, 그리고 72시간까지 성숙배양을 실시한 후 7% 에탄올로 활성화 처리하여 NCSU23+0.4% BSA로 배양하였을 때 56시간부터 68시간까지 배 발달율이 증가하였으나 72시간 성숙배양할 때 배 발달율이 다시 저하하여 활성화와 세포질퇴행간의 윈도우가 56시간부터 68시간 사이인 것으로 추정되었다. 전기자극의 강도를 1, 1.
- 토끼 난모세포를 calcium ionophore A23187과 thimerosal, ethanol을 처리하였을 때 작용 메커니즘은 달랐으나, 내부 calcium의 농도를 상승시키는 효과는 동일하였는데 분할율은 에탄올 처리가 다른 두 처리보다 유의적으로 높았다는 보고(Liu 등, 2002)와 들소의 난모세포체외수정과 에탄올, ionomycin으로 처리하였을 때 에탄올처리에서 가장 높은 분할율, 배반포 발달율 을 보였다는 보고가 있다(Gasparrini 등, 2004). 에탄올과 전기자극, calcium ionophore를 직접적으로 비교한 결과 본 실험에서는 활성화되는 작용기작을 검토하지는 않았으나 다른 보고들에 의하면 활성화 기작이 다른 경로로 진행되었을 것이며 본 실험의 방법에 따라서는 에탄올 처리가 가장 배발달을 촉진하였고 그 다음이 전기적 자극, 가장 낮은 발달율을 보인 처리가 calcium ionophore 처리로 나타났다.
- 4% BSA로 배양하였을 때 56시간부터 68시간까지 배 발달율이 증가하였으나 72시간 성숙배양할 때 배 발달율이 다시 저하하여 활성화와 세포질퇴행간의 윈도우가 56시간부터 68시간 사이인 것으로 추정되었다. 전기자극의 강도를 1, 1.2, 1.4, 1.6, 1.8 그리고 2.0kV/cm로 난모세포를 활성화 처리하였을 때 1회 통전으로는 적절한 활성화가 일어나지 않았으며 1.6kV/cm, 80㎲, 2회 통전이 본 실험조건에서 가장 높은 배발달율을 보였다. 난모세포를 인위적으로 활성화하는 데 주로 이용되는 7%에탄올법, 전기자극법, 그리고 calcium ionophore법을 직접적으로 비교하였을 때 7% 에탄올 법이 15.
- 본 실험에서는 에탄올 처리로 활성화시켰을 때 성숙시간이 56〜68시간 사이에 높은 배발달율을 보여 핵성숙과 세포질성숙이 완성되는 시간이 56시간 이후로 예상되며 68시간 이후에는 배발달이 저하되는 것으로 보아 세포질 퇴행이 시작되는 시기로 추정된다. 통전을 연속해서 여러 번 통전하였을 때 더욱 좋은 결과를 보고하고 있는데, 본 실험에서도 전기적 활성화 처리를 68시간에 처리하였을 때, 1kV/cm의 낮은 전압에서는 활성화 정도가 낮았으며, 1.8kV/cm 이상의 높은 전압에서는 세포질이 충격을 받아 퇴행하는 난모세포의 수가 높아지는 경향을 보였으며, 1회 통전에서는 배발 달율이 낮았으나, 2회 통전에서 배발 달율이 높아져 Zhu 등(2002)의 결과와 유사한 경향을 보이고 있다. 본 실험의 조건에서는 통전 지속시간을 80㎲로 했을 때 1.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.