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문제 정의
- Hagiwara 등29은 항산화제 N-acetylcysteine (NAC)이 bleomycin에 의한 폐 섬유화를 억제하는 것을 보고하여 ROS가 폐 섬유화에 관여함을 시사하였다. 본 연구에서는 조직 섬유화의 기전을 이해하고 섬유화를 예방 또는 억제하는 전략을 수립하기 위한 연구의 일환으로 폐 섬유아세포에서 TGF-β1에 의한 fibronectin 분비와 α-SMA 표현 상향조절에 ROS가 관여하는지를 검색하였다. 이를 위하여 MRC-5 세포를 이용하여 dichlorofluorescein (DCF)에 민감한 세포내 ROS를 FACScan으로 측정하였고, TGF-β1에 의한 fibronectin 분비와 αSMA 표현 상향조절에 미치는 항산화제의 효과를 관찰하였다.
- 그러나 폐 섬유아세포에서 세포내 ROS를 증가시키는 성장인자인 혈소판유래 성장인자(platelet-derived growth factor: PDGF)나 섬유아세포 성장인자(fibroblast growth factor: FGF)와 달리 TGF-β1은 세포외로의 ROS 분비를 증가시키고32 ECM 단백의 tyrosine 잔기를 산화시켜 교차결합을 증가시킴으로써 폐 섬유화에 관여할 수 있음이 보고33된바 있다. 본 연구의 목표는 신호전달자로서의 세포내 ROS의 역할 검색임으로 세포내 ROS를 측정하였다. MRC-5 세포에서 NADPH oxidase 억제제인 DPI가 TGF-β1에 의한 세포내 ROS, fibronectin 분비 및 α-SMA 표현의 상향조절을 억제함은 TGF-β1에 의한 세포내 ROS 증가에는 NADPH oxidase가 관여함을 시사한다.
제안 방법
- 본 연구에서는 조직 섬유화의 기전을 이해하고 섬유화를 예방 또는 억제하는 전략을 수립하기 위한 연구의 일환으로 폐 섬유아세포에서 TGF-β1에 의한 fibronectin 분비와 α-SMA 표현 상향조절에 ROS가 관여하는지를 검색하였다. 이를 위하여 MRC-5 세포를 이용하여 dichlorofluorescein (DCF)에 민감한 세포내 ROS를 FACScan으로 측정하였고, TGF-β1에 의한 fibronectin 분비와 αSMA 표현 상향조절에 미치는 항산화제의 효과를 관찰하였다.
- 세포가 배양 용기의 대부분을 채우면 우태아 혈청을 포함하지 않는 배지로 교체하여 24시간 배양함으로써 세포 성장을 정지시키고 성장 주기를 동일화 하였다. 이 후 실험 목적에 알맞게 혈청이 배제된 배지를 대조군으로 하고, 실험군은 0.
- 세포가 배양 용기의 대부분을 채우면 우태아 혈청을 포함하지 않는 배지로 교체하여 24시간 배양함으로써 세포 성장을 정지시키고 성장 주기를 동일화 하였다. 이 후 실험 목적에 알맞게 혈청이 배제된 배지를 대조군으로 하고, 실험군은 0.2-10 ng/ml TGF-β1(R&D, Mpls., MN, USA)을 첨가한 군으로 구성하여 96시간까지 배양하였다. 항산화제인 N-acetylcysteine(NAC: 5-30 mM)이나 NADPH oxidase 억제제인 diphenyleneiodonium (DPI: 0.
- , MN, USA)을 첨가한 군으로 구성하여 96시간까지 배양하였다. 항산화제인 N-acetylcysteine(NAC: 5-30 mM)이나 NADPH oxidase 억제제인 diphenyleneiodonium (DPI: 0.1-5 μM)은 TGF-β1 투여 1 시간 전부터 실험이 종료될 때까지 지속적으로 투여하였다. 배양액은 48시간에 동일한 실험 조건의 배양액으로 교환함으로써 포도당을 비롯한 영양 공급을 유지하였다.
- NAC와 DPI에 의하여 손상을 입은 세포로부터 배지 내로 유리되는 LDH를 측정함으로써 세포 독성을 정량하였다30. 세포 독성은 실험이 완료될 때까지 배지로 유리된 LDH 양과 분석 시점에서 1% Triton X-100으로 처치하여 인위적으로 세포들을 모두 파괴 시킨 후 측정한 세포내 LDH를 합한 총 LDH 양 중 배지로 유리된 LDH 양의 백분율(%)로 표시하였다.
- . 세포 독성은 실험이 완료될 때까지 배지로 유리된 LDH 양과 분석 시점에서 1% Triton X-100으로 처치하여 인위적으로 세포들을 모두 파괴 시킨 후 측정한 세포내 LDH를 합한 총 LDH 양 중 배지로 유리된 LDH 양의 백분율(%)로 표시하였다. 시료의 LDH는 pyruvic acid, 환원 형태의 β-nicotinamide adenosine dinucleotide (NADH)와 반응시켜 SOFTMAX PRO multiple reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 340 nm에서의 흡광도를 측정하였다.
- 세포 독성은 실험이 완료될 때까지 배지로 유리된 LDH 양과 분석 시점에서 1% Triton X-100으로 처치하여 인위적으로 세포들을 모두 파괴 시킨 후 측정한 세포내 LDH를 합한 총 LDH 양 중 배지로 유리된 LDH 양의 백분율(%)로 표시하였다. 시료의 LDH는 pyruvic acid, 환원 형태의 β-nicotinamide adenosine dinucleotide (NADH)와 반응시켜 SOFTMAX PRO multiple reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 340 nm에서의 흡광도를 측정하였다.
- 세포 단백량(20 μg)으로 보정된 배양액(농축이 필요하지 않음) 또는 세포 용해액에 reducing sample buffer를 넣고 95℃에서 5분간 끓였다. Fibronectin 단백과 α-SMA 단백 측정을 위해서 각각 5%와 10% polyacrylamide gel에서 전기영동하여 단백질을 분리하고 완충액을 이용하여 nitrocellulose 흡착지에 전이하였다. 흡착지를 blocking 용액(5% skim milk 및 0.
- 1% Tween 20이 포함된 TBS)에 넣고 1시간동안 반응을 시켰다. Peroxidase-conjugated rabbit antihuman fibronectin (DAKO, Glostrup, Denmark)을 이용하여 2시간 동안 반응을 시킨 후 washing 용액(0.1% Tween 20을 포함한 TBS)을 이용하여 15분간 한 번과 5분씩 세 번을 반복하여 반응하지 않은 항체를 제거하고 ECL solution kit (Amerham Pharmacia Biotech, England)를 이용하여 X-ray film을 이용하여 감광을 시켰다. α-SMA 단백은 1차 항체로 anti-mouse α-SMA antibody (1:2000)와 2차 항체인 anti-mouse IgG (Santa Cruz Biotechnology, Inc, Snata Cruz, CA, USA)를 이용하여 각각 2시간동안 반응시켰다.
- 1% Tween 20을 포함한 TBS)을 이용하여 15분간 한 번과 5분씩 세 번을 반복하여 반응하지 않은 항체를 제거하고 ECL solution kit (Amerham Pharmacia Biotech, England)를 이용하여 X-ray film을 이용하여 감광을 시켰다. α-SMA 단백은 1차 항체로 anti-mouse α-SMA antibody (1:2000)와 2차 항체인 anti-mouse IgG (Santa Cruz Biotechnology, Inc, Snata Cruz, CA, USA)를 이용하여 각각 2시간동안 반응시켰다. 감광된 필름을 scan 하여 density를 구하여 대조군과 비교하였다.
- α-SMA 단백은 1차 항체로 anti-mouse α-SMA antibody (1:2000)와 2차 항체인 anti-mouse IgG (Santa Cruz Biotechnology, Inc, Snata Cruz, CA, USA)를 이용하여 각각 2시간동안 반응시켰다. 감광된 필름을 scan 하여 density를 구하여 대조군과 비교하였다. α-SMA 단백은 anti-mouse β-actin antibody(1:10,000)로 보정하였다.
- , Eugene, OR, USA) 5 μM을 첨가하여 세포배양기에서 20분간 배양하였다. PBS로 씻어준 후 10,000 세포에 함유된 산화된 2’,7’-dichlorofluorescin(DCFH)의 형광을 488 nm excitation과 515-540 nm emission에서 측정하였다. TGF-β1에 의한 세포내 ROS의 측정은 예비실험 결과에 따라 TGF-β1 자극 후 30 분에 측정하였다.
- PBS로 씻어준 후 10,000 세포에 함유된 산화된 2’,7’-dichlorofluorescin(DCFH)의 형광을 488 nm excitation과 515-540 nm emission에서 측정하였다. TGF-β1에 의한 세포내 ROS의 측정은 예비실험 결과에 따라 TGF-β1 자극 후 30 분에 측정하였다.
- TGF-β1을 첨가하고 48시간(Figure 1A) 또는 96시간(Figure 1B) 후 배양액으로 분비된 fibronectin을 Western blot 분석으로 측정하였다. TGF-β1은 MRC-5세포의 fibronectin 분비를 용량의존적으로 증가시켰다.
- TGF-β1은 다양한 세포에서 활성산소족(reactive oxygen species: ROS)을 통하여 세포내 신호를 전달하고 α-smooth muscle actin (αSMA)의 신생합성을 통하여 상피세포와 폐 섬유아세포를 근 섬유아세포 표현형으로의 변화를 유도하는 주된 인자이다. ROS는 또 다양한 세포에서 세포외기질 (extracellular matrix: ECM) 축적을 유발하는 것이 알려져 있음으로 본 연구에서는 폐 섬유아세포인 MRC-5 세포에서 TGF-β1이 ROS를 매개하여 fibronectin 분비와 α-SMA 표현의 증가에 관여하는지를 검색하였다.
- 성장이 동일화된 MRC-5 세포를 TGF-β1 (0.2-10 ng/ml)으로 96 시간까지 자극하였고, 필요에 따라 항산화제인 N-acetylcysteine (NAC)이나 NADPH oxidase 억제제인 diphenyleniodonium (DPI)을 TGF-β1 투여 1 시간 전부터 전처리하였다. Dichlorofluorescein (DCF)에 민감한 세포내 ROS는 FACS로, 분비된 fibronectin과 세포의 α-SMA 표현은 Western blot 분석으로 측정하였다 .
- 실험이 완료된 후 배양 상층액을 취하여 원심분리한 후 aliquot하여 분석할 때 까지 –70℃에서 보관하였다. 세포 용해액(lysis buffer: 50mM Tris-HCl PH 7.5, 100mM NaCl, 2mM EDTA, 1mM dithiothritol, 0.1mM PMSF, leupeptin, aprotimin, 1% Triton X100)으로 세포를 용해한 후 Bio-Rad 분석 시약(BioRad Laboratories, Hercules, CA, USA)으로 단백량을 측정하였다. 세포 단백량(20 μg)으로 보정된 배양액(농축이 필요하지 않음) 또는 세포 용해액에 reducing sample buffer를 넣고 95℃에서 5분간 끓였다.
- MRC-5 세포의 TGF-β1에 의한 fibronectin 분비와α-SMA 단백 표현은 2 ng/ml 이상에서 48 시간과 96시간 모두에서 대조군과 비교하여 통계적으로 의미있게 증가하였으므로 항산화제 NAC와 NADPH oxidase 억제제 DPI의 영향을 관찰하기 위하여 2 ng/ml의 TGF-β1으로 48 시간동안 자극하였다. NAC는 20 과 30 mM에서 TGF-β1에 의한 fibronectin 분비를 의미있게 억제하였고(Figure 2A), 30 mM에서 α-SMA 표현을 의미있게 억제하였다(Figure 2B).
대상 데이터
- 실험에 사용한 재료는 따로 제시되지 않은 한 Sigma Chemical Company (St. Louis, MO, USA)와 Nalge Nunc International (Naper Ville, IL, USA)에서 구입하였다.
- 이미 성상이 확인되어 실험에 사용되고 있는 폐 섬유아세포주(MRC-5)를 American Type Culture Collection (ATCC: Rockville, MD, USA)에서 구입하여 5% 우태아 혈청이 포함된 5.6 mM 포도당 함유 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) 배지에서 배양하였다. 세포가 배양 용기를 가득 채우면 trypsin/EDTA(0.
데이터처리
- 모든 자료는 “평균값+표준 오차”로 기술하였다. 각 조건에서 실험군 간의 변화 양상을 검토하기 위하여 분산분석(analysis of variance: ANOVA)을 이용하였고, F 값이 의의가 있을 때에는 각 군간의 차이를 Fisher’s least significant difference 방법으로 비교하였다. P 값이 0.
이론/모형
- DCF에 민감한 세포내 ROS를 정량하기 위하여 FACS (Becton Dickinson Immunocytometry System, Mountain View, CA, USA)를 이용하였다26. 실험이 완료되면 5-(and-6)-chloromethyl-2',7'-dichloro-dihydrofluorescein diacetate (CM-H2DCFDA: Molecular Probes Inc.
- 2-10 ng/ml)으로 96 시간까지 자극하였고, 필요에 따라 항산화제인 N-acetylcysteine (NAC)이나 NADPH oxidase 억제제인 diphenyleniodonium (DPI)을 TGF-β1 투여 1 시간 전부터 전처리하였다. Dichlorofluorescein (DCF)에 민감한 세포내 ROS는 FACS로, 분비된 fibronectin과 세포의 α-SMA 표현은 Western blot 분석으로 측정하였다 .
성능/효과
- 혈청배제 DMEM에서 배양한 MRC-5 세포는 αSMA 단백을 미량 표현하였으며(Figures 1C와 D), TGF-β1 자극 후 48시간(Figure 1C) 또는 96시간(Figure 1D) 후 α-SMA 단백 표현은 TGF-β1에 의하여 용량의존적으로 증가하였다.
- 본 연구의 결과는 사람 폐 섬유아세포인 MRC-5 세포에서 TGF-β1이 세포내 ROS를 증가시키는 동시에 fibronectin의 분비와 α-SMA 표현을 증가시키고 항산화제인 NAC와 NADPH oxidase 억제제인 DPI가 TGF-β1에 의한 세포내 ROS의 증가 억제와 동시에 fibronecin 분비와 α-SMA 표현의 상향조절을 억제함을 관찰함으로써 NADPH oxidase에 의하여 생산된 ROS가 TGF-β1에 의한 폐 섬유화의 발생과 진행에 관여함을 증명하였다. Hagiwara 등29은 NAC가 bleomycin에 의한 폐 섬유화를 억제하는 것을 관찰하여 ROS가 폐 섬유화에 관여함을 시사하였다.
- 와 폐 섬유아세포14에서 보고되었다. 본 연구의 결과는 TGF-β1이 폐 섬유아세포에서 collagen I6 뿐 아니라 fibronectin의 분비도 상향 조절함으로써 ECM 축적에 관여하고 근 섬유아세포로의 표현형 변화를 유도하는 α-SMA 표현을 상향조절함으로써 폐 섬유화의 발생과 진행에 중요한 역할을 함을 확인하였다.
- 결론적으로, 본 연구는 폐 섬유아세포에서 TGF-β1에 의한 α-SMA의 표현과 fibronectin 분비의 증가에 ROS가 관여하는 것을 증명함으로써 TGF-β1에 의한폐 섬유화의 발생과 진행에 있어서 ROS가 중요한 역할을 담당한다는 증거를 제시하였다.
- 본 연구의 결과는 폐 섬유아세포에서 NADPH oxidase 에 의하여 생산된 ROS가 TGF-β1에 의한 fibronectin 분비와 α-SMA 표현을 상향조절함으로써 폐 섬유화의 발생과 진행에 관여할 수 있음을 증명하였다.
후속연구
- 폐의 근 섬유아세포는 기관지 또는 혈관외막(perivascular adventitium)에 존재하던 섬유아세포의 표현형이 변화된 것으로 생각된다. α-SMA의 표현이 근 섬유아세포로의 변화를 특징짓고 있기 때문에 폐 섬유아세포에서의 α-SMA의 표현 조절 기전을 이해하면 폐 섬유화의 발생과 진행을 억제할 수 있는 새로운 치료법을 제시할 수 있을 것이다.
- TGF-β1에 의한 세포내 신호전달에 Smad 경로와 MAPK 경로 사이의 cross-talk34,35이 있다는 것과 ROS가 MAPK의 상위 신호전달자임27은 알려져 있다. 폐 섬유아세포에서 ROS에 의한 fibronectin 분비와 α-SMA 표현의 상향조절에 관여하는 정확한 신호전달계는 추후 연구에서 규명되어야 할 것이다.
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