천식과 관련하여 산화스트레스 (Oxidant stress)는 그 발병요인 중의 하나로 알려져 있다. 이에 본 연구는 농산물과 한약재를 이용하여 항산화 물질을 찾고자 하였으며, 시간과 비용의 단축을 위하여 HTS인 throughput screening)을 이용을 하였다. 항산화 실험과 관련하여서 DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl), FRAP(ferric ion reducing antioxidant power), HO(hydroxyl radical) 소거, linoleic acid에 대한 항산화 활성 등을 시행하였다. 이후 $H_{2}O_2$에 의한 산화스트레스를 이용한 세포사멸을 유도하여 세포생존을 확인해 보았다. 실험결과 해바라기씨(Helianthus annuus), 신선초(Angelica utilis Makino), 시금치(Rehmannia glutinosa Libo) 등이 활성이 높게 나타났다. 본 연구는 여기에서 나온 hit를 이용하여 동물모델 실험을 진행하고자 한다.
천식과 관련하여 산화스트레스 (Oxidant stress)는 그 발병요인 중의 하나로 알려져 있다. 이에 본 연구는 농산물과 한약재를 이용하여 항산화 물질을 찾고자 하였으며, 시간과 비용의 단축을 위하여 HTS인 throughput screening)을 이용을 하였다. 항산화 실험과 관련하여서 DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl), FRAP(ferric ion reducing antioxidant power), HO(hydroxyl radical) 소거, linoleic acid에 대한 항산화 활성 등을 시행하였다. 이후 $H_{2}O_2$에 의한 산화스트레스를 이용한 세포사멸을 유도하여 세포생존을 확인해 보았다. 실험결과 해바라기씨(Helianthus annuus), 신선초(Angelica utilis Makino), 시금치(Rehmannia glutinosa Libo) 등이 활성이 높게 나타났다. 본 연구는 여기에서 나온 hit를 이용하여 동물모델 실험을 진행하고자 한다.
Oxidant stress is a well-known pivotal parameter for the degenerative immune diseases including asthma, atopic dermatitis, and rhinitis. In order to screen for anti-asthma agents effectively, we first established the infrastructure of high throughput screening(HTS) for anti-oxidant agents from agric...
Oxidant stress is a well-known pivotal parameter for the degenerative immune diseases including asthma, atopic dermatitis, and rhinitis. In order to screen for anti-asthma agents effectively, we first established the infrastructure of high throughput screening(HTS) for anti-oxidant agents from agricultural products and/or oriental medicine library extracted with water, methanol, dimethyl sulfoxide, ethyl acetate and juice, Using the screening system, we found that Chaenomelis langenariae, Rhus javanica L., Camellia sinensis, Helianthus annuus and Angelica utilis Makino had strong anti-oxidant activity. Moreover, Helianthus annuus, Rehmannia glutinosa Libo and Angelica utilis Makino have protection activities by treatment of an oxidant hydrogen peroxide. Together, these results suggest that screened agents could be potential agents against asthma, although the in vivo studies should be clearly tested.
Oxidant stress is a well-known pivotal parameter for the degenerative immune diseases including asthma, atopic dermatitis, and rhinitis. In order to screen for anti-asthma agents effectively, we first established the infrastructure of high throughput screening(HTS) for anti-oxidant agents from agricultural products and/or oriental medicine library extracted with water, methanol, dimethyl sulfoxide, ethyl acetate and juice, Using the screening system, we found that Chaenomelis langenariae, Rhus javanica L., Camellia sinensis, Helianthus annuus and Angelica utilis Makino had strong anti-oxidant activity. Moreover, Helianthus annuus, Rehmannia glutinosa Libo and Angelica utilis Makino have protection activities by treatment of an oxidant hydrogen peroxide. Together, these results suggest that screened agents could be potential agents against asthma, although the in vivo studies should be clearly tested.
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문제 정의
따라서 본 연구는 천식과 관련한 치료제를 개발하기 위한 일련의 과정 중 기능성 천식 완화 식품소재를 농산물(농산식품, 원예식물, 한약식물류 등)로부터 개발하고자 먼저 항산화제에 관련된 HTS system을 구축하고 이를 이용하여 식품소재 라이브러리로부터 활성이 인정되는 몇 가지의 추출물을 얻을 수 있었기에 이에 보고하고자 한다.
호흡기 질환에 있어 산화스트레스와 폐의 염증현상은 정도의 차이는 있지만 거의 비슷한 패턴으로 일어난다고 보여진다(10). 이러한 관점에서 본 연구는 농산물에서 산화 스트레스는 일어나게 하는 유발 물질로 알려진 superoxide 를 억제하는 식품소재를 HTS 시스템을 이용하여 알아보고 자 하였다. 또한 위의 실험에서 나온 몇 가지 물질을 이용하여 동물 실험모델 (ovalbumin-induced model)을 만들어 실제 in vivo에서 conttol에 비교하여 어느 정도 효과가 있는지를 실험 중에 있다.
본 연구는 두 가지 목적을 가지고 실험을 수행하였다. 천식과 연관한 산화스트레스에 대하여 이를 억제할 수 있는 물질을 찾는 것이며, 또한 이러한 실험을 대량으로 하기 위해 HTS 시스템을 이용하여 보다 빠른 시간에 보다 적은 비용으로 실험을 수행하는 시스템을 구축하는데 그 목적이 있다. 먼저 비교적 간단한 DPPH와 FRAP을 이용한 항산화 실험을 HTS 시스템을 활용하여 1,000여개의 물질로부터 후보물질을 약 100여개로 줄이고자 하였다.
제안 방법
MTT반응은 수용성의 tetrazolium salt를 포함한 CCK-2 kit을 이용하여 세포의 미토콘드리아의 탈수소 효소 (dehydrogenase)에 의해서 환원되는 formazan의 양을 450 nm에서 측정하였다. 본 실험에서는 氏。2로 산화 스트레스를 주어서 세포사멸을 유도한 다음 세포의 생존율을 이용하여 각각의 후보물질(hit)이 가지는 활성을 측정하였다(20).
DPPH radical 소거 활성능 측정은 이전에 보고된 방법을 응용하여 실험을 하였다. 각 추출물의 시 료를 10 uL와 0.
Hydroxyl radical 소거 활성은 Fe11 와 H2O2가 반응하는 Fenton 반응을 이용하여 2-deoxyribose를 산화시켜 MDA (malondialdehyde)로 분해시킬때 나오는 MDA를 530 nm에서 측정하여 활성을 알아보았다. 반응액으로는 50 mM의 FeSO4·7H2O: 50 mM의 EDTA (ethylene diamine tetra acetic acid) : 50 mM 2-deoxyribose를 1 : 1 : 2의 비율로 혼합한 다음 반응액 (190 μL)과 시료 (10 μL)를 썩었다.
Linoleic acid 항산화 활성 실험은 linoleic acid를 기질로 하여 과산화 지질을 억제하는 방법을 이용하여 실험에 응용을 하였다. 과산화지질 (Linoleic acid)에 의해 FeⅡ가 FeⅢ로 산화가 되고 이때 FeⅡ의 반응물인 ammonium thiocyanate을 넣어 이를 ELISA에서 정량을 한 것이다.
MTT반응은 수용성의 tetrazolium salt를 포함한 CCK-2 kit을 이용하여 세포의 미토콘드리아의 탈수소 효소 (dehydrogenase)에 의해서 환원되는 formazan의 양을 450 nm에서 측정하였다. 본 실험에서는 氏。2로 산화 스트레스를 주어서 세포사멸을 유도한 다음 세포의 생존율을 이용하여 각각의 후보물질(hit)이 가지는 활성을 측정하였다(20).
천식과 연관한 산화스트레스에 대하여 이를 억제할 수 있는 물질을 찾는 것이며, 또한 이러한 실험을 대량으로 하기 위해 HTS 시스템을 이용하여 보다 빠른 시간에 보다 적은 비용으로 실험을 수행하는 시스템을 구축하는데 그 목적이 있다. 먼저 비교적 간단한 DPPH와 FRAP을 이용한 항산화 실험을 HTS 시스템을 활용하여 1,000여개의 물질로부터 후보물질을 약 100여개로 줄이고자 하였다. DPPH와 FRAP 활성 실험은 매우 간단하면서도 강력한 항산화제 검색 방법으로서 많이 이용되어지고 있다.
서울 경동시장으로부터 구입한 한약재 200여종과 한국 식물추출은행으로부터 구입한 50여종의 재료를 각각 용매 별로 다르게 추출을 하여 약 1,000여개의 library를 제작하였다. 한약재와 건과류는 증류수, DMSO, ethyl alcohol, methyl alcohol, ethyl acetate 를 이용하여 24 시간동안 추출과정(0.1-0.5 g/mL)을 거쳤으며, 증류수 추출물은 섭씨 60°C에서 열수 추출을 하였다. 채소류의 경우는 막자사발을 이용하여 파쇄 후 그 추출액을 이용하였다.
6, 300 mM) : 10 mM의 TPTZ (2, 4, 6-tripyridyl-s-triazine) 20 mM의 FeCl6H2O를 10 : 1 : 1의 비율로 썩어 실험직전에 만들어 사용을 하였다 반응액 (190 μL)와 추출물 (10 μL)을 혼합한 후 100초 간격으로 약 15분간 590 nm에서 흡광도를 측정하였다. 환원력은 시간에 따른 상대비교를 하였으며, 재료별 활성정도는 15분 후의 값을 기준으로 하였다(17).
대상 데이터
HIS를 이용한 hit 검색을 위하여 한국생명공학연구원에 설치되어 운용하고 있는 시스템을 사용하였다. Liquid handler (CyBio, Jena, Germany), multi-label counter (VICT0R2, Wallac, Turku, Finland) 와 robotic arm (Thermo-CRS, Burlington, Canada) 등이 사용되었다.
Louis, MO), CCk-8 kit (water-soluble tetrazolium salt; 2-(2-methoxy-4- nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2, 4-disulfophenyl) -2H-tetrazolium. monosodium salt; DOJINDO, Kumamoto, Japan) 등이 사용되었다.
본 실험에 사용한 재료로서 한약재의 경우 서울 경동시장의 한약상회에서 공급받아 실험에 사용하였으며, 농산물과 일부 한약재의 경우는 한국생명공학연구원 내의 자생식물이용개발사업단 한국식물추출은행에서 구입 후 사용하 였다.
서울 경동시장으로부터 구입한 한약재 200여종과 한국 식물추출은행으로부터 구입한 50여종의 재료를 각각 용매 별로 다르게 추출을 하여 약 1,000여개의 library를 제작하였다. 한약재와 건과류는 증류수, DMSO, ethyl alcohol, methyl alcohol, ethyl acetate 를 이용하여 24 시간동안 추출과정(0.
성능/효과
DMSO 추출물에 있어서는 잣(Hms koraiensis), 건포도, 파스타치오, 땅콩(Arachis hypogaea L) 등에서 높은 활성을 보였다. Ethanol 추출물에 있어서는 밤(Melissa officinalis), 파스타치오, 해바리기씨, 호박씨, 땅콩, 은행(Ginkgo bioba) 등이 활성을 나타내었다.
DW 추출물에 있어서는 오가피 (Acanthopanax senticosus), 녹차엽 (Camellia sinensis), 별갑(Amydae carapax), 빈랑(Arecae pericarpiuni), 죽여(Bambusae cauhs Taeniam), 골담초(Caragana sinica Rehder) 등이 높게 나타났다. DMSO의 추 출물에서는 측백(Biotae orientalis Foliun), 해당근(Chaenomilis langenariae), 계지(Cinnamomum cassia Blume), 산수유{Comas officinalis), 비파엽(Erybotrya japonica Lindl), 오배자(Rhus javamca L) 등이 나타났다. Ethanol 추출물의 경우는 빈랑, 소목, 강황, 오배자, 계혈등, 호장군(Reynoutria japonica Houtt)등이 항상화 활성이 높게 나타났다.
DPPH 항산화 활성 실험에서는 추출용매에 따라서 그 활성이 다양하게 나타났다. DW 추출물에 있어서는 오가피 (Acanthopanax senticosus), 녹차엽 (Camellia sinensis), 별갑(Amydae carapax), 빈랑(Arecae pericarpiuni), 죽여(Bambusae cauhs Taeniam), 골담초(Caragana sinica Rehder) 등이 높게 나타났다. DMSO의 추 출물에서는 측백(Biotae orientalis Foliun), 해당근(Chaenomilis langenariae), 계지(Cinnamomum cassia Blume), 산수유{Comas officinalis), 비파엽(Erybotrya japonica Lindl), 오배자(Rhus javamca L) 등이 나타났다.
Hydrogen peroxide에 의한 세포사멸을 억제하는 것으로 다음과 같은 결과를 얻을 수 있었다. DW 추출물의 경우 해바라기씨, ethyl acetate의 경우 잣, 쥬스의 경우 신선초와 시금치(Rehmannia glutinosa Libo)에서 그 활성이 높게 나타났다(Fig. 3). 호흡기 질환에 있어 산화스트레스와 폐의 염증현상은 정도의 차이는 있지만 거의 비슷한 패턴으로 일어난다고 보여진다(10).
DMSO의 추 출물에서는 측백(Biotae orientalis Foliun), 해당근(Chaenomilis langenariae), 계지(Cinnamomum cassia Blume), 산수유{Comas officinalis), 비파엽(Erybotrya japonica Lindl), 오배자(Rhus javamca L) 등이 나타났다. Ethanol 추출물의 경우는 빈랑, 소목, 강황, 오배자, 계혈등, 호장군(Reynoutria japonica Houtt)등이 항상화 활성이 높게 나타났다. 한편 쥬스의 경우는 잎당귀(Anglicagigas Nakai), 케일(Brassica oleracea var), 레드치커리(Cichorium insybus)등이 활성이 높게 나타낫다.
Linoleic acid 항산화 실험결과 DW 추출물에 있어서는 잣(Pinus koraiensis), 건포도(Aphis gossypii Grover), 파스타 치오(PisHzchia vera), 해바라기씨 (Crocus vernus), 호박씨 (Cucurbita moschata) 등이 활성이 높게 나타났다.
Ethanol 추출물의 경우 건포도, 밤, 해바라기씨, 잣, 파스타치오 등이 활성을 나타내었다. Methanol의 경우 밤, 해바라기씨, 잣 등이 활성을 보였으며, 쥬스의 경우 신선초(/bigeZzca utilis Makino)가 활성이 높게 나타났다(Fig. 2d).
한편 쥬스의 경우는 잎당귀(Anglicagigas Nakai), 케일(Brassica oleracea var), 레드치커리(Cichorium insybus)등이 활성이 높게 나타낫다. 추출물질에 따라 차이를 보였으나 전체적으로 활성이 높게 나온 것으로는 해당근, 오배자, 연자육, 금앵자(Rose laevigatae), 등 이었다.(Fig.
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