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문제 정의
- 이 연구에서는 우슬뿌리가 예전부터 민간요법으로관절 염치료에 이용되어오고 있는 바 우슬뿌리의 cathepsin 日게 대한 저해효과를 알아보기 위하여 우슬뿌리를 각 용매로 계통분획 · 분리한 후 그 분획추출물에 대하여 cathepsin B의 활성억제효과를 검토하여 보았다.
제안 방법
- 22 mM 을 dimethylsulfoxide 에 녹여 사용하였고 N a-benzoyl-DL- arginine-β-naphthylamide(BANA) 는 171 mM농도를 n, n-dtmethylformamide에 녹여 각 50 µL를 녹여 반응시켰으며 저해물질 용액은 100 µL를 취하여 반응시켰다. CLN 기질의 경우 326 nm에서 BANA 기질의 경우 340 nm에서 25ºC에 각 반응시간에 따라 반응시킨 후 저해활성의 기울기 값(V0)을 이용하여 저해활성도를 측정하였다(23). 즉 저해물질이 첨가되지 않은 기질과 효소의 반응을 A, 기질과 효소 그리고 저해물질을 첨가한 반응을 B, 효소가 첨가되지 않은 기질과 저해물질의 반응을 C라고 할 때 저해활성도를 다음 식으로 계산하였다.
- Cathepsin B 저해활성이 있는 분획이 우슬뿌리에 많이 함유되어있는 성분인 20-hydroxy ecdysone물질인지를 확인하기 위하여 Son 등(24) 및 Kim(25)의 방법에 준하여 각 용매로 추출 분획 한 추출물을 가지고 silica gel 60F254 TLC plate(20x20 cm, Merck At. 5642)상에 점적한 후 물질 을 확인하였다. 이때 20-hydroxy ecdysone을 전개시킨 용매로는 ethanol/ethylacetate(1:5, v/v)를 사용하였으며 UV 254 nm에서 확인하였다.
- TLC에서 band가 확인된 F4분획을 HPLC를 이용하여 다시 우슬뿌리의 지표물질인 20-hydroxy ecdysone의 여부를 재확인하였다. 이때 사용된 HPLC는 Waters 510(USA) 기기를 이용하였으며 그 분석조건은 Table 1과 같다.
- 즉 건조시료 1 g 을 질산, 과염소산과 질산액의 혼합액 및 염산을 순차적으로 이용하여 분해시킨 후 일정량으로 희석, 여과한 후 ICP analyzer (GBC Integra XMP, AustraHa)를 사용하여 원자흡광 광도법으로 정량하였다(21) . 사포닌함량은 시료분말 5 g을 둥근플라스크에 취한 후 70% methanol 100 mL로 80°C 수욕조에서 2시간씩 3회 반복 추출하여 얻은 추출액을 여과지 (whatman No. 41)로 여과한 후 8,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상징액을 회수하였다 이 상징액을 농축하여 증류수로 용해한 다음 분액여두에 옮겨서 diethylether로 탈지시킨 다음 남은 수층에 수포화부탄올 50 mL 씩 3회 반복추출이행 하여 회수, 농축한 것을 조사포닌으로 계산하였다(22).
- 우슬뿌리는 세척, 건조한 후 분쇄기를 이용하여 분쇄한 뒤 사용하였다. 시료를 메탄올:물(4:1, v/v)의 비율의 용매로 추출한 후 Fig. 1과 같이 용매별로 순차적으로 추출 분획하였다. 얻어진 각각의 추출물들을 감압 농축한 다음 각각의 추출수율(%)을 계산하였다.
- 1과 같이 용매별로 순차적으로 추출 분획하였다. 얻어진 각각의 추출물들을 감압 농축한 다음 각각의 추출수율(%)을 계산하였다.
- 우슬의 지표물질인 20-hydroxy ecdysone의 cathepsin B에 대한 저해활성을 나타내는지를 확인하기 위하여 BANA와 CLN을 기질로 하여 cathepsin B 에 대한 저해활성을 측정하였으며 이를 F4추출물과 cathepsin B저해물질인 leupeptin과 함께 그 활성을 비교한 결과 Fig. 5와 같다. 20-hydroxy ecdysone, leupeptin 및 우슬 추출분획인 F4 모두가 기질을 BANA로 사용하였을 경우 cathepsin B 에 대한 저해력이 80%이상을 보였지만 CLN을 기질로 하였을 경우는 낮은 저해력을 보였다.
- 우슬이 민간요법으로 관절염 치료에 우수한 한약재로 알려진 바 우슬 추출물이 cathepsin B 에 대한 저해력을 검토하기 위하여 각종 용매로 우슬 추출물을 순차 분획하고 분획 추출물에 대하여 cathepsin B 에 대한 저해활성을 검토하였으며 우슬의 지표물질인 20-hydroxy ecdysone이 추출분획에 검출되는지 TLC 및 HWLC를 이용하여 분석하였으며 우슬의 지표물질이 cathepsin B 에 대한 저해활성여부를 확인한바 다음과 같은 결과를 얻었다. 우슬 뿌리에 대해 methanol/water(4:1, v/v) 추출물을 ethyl acetate, chloroform, chloroform/methanol(3.
- 즉 저해물질이 첨가되지 않은 기질과 효소의 반응을 A, 기질과 효소 그리고 저해물질을 첨가한 반응을 B, 효소가 첨가되지 않은 기질과 저해물질의 반응을 C라고 할 때 저해활성도를 다음 식으로 계산하였다. 이때 쇠무릎추출물의 cathepsin B의 저해활성도를 비교검토하기 위하여 cathepsin B 저해제로 알려진 leupeptin(16)의 일정량을 반응시켜 저해활성을 비교 분석하였다.
- 즉 수분함량은 105°C 상압가열건조법, 조지방은 Soxhelet 추출법, 조회분은 건식회화법, 조단백질은 Kjeldahl 법으로 분석하였으며 무기이온 분석은 습식법으로 전처리하였다. 즉 건조시료 1 g 을 질산, 과염소산과 질산액의 혼합액 및 염산을 순차적으로 이용하여 분해시킨 후 일정량으로 희석, 여과한 후 ICP analyzer (GBC Integra XMP, AustraHa)를 사용하여 원자흡광 광도법으로 정량하였다(21) . 사포닌함량은 시료분말 5 g을 둥근플라스크에 취한 후 70% methanol 100 mL로 80°C 수욕조에서 2시간씩 3회 반복 추출하여 얻은 추출액을 여과지 (whatman No.
- CLN 기질의 경우 326 nm에서 BANA 기질의 경우 340 nm에서 25ºC에 각 반응시간에 따라 반응시킨 후 저해활성의 기울기 값(V0)을 이용하여 저해활성도를 측정하였다(23). 즉 저해물질이 첨가되지 않은 기질과 효소의 반응을 A, 기질과 효소 그리고 저해물질을 첨가한 반응을 B, 효소가 첨가되지 않은 기질과 저해물질의 반응을 C라고 할 때 저해활성도를 다음 식으로 계산하였다. 이때 쇠무릎추출물의 cathepsin B의 저해활성도를 비교검토하기 위하여 cathepsin B 저해제로 알려진 leupeptin(16)의 일정량을 반응시켜 저해활성을 비교 분석하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용한 우슬은 충남 부여군 초촌면에서 2003년도에 재배한 것을 수확하여 세척 건조하여 사용하였다. 효소로 사용한 cathepsin B(EC 3.
- 충남 부여군 초촌면 일대에서 재배 수확한 우슬 뿌리를 세척 건조한 후 분쇄하여 30 g을 환류냉각기를 부착시킨 플라스크에 넣은 후 시료 중량의 20배의 methanol/water (4:1, v/v)용매로 추출하여 Fig. 1과 같은 방법으로 추출분획하여 얻은 용매별 추출물을 감압 농축하여 얻은 추출수율은 Table 4와 같았다.
- 본 실험에 사용한 우슬은 충남 부여군 초촌면에서 2003년도에 재배한 것을 수확하여 세척 건조하여 사용하였다. 효소로 사용한 cathepsin B(EC 3.4.22.1)는 bovine으로부터 추출한 Sigg사 제품을 사용하였다. 효소의 기질로 사용한 CLN(Na-CBZ(carbobenzlyoxy)-L-lysine p- nitrophenyl ester HC1) 과 BANA(Na-benzoyl-DL-arginine β-naphthylamide), 저해효과를 비교검토하기 위하여 저해제로 개발되어진 leupeptin과 우슬의 지표물질인 20-hydroxy ecdysone 등의 시약은 Sigma사에서 구입하여 사용하였다.
- 1)는 bovine으로부터 추출한 Sigg사 제품을 사용하였다. 효소의 기질로 사용한 CLN(Na-CBZ(carbobenzlyoxy)-L-lysine p- nitrophenyl ester HC1) 과 BANA(Na-benzoyl-DL-arginine β-naphthylamide), 저해효과를 비교검토하기 위하여 저해제로 개발되어진 leupeptin과 우슬의 지표물질인 20-hydroxy ecdysone 등의 시약은 Sigma사에서 구입하여 사용하였다.
이론/모형
- Cathepsin B 저해물질의 활성도 측정은 Han 등(19)의 방법에 준하여 측정하였다. 즉 분광광도계의 1 mL cuvette내 에 25 mM sodium acetate buffer(pH 5.
- 우슬뿌리의 일반성분은 AOAC방법에 따라 분석하였다(20). 즉 수분함량은 105°C 상압가열건조법, 조지방은 Soxhelet 추출법, 조회분은 건식회화법, 조단백질은 Kjeldahl 법으로 분석하였으며 무기이온 분석은 습식법으로 전처리하였다.
- 우슬뿌리의 일반성분은 AOAC방법에 따라 분석하였다(20). 즉 수분함량은 105°C 상압가열건조법, 조지방은 Soxhelet 추출법, 조회분은 건식회화법, 조단백질은 Kjeldahl 법으로 분석하였으며 무기이온 분석은 습식법으로 전처리하였다. 즉 건조시료 1 g 을 질산, 과염소산과 질산액의 혼합액 및 염산을 순차적으로 이용하여 분해시킨 후 일정량으로 희석, 여과한 후 ICP analyzer (GBC Integra XMP, AustraHa)를 사용하여 원자흡광 광도법으로 정량하였다(21) .
성능/효과
- 33%이었다. 20-hydroxy ecdy딩one 에 대하여 cathepsin B저해활성을 보기 위하여 cathepsin B저해활성제로 알려진 leupeptin과 활성을 비교해본 결과 기질을 BANA로 사용하였을 경우 leupeptin-cr 저해율이 92%인데 비하여 20- hydroxy ecdysone은 88%이었으며 F4분획물은 97%를 나타내었고 기질을 CLN으로 사용하였을 경우 leupeptin은 저해율이 62%인데 비하여 20-hydroxy ecdysone은 36%이었으며 F4 추출물은 67%를 나타내었다.
- 2와 같다. F4인 methanol 분획에서 cathepsin B에 대한 저해활성이 가장 높게 나타났으며 다음으로 F1 인 ethyl acetate 분획, F3인 chloroform/methanol(3:1, v/v)분획 에서 cathepsin B에 대한 저해활성이 나타났는데 chkmform 분획에서는 오히려 cathepsin B에 대한 저해활성보다는 촉진효과가 나타났다. 이는 분획물 자체가 정제된 단일물질이 아니어서 그 분획물 내에 cathepsin B 에 대한 활성을 억제 및 촉진하는 인자가 존재하고 있는 것으로 생각되며 이는 앞으로 더 연구해볼 필요가 있다고 생각된다.
- TLC에서 우슬의 지표물질이 다량 함유된 fraction 4를 HPLC로 분석한 결과 Fig. 4와 같이 RT가 19.65에서 20- hydroxy ecdysone의 peak와 같은 peak를 확인할 수 있었으며 우슬에 함유되어 있는 20-hydroxy ecdysone함량이 약 0.33%정도이었다. 이는 Son 등(24)이 우슬이 약재로서 지 표물질을 0.
- 27%를 나타내었다. 각 분획별에 따라 cathepsin B에 대한 저해활성을 측정한 결과 F4분획물에서 가장 저해활성이 높았으며 F1 분획에서도 높은 저해활성을 나타내었다. F4 분획물 중 우슬의 지표물질인 20-hydroxy ecdysone이 검출되었으며 우슬에 함유되어있는 함량은 0.
- 20-hydroxy ecdysone, leupeptin 및 우슬 추출분획인 F4 모두가 기질을 BANA로 사용하였을 경우 cathepsin B 에 대한 저해력이 80%이상을 보였지만 CLN을 기질로 하였을 경우는 낮은 저해력을 보였다. 기질이 BANA일 경우 leupepM은 92%, 20-hydroxy ecdysone은 88% 그리고 우슬 추출분획 F4에서는 97%가 나타났으며 기질이 CLN일 경우는 leupeptin은 62%, 20-hydroxy ecdysone은 36% 그리고 우슬 주출분획 F4에서는 67%가 나타났다. 이는 Bajkowski 등(23)의 보고에 의하면 cathepsin B는 BANA보다 CLN인 기질에서 더 높은 활성을 보여주는 것은 BANA기질은 ester결합을 하고 있고 CLN기 질은 amide결합을 하고 있어 그 결합 차이에 따른 것으로 보고하고 있는 것으로 보아 cathepsin B의 저해 활성을 촉진 또는 상승시킬 수 있는 인자가 부수적으로 관여할 수 있음을 시사하고 있다고 사료된다.
- 우슬뿌리의 일반성분을 분석한 결과는 Table 2와 같다. 세척 건조한 우슬뿌리의 회분 함량은 7.63%이었으며 조단백질은 9.84%, 조지방은 1.32% 그리고 총당함량은 20.65% 이었다. 또한 조사포닌 함량은 31.
- 우슬 뿌리 methanol/water(4:1, v/v) 추출물을 각 용매를 이용하여 순차적으로 분획한 후 수율을 측정한 결과 마지막 단계인 methanol 분획에서 수율이 8.27%로 가장 높았으며 다음으로chlorofonn/niethan0](3:l, v/v) 분획에서 2.97%로 수율이 높았다.
- 우슬이 민간요법으로 관절염 치료에 우수한 한약재로 알려진 바 우슬 추출물이 cathepsin B 에 대한 저해력을 검토하기 위하여 각종 용매로 우슬 추출물을 순차 분획하고 분획 추출물에 대하여 cathepsin B 에 대한 저해활성을 검토하였으며 우슬의 지표물질인 20-hydroxy ecdysone이 추출분획에 검출되는지 TLC 및 HWLC를 이용하여 분석하였으며 우슬의 지표물질이 cathepsin B 에 대한 저해활성여부를 확인한바 다음과 같은 결과를 얻었다. 우슬 뿌리에 대해 methanol/water(4:1, v/v) 추출물을 ethyl acetate, chloroform, chloroform/methanol(3.1, v/v), methanol의 각 용매로 분획한 결과, 분획 F4(methanol 분획)에서 수율이 가장 높아 8.27%를 나타내었다. 각 분획별에 따라 cathepsin B에 대한 저해활성을 측정한 결과 F4분획물에서 가장 저해활성이 높았으며 F1 분획에서도 높은 저해활성을 나타내었다.
- 이상의 결과로 볼 때 우슬의 지표물질인 20-hydroxy ecdysone은 cathepsin B 에 대한 저해력을 어느 정도 가지긴 하지만 F1 분획과 같은 농도의 20-hydroxy ecdysone를 함유한 우슬 추출분획 인 F4에서 cathepsin B 에 대한 저해력이 더 높은 것을 볼 때 우슬 뿌리 추출물이 cathepsin B 에 대한 저해활성이 높아 예로부터 관절염 예방 및 치료에 우슬을 한약재로 사용하였을 경우 효과가 있었을 것으로 생각되며 또한 이 우슬 지표물질이 관절염 예방의 주된 원인 물질이 아니고 또 다른 물질이 관여함을 알 수 있었다. 이에 현재까지 보고된 것들 중 calhepsin B 에 대한 저해력이 높은 물질들을 미생물 배양 시 생산되는 물질로부터 분리한 연구들(13, 16, 17, 19, 24)과 난백으로부터 저해물질로 분리 보고한 cystatin 등(15)의 구조 분석 결과를 살펴본바 대부분이 질소를 함유한 염기성유기화합물인 알칼로이드류 물질로 나타난 것으로 미루어 보아 본 실험에서 용매별 순차 분획한 분획 중 F4 분획물이 알칼로이드 물질 분리 분획 인 것으로 볼 때 20-hydroxy ecdysone이외에 질소를 함유한 알칼로이드 물질이 관여할 것으로 생각되어 추가적인 연구가 수행되어야 할 것으로 판단된다.
- 이는 Kim(25)이 보고한 바에 의하면 사양 토보다는 양토에서, 무피복 재배보다는 흑색비닐 피복재배 에서, 수확시기가 빠른 것보다 12월 중순정도로 늦어질수록, 재배 연수가 1년보다는 2년 재배 시 무기질 함량이 더 높게 나타났다고 보고하였다. 이에 본 실험에서 사용한 우슬의 무기질 함량과는 다소 차이가 있었는데 이러한 재배조건에 따라 다소 차이가 있는 것을 알 수 있었으며 무기질 함량분포는 거의 비슷한 함량을 보여주었다.
- 3과 같다. 전개용매를 ethanol/ethyl acetate(l:5, v/v)를 사용하여 20-hydroxy eodysone만을 전개시킨 결과 UV 254 nm에서 Rf 0.44에서 표준물질과 같은 band가 F4 분획 에서 뚜렷하게 확인되었으며 F3 분획에서도 미비하게 나타나는 것이 확인되었다.
후속연구
- F4인 methanol 분획에서 cathepsin B에 대한 저해활성이 가장 높게 나타났으며 다음으로 F1 인 ethyl acetate 분획, F3인 chloroform/methanol(3:1, v/v)분획 에서 cathepsin B에 대한 저해활성이 나타났는데 chkmform 분획에서는 오히려 cathepsin B에 대한 저해활성보다는 촉진효과가 나타났다. 이는 분획물 자체가 정제된 단일물질이 아니어서 그 분획물 내에 cathepsin B 에 대한 활성을 억제 및 촉진하는 인자가 존재하고 있는 것으로 생각되며 이는 앞으로 더 연구해볼 필요가 있다고 생각된다.
- 이상의 결과로 볼 때 우슬의 지표물질인 20-hydroxy ecdysone은 cathepsin B 에 대한 저해력을 어느 정도 가지긴 하지만 F1 분획과 같은 농도의 20-hydroxy ecdysone를 함유한 우슬 추출분획 인 F4에서 cathepsin B 에 대한 저해력이 더 높은 것을 볼 때 우슬 뿌리 추출물이 cathepsin B 에 대한 저해활성이 높아 예로부터 관절염 예방 및 치료에 우슬을 한약재로 사용하였을 경우 효과가 있었을 것으로 생각되며 또한 이 우슬 지표물질이 관절염 예방의 주된 원인 물질이 아니고 또 다른 물질이 관여함을 알 수 있었다. 이에 현재까지 보고된 것들 중 calhepsin B 에 대한 저해력이 높은 물질들을 미생물 배양 시 생산되는 물질로부터 분리한 연구들(13, 16, 17, 19, 24)과 난백으로부터 저해물질로 분리 보고한 cystatin 등(15)의 구조 분석 결과를 살펴본바 대부분이 질소를 함유한 염기성유기화합물인 알칼로이드류 물질로 나타난 것으로 미루어 보아 본 실험에서 용매별 순차 분획한 분획 중 F4 분획물이 알칼로이드 물질 분리 분획 인 것으로 볼 때 20-hydroxy ecdysone이외에 질소를 함유한 알칼로이드 물질이 관여할 것으로 생각되어 추가적인 연구가 수행되어야 할 것으로 판단된다.
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