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문제 정의
- . 본 연구에서는 구강 백반증 중 조직학적으로 상피 이형성이 없는 경우를 연구 대상으로 하여 편평세포암종으로의 암화과정을 배제하였다. 그러나 EGFR은 편평세포암종의 초기 단계에서부터 발현되기 때문에 조직학적으로 상피 이형성 소견이 없다 하더라도 이미 유전자적 변화가 일어나 EGFR의 발현이 증가하였을 가능성도 있을 것이라고 생각된다.
- 구강 점막에 만성 자극이 가해질 때 일어나는 두 병소에서의 서로 다른 반응 변화를 연구하기 위하여 상처 치유 기전에서 작용하는 인자 중 TGF-β1와 EGFR(epidermal growth factor receptor)의 분비 변화 양상을 관찰 대상으로 하였다. 본 연구에서는 자극성 섬유종과 구강 백반증에서 상처 치유 기전에 관여하는 TGF-β1과 EGFR의 발현 정도를 관찰함으로서 만성 자극에 대한 반응의 차이를 연구하여 상피-결합 조직간 신호 전달체계의 차이를 이해하고자 하였다.
제안 방법
- H/E 슬라이드를 검경하여 자극성 섬유종과 구강 백반증의 조직학적 양상을 관찰하였다.
- 이후 goat serum에 30분간 반응시킨 후 TGF-β1(토끼의 혈청에서 추출한 복합 항체, Santa Cruz사 제품, 1 : 50희석)와 EGFR(mouse의 혈청에서 추출한 복합 항체, Bio-Genex사 제품, 1 : 50 희석)을 일차 항체로 사용하여 각각 avidin-biotin 방법으로 면역조직화학염색을 시행하였다. 각 단계마다 phosphate buffered saline(PBS)으로 씻어냈고, DAB(3,3'- diamonobenzidine)로 발색한 다음 Mayer's hematoxylin으로 대조 염색하고 광학 현미경(Olympus, CX31, Tokyo, Japan)으로 관찰하였다. 음성 대조군으로는 일차 항체 대신 PBS를 반응시켰으며, 양성 대조군으로는 임신 3기의 태반 조직을 사용하여 함께 염색한 후 비교 관찰하였다.
- 구강 백반증을 조직학적으로 관찰하는 기준으로는 극세포층 두께 증가와 각화층 두께 증가, 상피 이형성, 상피 하부 결합 조직의 소견 등을 관찰하였다.
- 면역조직화학염색을 시행하기 위해 상기의 파라핀 포매 블록에서 박절 표본을 만들어 30분간 xylene 용액에 담가 파라핀을 제거하고 100%, 90%, 70% 에틸알코올에 순차적으로 함수하였다. 3% H2O2 용액으로 10분간 endogenous peroxidase를 제거한 후, 0.
- 본 연구에서는 자극성 섬유종의 병인론을 이해하고자 1997년 1월부터 2004년 12월까지 연세대학교 치과대학 구강병리학교실에서 자극성 섬유종으로 진단된 88예와 구강 백반증으로 진단된 44예를 대상으로 연구하였다. 상처 치유 기전에서 작용하는 인자 중 TGF-β1과 EGFR에 대한 일차 항체를 이용한 면역조직화학적 검색을 통하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
- , 점막 상피의 변화에도 관여한다. 섬유아세포의 교원질 합성 능력이 증가되거나 합성된 교원질의 양적 증가를 규명하기 위해서 섬유아세포에 작용하는 성장 인자 중 하나인 TGF-β1의 발현 양상을 관찰하였다. TGF-β는 모든 세포에서 생산되는 세포외 단백질이며 다기능 조절 인자로서 상피 세포와 결합 조직에 작용하여 이중적 기능을 나타낸다.
- 염색 후 각 슬라이드당 10개의 부위(상피 5부위, 결합 조직 5부위)를 임의로 선정하여 digital camera가 부착된 현미경(Olympus, BX51T, Tokyo, Japan)을 사용하여 200 배율로 사진 촬영하였다. 각 부위에서 상피의 경우는 기저막 상방에 위치하는 상피 부위의 상피 세포, 결합 조직의 경우는 기저막 하방 결합 조직내 위치하는 섬유아세포를 평가 대상으로 하였다.
- 각 단계마다 phosphate buffered saline(PBS)으로 씻어냈고, DAB(3,3'- diamonobenzidine)로 발색한 다음 Mayer's hematoxylin으로 대조 염색하고 광학 현미경(Olympus, CX31, Tokyo, Japan)으로 관찰하였다. 음성 대조군으로는 일차 항체 대신 PBS를 반응시켰으며, 양성 대조군으로는 임신 3기의 태반 조직을 사용하여 함께 염색한 후 비교 관찰하였다.
- 이후 에틸 알코올(ethyl alcohol)로 탈수하고 xylene으로 세척하여 파라핀으로 포매한 후 3 µm의 박절 표본을 제작하였다. 이 박절 표본을 탈파라핀화 과정과 에틸알코올 함수 과정, 수세 과정을 거쳐 H/E(hematoxylin and eosin) 염색을 시행하였다.
- 4% trypsin 용액으로 20분간 효소 처리하여 항원을 노출시켰다. 이후 goat serum에 30분간 반응시킨 후 TGF-β1(토끼의 혈청에서 추출한 복합 항체, Santa Cruz사 제품, 1 : 50희석)와 EGFR(mouse의 혈청에서 추출한 복합 항체, Bio-Genex사 제품, 1 : 50 희석)을 일차 항체로 사용하여 각각 avidin-biotin 방법으로 면역조직화학염색을 시행하였다. 각 단계마다 phosphate buffered saline(PBS)으로 씻어냈고, DAB(3,3'- diamonobenzidine)로 발색한 다음 Mayer's hematoxylin으로 대조 염색하고 광학 현미경(Olympus, CX31, Tokyo, Japan)으로 관찰하였다.
- 각 부위에서 상피의 경우는 기저막 상방에 위치하는 상피 부위의 상피 세포, 결합 조직의 경우는 기저막 하방 결합 조직내 위치하는 섬유아세포를 평가 대상으로 하였다. 임의로 선정된 부위에서 상피와 결합 조직 부위의 TGF-β1과 EGFR의 양성 발현 정도를 평가하기 위하여 각 선정 부위에서 양성 발현도를 4개 그룹으로 나누어 측정하는 semi-quantitive manner를 사용하였다6). (a) grade 0 : 양성 발현이 없는 경우(negative), (b) grade 1 : 양성 발현된 세포가 전체의 30% 이하인 경우(1+) (c) grade 2 : 양성 발현된 세포가 전체의 30~70%인 경우(2+) (d) grade 3 : 양성 발현된 세포가 전체의 70% 이상인 경우(3+) 각 그룹으로 분류한 후, 각 그룹마다 0~3점의 점수를 부여하여 점수화하였다.
- 자극성 섬유종을 조직학적으로 관찰하는 기준으로는 상피 증식 유무와 섬유종을 형성하고 있는 섬유아세포의 증식 양상과 교원질 섬유와의 배열 관계 등을 관찰하였다.
- 정상 구강 점막군과 자극성 섬유종, 구강 백반증 군 간 TGF-β1와 EGFR의 수치를 상피 부위 지수, 결합 조직 지수의 항목으로 나누어 독립 변수로 지정한 후 평가하였다. 자료의 분포가 정규 분포를 하지 않았고, 측정에 이용한 변수의 척도가 ordinal scale이었기 때문에 비모수 검정을 시행하였다. 정상 구강 점막군과 자극성 섬유종, 구강 백반증군간 TGF-β1와 EGFR 발현차이를 알아 보기 위해 Mann-Whitney U test를 이용하여 비교하였다.
- 정상 구강 점막군과 자극성 섬유종, 구강 백반증 군 간 TGF-β1와 EGFR의 수치를 상피 부위 지수, 결합 조직 지수의 항목으로 나누어 독립 변수로 지정한 후 평가하였다. 자료의 분포가 정규 분포를 하지 않았고, 측정에 이용한 변수의 척도가 ordinal scale이었기 때문에 비모수 검정을 시행하였다.
- 조직학적 관찰을 위해 생검된 정상 성인 9명과 자극성 섬유종, 구강 백반증 환자의 조직을 10% 중성 포르말린에 24시간 고정하고 증류수에 20분 세척하였다. 이후 에틸 알코올(ethyl alcohol)로 탈수하고 xylene으로 세척하여 파라핀으로 포매한 후 3 µm의 박절 표본을 제작하였다.
대상 데이터
- 1997년 1월부터 2004년 12월까지 연세대학교 치과대학 구강병리학 교실에서 구강 백반증으로 진단된 예 중 44예를 대상으로 하였다. 구강 백반증 상피 하부 결합 조직에 염증이 적고, 상피 이형성이 거의 없으며 조직 보관 상태가 양호하여 H/E 슬라이드의 검색이 가능한 예를 대상으로 하였다.
- 1997년 1월부터 2004년 12월까지 연세대학교 치과대학 구강병리학 교실에서 자극성 섬유종으로 진단된 예 중 88예를 대상으로 하였다.
- 염색 후 각 슬라이드당 10개의 부위(상피 5부위, 결합 조직 5부위)를 임의로 선정하여 digital camera가 부착된 현미경(Olympus, BX51T, Tokyo, Japan)을 사용하여 200 배율로 사진 촬영하였다. 각 부위에서 상피의 경우는 기저막 상방에 위치하는 상피 부위의 상피 세포, 결합 조직의 경우는 기저막 하방 결합 조직내 위치하는 섬유아세포를 평가 대상으로 하였다. 임의로 선정된 부위에서 상피와 결합 조직 부위의 TGF-β1과 EGFR의 양성 발현 정도를 평가하기 위하여 각 선정 부위에서 양성 발현도를 4개 그룹으로 나누어 측정하는 semi-quantitive manner를 사용하였다6).
- 1997년 1월부터 2004년 12월까지 연세대학교 치과대학 구강병리학 교실에서 구강 백반증으로 진단된 예 중 44예를 대상으로 하였다. 구강 백반증 상피 하부 결합 조직에 염증이 적고, 상피 이형성이 거의 없으며 조직 보관 상태가 양호하여 H/E 슬라이드의 검색이 가능한 예를 대상으로 하였다.
- 반면 구강 백반증은 만성 자극에 의해 상피 조직의 유전자적 변화를 일으켜 암종성 변화로 진행할 수 있는 전암 병소이다. 구강 점막에 만성 자극이 가해질 때 일어나는 두 병소에서의 서로 다른 반응 변화를 연구하기 위하여 상처 치유 기전에서 작용하는 인자 중 TGF-β1와 EGFR(epidermal growth factor receptor)의 분비 변화 양상을 관찰 대상으로 하였다. 본 연구에서는 자극성 섬유종과 구강 백반증에서 상처 치유 기전에 관여하는 TGF-β1과 EGFR의 발현 정도를 관찰함으로서 만성 자극에 대한 반응의 차이를 연구하여 상피-결합 조직간 신호 전달체계의 차이를 이해하고자 하였다.
- 본 연구에서는 자극성 섬유종의 병인론을 이해하고자 1997년 1월부터 2004년 12월까지 연세대학교 치과대학 구강병리학교실에서 자극성 섬유종으로 진단된 88예와 구강 백반증으로 진단된 44예를 대상으로 연구하였다. 상처 치유 기전에서 작용하는 인자 중 TGF-β1과 EGFR에 대한 일차 항체를 이용한 면역조직화학적 검색을 통하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
- 정상군의 연구 대상으로는 연세대학교 치과대학 부속 병원에 내원한 성인 남녀로서 흡연의 기왕력이 없으며 다른 구강 점막 병소가 없는 정상 성인의 구강점막을 채취하였다. 정상군으로 사용한 연구 대상은 총 9예였다.
- 정상군의 연구 대상으로는 연세대학교 치과대학 부속 병원에 내원한 성인 남녀로서 흡연의 기왕력이 없으며 다른 구강 점막 병소가 없는 정상 성인의 구강점막을 채취하였다. 정상군으로 사용한 연구 대상은 총 9예였다.
데이터처리
- 정상 구강 점막군과 자극성 섬유종, 구강 백반증군간 TGF-β1와 EGFR 발현차이를 알아 보기 위해 Mann-Whitney U test를 이용하여 비교하였다. TGF-β1와 EGFR군간의 상관관계는 피어슨 상관 계수를 구하였다. SAS(statistical analysis system) 8.
- 자료의 분포가 정규 분포를 하지 않았고, 측정에 이용한 변수의 척도가 ordinal scale이었기 때문에 비모수 검정을 시행하였다. 정상 구강 점막군과 자극성 섬유종, 구강 백반증군간 TGF-β1와 EGFR 발현차이를 알아 보기 위해 Mann-Whitney U test를 이용하여 비교하였다. TGF-β1와 EGFR군간의 상관관계는 피어슨 상관 계수를 구하였다.
성능/효과
- 1. TGF-β1의 면역조직화학염색 결과, 자극성 섬유종과 구강 백반증의 상피에서 TGF-β1 발현이 감소하였고 자극성 섬유종 종괴내 섬유아세포의 TGF-β1 발현이 증가하였다.
- 2. EGFR의 면역조직화학염색 결과, 자극성 섬유종과 구강 백반증 상피에서 EGFR의 발현이 증가하였다.
- 3. TGF-β1과 EGFR간 피어슨 상관 계수를 구하였을 때 구강 백반증의 상피 조직에서 역상관관계의 발현 양상을 나타내었다.
- 상피 하부 결합 조직에서는 양성 반응을 보이지 않았다. EGFR 염색 결과를 정상 구강 점막과 비교하였을 때 통계학적으로 의미 있는 차이를 나타내었다(p < 0.05).
- 4-c, Table 2). EGFR 염색 결과를 정상 구강 점막과 비교하였을 때 통계학적으로 의미 있는 차이를 나타내었으며, 자극성 섬유종과 비교하였을 때도 의미 있는 차이를 나타내었다(p < 0.05).
- EGFR의 면역조직화학염색 결과 정상 구강 점막과 자극성 섬유종, 구강 백반증의 염색 결과는 통계학적으로 유의한 차이를 나타내었다. 정상 구강 점막의 상피 조직에서는 기저층에서 양성 반응을 보였으며, 유극층 하방 1/3에 염색되는 세포들은 약양성 반응을 나타내었다.
- TGF-β는 포유류에서 모두 5가지 종류가 존재하는 것으로 알려져 있는데, 그중 TGF-β1은 상처 치유나 켈로이드 조직 형성에서도 발현되는 것으로 보고되어 있으며, 과다한 반흔 조직이 형성되는 경우 TGF-β1과 그 signaling pathway에서의 조절 기전에 이상이 있다는 연구 결과가 보고되었다8-10). TGF-β1의 면역조직화학적 염색 결과 상피 부위에서는 정상 구강 점막과 자극성 섬유종, 구강 백반증의 염색 결과는 통계학적으로 유의한 차이를 보였으나 자극성 섬유종과 구강 백반증의 염색 결과를 비교할 때 통계학적으로 유의한 차이를 보이지 않았다. 자극성 섬유종의 피개 상피는 일반적으로 위축되어 있다고 기술되나 본 연구에는 46예의 자극성 섬유종의 피개 상피에서 상피 증식 소견이 관찰되었고 구강 백반증에서도 극세포증이 관찰되었다.
- 05), 자극성 섬유종과 구강 백반증을 비교하였을 때는 통계학적으로 의미 있는 차이가 없었다. 결합 조직 부위의 TGF-β1 염색 결과를 비교하였을 때, 자극성 섬유종의 경우 TGF-β1 발현이 구강 백반증, 정상 구강 점막보다 증가하였으며, 통계학적으로 의미 있는 차이를 나타내었다(p < 0.05).
- 구강 백반증은 거의 모든 예에서 극세포층 두께 증가나 진성 각질 또는 착각질로 이루어진 각화층의 두께 증가를 보였다. 약 4예에서 상피 하부 결합 조직에 중등도의 염증 세포 침윤을 보였으며 결합 조직 세포의 충실도 증가는 관찰되지 않았다(Fig.
- 섬유아세포의 transformation은 기본적으로 EGFR과 같은 성장 인자 수용체의 활성화에 의해 이루어진다. 따라서 EGFR의 발현이 증가하면 세포외기질의 침착, 특히 교원질 합성이 촉진되며 EGFR의 autocrine function과 paracrine function이 섬유아세포를 자극하는 효과를 보이고 교원질 침착으로 유도하며, 이에 따라 섬유성 과증식 상태를 유발하는 것으로 보인다. 구강 점막의 만성 자극에 의해 EGFR의 분비가 증가하면 TGF-β1의 감소가 일어난다고 알려져 있다.
- 구강 점막의 만성 자극에 의해 EGFR의 분비가 증가하면 TGF-β1의 감소가 일어난다고 알려져 있다. 본 연구에서는 구강 백반증의 경우 EGFR과 TGF-β1간 피어슨 상관 계수가 -0.10로 나타나 기존의 연구를 뒷받침하는 것으로 생각되었다.
- 또한 유전적 치은 섬유증(hereditary gingival fibromatosis)이나 약물성 치은 과증식(drug-induced gingival hyperplasia)의 경우에서도 TGF-β 농도가 증가하는 것으로 보고되었다15-20). 본 연구에서도 정상 구강 점막에 비해 자극성 섬유종의 종괴 내 존재하는 섬유아세포의 양성 반응이 증가된 소견을 보였다. 따라서 TGF-β1은 섬유아세포를 자극하여 교원질을 다량 합성하며 자극성 섬유종 종괴 형성 과정에서 TGF-β1이 중요한 역할을 하는 것으로 생각되었다.
- 상관 계수를 구하였을 때 구강 백반증 상피 부위의 TGF-β1과 EGFR간 피어슨 상관 계수는 -0.10이었으며(p < 0.05), 자극성 섬유종 상피 부위에서는 통계학적으로 의미있는 상관관계를 보이지 않았다.
- 상피 부위의 TGF-β1 염색 결과를 비교하였을 때, 자극성 섬유종과 구강 백반증에서 정상 구강 점막보다 TGF-β1 발현이 감소하였으며 통계학적으로 의미 있는 차이를 나타내었으나(p < 0.05), 자극성 섬유종과 구강 백반증을 비교하였을 때는 통계학적으로 의미 있는 차이가 없었다. 결합 조직 부위의 TGF-β1 염색 결과를 비교하였을 때, 자극성 섬유종의 경우 TGF-β1 발현이 구강 백반증, 정상 구강 점막보다 증가하였으며, 통계학적으로 의미 있는 차이를 나타내었다(p < 0.
- 자극성 섬유종은 일반적으로 다양한 세포 충실도를 보이는 섬유아세포로 이루어져 있고 사이사이에 호산성으로 염색되는 굵은 교원질 섬유 다발이 관찰되었다. 섬유아세포의 조직학적 특징으로 단형의 핵을 보이며 세포질을 관찰할 수 없는 휴지기의 모습을 하고 있는 상태의 세포가 낮은 충실도로 관찰되었으며(Fig. 1-a, b), 종괴를 피개하는 상피에서는 46예에서 상피 증식을 보였다.
- 구강 백반증은 거의 모든 예에서 극세포층 두께 증가나 진성 각질 또는 착각질로 이루어진 각화층의 두께 증가를 보였다. 약 4예에서 상피 하부 결합 조직에 중등도의 염증 세포 침윤을 보였으며 결합 조직 세포의 충실도 증가는 관찰되지 않았다(Fig. 2).
- 이와 같은 결과를 종합해보면 구강 점막에 만성 자극이 가해지면 이에 관련한 신호가 기저막을 통하여 전달되고, 상처 치유 기전이 일어나 이에 의해 EGFR과 TGF-β1 발현 변화가 일어나는 것으로 생각된다. 자극성 섬유종의 경우 상피층의 EGFR 발현 증가와 TGF-β1 발현 감소에 의해 상피층의 조직학적 변화와 하부 결합 조직의 섬유화가 일어난다고 생각된다.
- TGF-β1의 면역조직화학적 염색 결과 상피 부위에서는 정상 구강 점막과 자극성 섬유종, 구강 백반증의 염색 결과는 통계학적으로 유의한 차이를 보였으나 자극성 섬유종과 구강 백반증의 염색 결과를 비교할 때 통계학적으로 유의한 차이를 보이지 않았다. 자극성 섬유종의 피개 상피는 일반적으로 위축되어 있다고 기술되나 본 연구에는 46예의 자극성 섬유종의 피개 상피에서 상피 증식 소견이 관찰되었고 구강 백반증에서도 극세포증이 관찰되었다. TGF-β는 각화 상피세포에서는 세포 주기 중 G1에서 S단계로의 이행 과정에서 세포 주기를 정지시켜 세포 증식을 억제하는 효과를 나타낸다.
- 자극성 섬유종의 피개 상피에서는 기저층과 유극층 상방에 이르기까지 EGFR이 강양성으로 염색되는 소견을 보여주어(Fig. 4-b, Table 2) 자극성 섬유종에서 EGFR 발현이 증가함을 나타내었다. 상피 하부 결합 조직에서는 양성 반응을 보이지 않았다.
- 자극성 섬유종의 피개 상피에서는 상피 증식을 보이는 경우는 유극층에서만 간헐적인 양성 반응을 보였으며(Fig. 3-c) 상피 위축을 보이는 경우에서는 기저층과 유극층에서 TGF-β1이 강양성으로 염색되는 소견을 나타냈다(Fig. 3-d). 자극성 섬유종 종괴 내에서는 섬유아세포와 대식 세포, 혈관 내피 세포에서 TGF-β1이 강양성으로 염색되어 발현 증가를 나타내었다(Fig.
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