우슬이 민간요법으로 관절염 치료에 우수한 한약재로 알려진 바 우슬 추출물이 cathepsin B 에 대한 저해력을 검토하기 위하여 각종 용매로 우슬 추출물을 순차 분획하고 분획 추출물에 대하여 cathepsin B에 대한 저해활성을 검토하였으며 우슬의 지표물질인 20-hydroxy ecdysone이 추출분획에 검출되는지 TLC 및 HPLC를 이용하여 분석하였으며 우슬의 지표물질이 cathepsin B에 대한 저해활성여부를 확인한바 다음과 같은 결과를 얻었다. 우슬 뿌리에 대해 methanol/water(4:1, v/v) 추출물을 ethyl acetate, chloroform, chloroform/methanol(3:1, v/v), methanol의 각 용매로 분획한 결과, 분획 F4(methanol 분획)에서 수율이 가장 높아 $8.27\%$를 나타내었다. 각 분획별에 따라 cathepsin B에 대한 저해활성을 측정한 결과 F4분획물에서 가장 저해활성이 높았으며 F1분획에서도 높은 저해활성을 나타내었다. F4분획물 중 우슬의 지표물질인 20-hydroxy ecdysone이 검출되었으며 우슬에 함유되어있는 함량은 $0.33\%$이었다. 20-hydroxy ecdysone에 대하여 cathepsin B저해활성을 보기 위하여 cathepsin B저해활성제로 알려진 leupeptin과 활성을 비교해본 결과 기질을 BANA로 사용하였을 경우 leupeptin은 저해율이 $92\%$인데 비하여 20- hydroxy ecdysone은 $88\%$이었으며 F4분획물은 $97\%$를 나타내었고 기질을 CLN으로 사용하였을 경우 leupeptin은 저해율이 $62\%$인데 비하여 20-hydroxy ecdysone은 $36\%$이었으며 F4추출물은 $67\%$를 나타내었다.
우슬이 민간요법으로 관절염 치료에 우수한 한약재로 알려진 바 우슬 추출물이 cathepsin B 에 대한 저해력을 검토하기 위하여 각종 용매로 우슬 추출물을 순차 분획하고 분획 추출물에 대하여 cathepsin B에 대한 저해활성을 검토하였으며 우슬의 지표물질인 20-hydroxy ecdysone이 추출분획에 검출되는지 TLC 및 HPLC를 이용하여 분석하였으며 우슬의 지표물질이 cathepsin B에 대한 저해활성여부를 확인한바 다음과 같은 결과를 얻었다. 우슬 뿌리에 대해 methanol/water(4:1, v/v) 추출물을 ethyl acetate, chloroform, chloroform/methanol(3:1, v/v), methanol의 각 용매로 분획한 결과, 분획 F4(methanol 분획)에서 수율이 가장 높아 $8.27\%$를 나타내었다. 각 분획별에 따라 cathepsin B에 대한 저해활성을 측정한 결과 F4분획물에서 가장 저해활성이 높았으며 F1분획에서도 높은 저해활성을 나타내었다. F4분획물 중 우슬의 지표물질인 20-hydroxy ecdysone이 검출되었으며 우슬에 함유되어있는 함량은 $0.33\%$이었다. 20-hydroxy ecdysone에 대하여 cathepsin B저해활성을 보기 위하여 cathepsin B저해활성제로 알려진 leupeptin과 활성을 비교해본 결과 기질을 BANA로 사용하였을 경우 leupeptin은 저해율이 $92\%$인데 비하여 20- hydroxy ecdysone은 $88\%$이었으며 F4분획물은 $97\%$를 나타내었고 기질을 CLN으로 사용하였을 경우 leupeptin은 저해율이 $62\%$인데 비하여 20-hydroxy ecdysone은 $36\%$이었으며 F4추출물은 $67\%$를 나타내었다.
This study was carried out to investigate the cathepsin B inhibition effect by Achyranthes japonica N. root extract in vitro. The methanol/$H_{2}O$(4:1, v/v) extract was fractionated by ethyl acetate(F1), chloroform(F2), chloroform/methanol(3:1, v/v)(F3) and methanol(F4). The yield of F4 ...
This study was carried out to investigate the cathepsin B inhibition effect by Achyranthes japonica N. root extract in vitro. The methanol/$H_{2}O$(4:1, v/v) extract was fractionated by ethyl acetate(F1), chloroform(F2), chloroform/methanol(3:1, v/v)(F3) and methanol(F4). The yield of F4 in Achyranthes japonica N. root was $8.27\%$. As an index material of Achyranthes japonica N. root, 20-hydroxy ecdysone was detected by TLC, and HPLC and it's content was $0.33\%$. Three isolates(F1, F3, F4) showed the cathepsin B inhibition activity, and F4 showed the highest inhibition activity among them. In the inhibition activity on cathepsin B, leupeptin, 20-hydroxy ecdysone and F4(at the same concentration of 20-hydroxy ecdysone.) were 92, 88 and $97\%$ on BANA($N{\alpha}$-benzoyl-DL-arginine ${\beta}$-naphthylamide) substrate, and 62, 36 and $67\%$ on CLN($N{\alpha}$-CBZ(carbobenzlyoxy)-L-lysine p-nitrophenyl ester HCI) substrate, respectively.
This study was carried out to investigate the cathepsin B inhibition effect by Achyranthes japonica N. root extract in vitro. The methanol/$H_{2}O$(4:1, v/v) extract was fractionated by ethyl acetate(F1), chloroform(F2), chloroform/methanol(3:1, v/v)(F3) and methanol(F4). The yield of F4 in Achyranthes japonica N. root was $8.27\%$. As an index material of Achyranthes japonica N. root, 20-hydroxy ecdysone was detected by TLC, and HPLC and it's content was $0.33\%$. Three isolates(F1, F3, F4) showed the cathepsin B inhibition activity, and F4 showed the highest inhibition activity among them. In the inhibition activity on cathepsin B, leupeptin, 20-hydroxy ecdysone and F4(at the same concentration of 20-hydroxy ecdysone.) were 92, 88 and $97\%$ on BANA($N{\alpha}$-benzoyl-DL-arginine ${\beta}$-naphthylamide) substrate, and 62, 36 and $67\%$ on CLN($N{\alpha}$-CBZ(carbobenzlyoxy)-L-lysine p-nitrophenyl ester HCI) substrate, respectively.
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문제 정의
이 연구에서는 우슬뿌리가 예전부터 민간요법으로관절 염치료에 이용되어오고 있는 바 우슬뿌리의 cathepsin 日게 대한 저해효과를 알아보기 위하여 우슬뿌리를 각 용매로 계통분획 · 분리한 후 그 분획추출물에 대하여 cathepsin B의 활성억제효과를 검토하여 보았다.
제안 방법
22 mM 을 dimethylsulfoxide 에 녹여 사용하였고 N a-benzoyl-DL- arginine-β-naphthylamide(BANA) 는 171 mM농도를 n, n-dtmethylformamide에 녹여 각 50 µL를 녹여 반응시켰으며 저해물질 용액은 100 µL를 취하여 반응시켰다. CLN 기질의 경우 326 nm에서 BANA 기질의 경우 340 nm에서 25ºC에 각 반응시간에 따라 반응시킨 후 저해활성의 기울기 값(V0)을 이용하여 저해활성도를 측정하였다(23). 즉 저해물질이 첨가되지 않은 기질과 효소의 반응을 A, 기질과 효소 그리고 저해물질을 첨가한 반응을 B, 효소가 첨가되지 않은 기질과 저해물질의 반응을 C라고 할 때 저해활성도를 다음 식으로 계산하였다.
Cathepsin B 저해활성이 있는 분획이 우슬뿌리에 많이 함유되어있는 성분인 20-hydroxy ecdysone물질인지를 확인하기 위하여 Son 등(24) 및 Kim(25)의 방법에 준하여 각 용매로 추출 분획 한 추출물을 가지고 silica gel 60F254 TLC plate(20x20 cm, Merck At. 5642)상에 점적한 후 물질 을 확인하였다. 이때 20-hydroxy ecdysone을 전개시킨 용매로는 ethanol/ethylacetate(1:5, v/v)를 사용하였으며 UV 254 nm에서 확인하였다.
TLC에서 band가 확인된 F4분획을 HPLC를 이용하여 다시 우슬뿌리의 지표물질인 20-hydroxy ecdysone의 여부를 재확인하였다. 이때 사용된 HPLC는 Waters 510(USA) 기기를 이용하였으며 그 분석조건은 Table 1과 같다.
즉 건조시료 1 g 을 질산, 과염소산과 질산액의 혼합액 및 염산을 순차적으로 이용하여 분해시킨 후 일정량으로 희석, 여과한 후 ICP analyzer (GBC Integra XMP, AustraHa)를 사용하여 원자흡광 광도법으로 정량하였다(21) . 사포닌함량은 시료분말 5 g을 둥근플라스크에 취한 후 70% methanol 100 mL로 80°C 수욕조에서 2시간씩 3회 반복 추출하여 얻은 추출액을 여과지 (whatman No. 41)로 여과한 후 8,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상징액을 회수하였다 이 상징액을 농축하여 증류수로 용해한 다음 분액여두에 옮겨서 diethylether로 탈지시킨 다음 남은 수층에 수포화부탄올 50 mL 씩 3회 반복추출이행 하여 회수, 농축한 것을 조사포닌으로 계산하였다(22).
우슬뿌리는 세척, 건조한 후 분쇄기를 이용하여 분쇄한 뒤 사용하였다. 시료를 메탄올:물(4:1, v/v)의 비율의 용매로 추출한 후 Fig. 1과 같이 용매별로 순차적으로 추출 분획하였다. 얻어진 각각의 추출물들을 감압 농축한 다음 각각의 추출수율(%)을 계산하였다.
1과 같이 용매별로 순차적으로 추출 분획하였다. 얻어진 각각의 추출물들을 감압 농축한 다음 각각의 추출수율(%)을 계산하였다.
우슬의 지표물질인 20-hydroxy ecdysone의 cathepsin B에 대한 저해활성을 나타내는지를 확인하기 위하여 BANA와 CLN을 기질로 하여 cathepsin B 에 대한 저해활성을 측정하였으며 이를 F4추출물과 cathepsin B저해물질인 leupeptin과 함께 그 활성을 비교한 결과 Fig. 5와 같다. 20-hydroxy ecdysone, leupeptin 및 우슬 추출분획인 F4 모두가 기질을 BANA로 사용하였을 경우 cathepsin B 에 대한 저해력이 80%이상을 보였지만 CLN을 기질로 하였을 경우는 낮은 저해력을 보였다.
우슬이 민간요법으로 관절염 치료에 우수한 한약재로 알려진 바 우슬 추출물이 cathepsin B 에 대한 저해력을 검토하기 위하여 각종 용매로 우슬 추출물을 순차 분획하고 분획 추출물에 대하여 cathepsin B 에 대한 저해활성을 검토하였으며 우슬의 지표물질인 20-hydroxy ecdysone이 추출분획에 검출되는지 TLC 및 HWLC를 이용하여 분석하였으며 우슬의 지표물질이 cathepsin B 에 대한 저해활성여부를 확인한바 다음과 같은 결과를 얻었다. 우슬 뿌리에 대해 methanol/water(4:1, v/v) 추출물을 ethyl acetate, chloroform, chloroform/methanol(3.
즉 저해물질이 첨가되지 않은 기질과 효소의 반응을 A, 기질과 효소 그리고 저해물질을 첨가한 반응을 B, 효소가 첨가되지 않은 기질과 저해물질의 반응을 C라고 할 때 저해활성도를 다음 식으로 계산하였다. 이때 쇠무릎추출물의 cathepsin B의 저해활성도를 비교검토하기 위하여 cathepsin B 저해제로 알려진 leupeptin(16)의 일정량을 반응시켜 저해활성을 비교 분석하였다.
즉 수분함량은 105°C 상압가열건조법, 조지방은 Soxhelet 추출법, 조회분은 건식회화법, 조단백질은 Kjeldahl 법으로 분석하였으며 무기이온 분석은 습식법으로 전처리하였다. 즉 건조시료 1 g 을 질산, 과염소산과 질산액의 혼합액 및 염산을 순차적으로 이용하여 분해시킨 후 일정량으로 희석, 여과한 후 ICP analyzer (GBC Integra XMP, AustraHa)를 사용하여 원자흡광 광도법으로 정량하였다(21) . 사포닌함량은 시료분말 5 g을 둥근플라스크에 취한 후 70% methanol 100 mL로 80°C 수욕조에서 2시간씩 3회 반복 추출하여 얻은 추출액을 여과지 (whatman No.
CLN 기질의 경우 326 nm에서 BANA 기질의 경우 340 nm에서 25ºC에 각 반응시간에 따라 반응시킨 후 저해활성의 기울기 값(V0)을 이용하여 저해활성도를 측정하였다(23). 즉 저해물질이 첨가되지 않은 기질과 효소의 반응을 A, 기질과 효소 그리고 저해물질을 첨가한 반응을 B, 효소가 첨가되지 않은 기질과 저해물질의 반응을 C라고 할 때 저해활성도를 다음 식으로 계산하였다. 이때 쇠무릎추출물의 cathepsin B의 저해활성도를 비교검토하기 위하여 cathepsin B 저해제로 알려진 leupeptin(16)의 일정량을 반응시켜 저해활성을 비교 분석하였다.
대상 데이터
본 실험에 사용한 우슬은 충남 부여군 초촌면에서 2003년도에 재배한 것을 수확하여 세척 건조하여 사용하였다. 효소로 사용한 cathepsin B(EC 3.
충남 부여군 초촌면 일대에서 재배 수확한 우슬 뿌리를 세척 건조한 후 분쇄하여 30 g을 환류냉각기를 부착시킨 플라스크에 넣은 후 시료 중량의 20배의 methanol/water (4:1, v/v)용매로 추출하여 Fig. 1과 같은 방법으로 추출분획하여 얻은 용매별 추출물을 감압 농축하여 얻은 추출수율은 Table 4와 같았다.
본 실험에 사용한 우슬은 충남 부여군 초촌면에서 2003년도에 재배한 것을 수확하여 세척 건조하여 사용하였다. 효소로 사용한 cathepsin B(EC 3.4.22.1)는 bovine으로부터 추출한 Sigg사 제품을 사용하였다. 효소의 기질로 사용한 CLN(Na-CBZ(carbobenzlyoxy)-L-lysine p- nitrophenyl ester HC1) 과 BANA(Na-benzoyl-DL-arginine β-naphthylamide), 저해효과를 비교검토하기 위하여 저해제로 개발되어진 leupeptin과 우슬의 지표물질인 20-hydroxy ecdysone 등의 시약은 Sigma사에서 구입하여 사용하였다.
1)는 bovine으로부터 추출한 Sigg사 제품을 사용하였다. 효소의 기질로 사용한 CLN(Na-CBZ(carbobenzlyoxy)-L-lysine p- nitrophenyl ester HC1) 과 BANA(Na-benzoyl-DL-arginine β-naphthylamide), 저해효과를 비교검토하기 위하여 저해제로 개발되어진 leupeptin과 우슬의 지표물질인 20-hydroxy ecdysone 등의 시약은 Sigma사에서 구입하여 사용하였다.
이론/모형
Cathepsin B 저해물질의 활성도 측정은 Han 등(19)의 방법에 준하여 측정하였다. 즉 분광광도계의 1 mL cuvette내 에 25 mM sodium acetate buffer(pH 5.
우슬뿌리의 일반성분은 AOAC방법에 따라 분석하였다(20). 즉 수분함량은 105°C 상압가열건조법, 조지방은 Soxhelet 추출법, 조회분은 건식회화법, 조단백질은 Kjeldahl 법으로 분석하였으며 무기이온 분석은 습식법으로 전처리하였다. 즉 건조시료 1 g 을 질산, 과염소산과 질산액의 혼합액 및 염산을 순차적으로 이용하여 분해시킨 후 일정량으로 희석, 여과한 후 ICP analyzer (GBC Integra XMP, AustraHa)를 사용하여 원자흡광 광도법으로 정량하였다(21) .
성능/효과
33%이었다. 20-hydroxy ecdy딩one 에 대하여 cathepsin B저해활성을 보기 위하여 cathepsin B저해활성제로 알려진 leupeptin과 활성을 비교해본 결과 기질을 BANA로 사용하였을 경우 leupeptin-cr 저해율이 92%인데 비하여 20- hydroxy ecdysone은 88%이었으며 F4분획물은 97%를 나타내었고 기질을 CLN으로 사용하였을 경우 leupeptin은 저해율이 62%인데 비하여 20-hydroxy ecdysone은 36%이었으며 F4 추출물은 67%를 나타내었다.
2와 같다. F4인 methanol 분획에서 cathepsin B에 대한 저해활성이 가장 높게 나타났으며 다음으로 F1 인 ethyl acetate 분획, F3인 chloroform/methanol(3:1, v/v)분획 에서 cathepsin B에 대한 저해활성이 나타났는데 chkmform 분획에서는 오히려 cathepsin B에 대한 저해활성보다는 촉진효과가 나타났다. 이는 분획물 자체가 정제된 단일물질이 아니어서 그 분획물 내에 cathepsin B 에 대한 활성을 억제 및 촉진하는 인자가 존재하고 있는 것으로 생각되며 이는 앞으로 더 연구해볼 필요가 있다고 생각된다.
TLC에서 우슬의 지표물질이 다량 함유된 fraction 4를 HPLC로 분석한 결과 Fig. 4와 같이 RT가 19.65에서 20- hydroxy ecdysone의 peak와 같은 peak를 확인할 수 있었으며 우슬에 함유되어 있는 20-hydroxy ecdysone함량이 약 0.33%정도이었다. 이는 Son 등(24)이 우슬이 약재로서 지 표물질을 0.
27%를 나타내었다. 각 분획별에 따라 cathepsin B에 대한 저해활성을 측정한 결과 F4분획물에서 가장 저해활성이 높았으며 F1 분획에서도 높은 저해활성을 나타내었다. F4 분획물 중 우슬의 지표물질인 20-hydroxy ecdysone이 검출되었으며 우슬에 함유되어있는 함량은 0.
20-hydroxy ecdysone, leupeptin 및 우슬 추출분획인 F4 모두가 기질을 BANA로 사용하였을 경우 cathepsin B 에 대한 저해력이 80%이상을 보였지만 CLN을 기질로 하였을 경우는 낮은 저해력을 보였다. 기질이 BANA일 경우 leupepM은 92%, 20-hydroxy ecdysone은 88% 그리고 우슬 추출분획 F4에서는 97%가 나타났으며 기질이 CLN일 경우는 leupeptin은 62%, 20-hydroxy ecdysone은 36% 그리고 우슬 주출분획 F4에서는 67%가 나타났다. 이는 Bajkowski 등(23)의 보고에 의하면 cathepsin B는 BANA보다 CLN인 기질에서 더 높은 활성을 보여주는 것은 BANA기질은 ester결합을 하고 있고 CLN기 질은 amide결합을 하고 있어 그 결합 차이에 따른 것으로 보고하고 있는 것으로 보아 cathepsin B의 저해 활성을 촉진 또는 상승시킬 수 있는 인자가 부수적으로 관여할 수 있음을 시사하고 있다고 사료된다.
우슬뿌리의 일반성분을 분석한 결과는 Table 2와 같다. 세척 건조한 우슬뿌리의 회분 함량은 7.63%이었으며 조단백질은 9.84%, 조지방은 1.32% 그리고 총당함량은 20.65% 이었다. 또한 조사포닌 함량은 31.
우슬 뿌리 methanol/water(4:1, v/v) 추출물을 각 용매를 이용하여 순차적으로 분획한 후 수율을 측정한 결과 마지막 단계인 methanol 분획에서 수율이 8.27%로 가장 높았으며 다음으로chlorofonn/niethan0](3:l, v/v) 분획에서 2.97%로 수율이 높았다.
우슬이 민간요법으로 관절염 치료에 우수한 한약재로 알려진 바 우슬 추출물이 cathepsin B 에 대한 저해력을 검토하기 위하여 각종 용매로 우슬 추출물을 순차 분획하고 분획 추출물에 대하여 cathepsin B 에 대한 저해활성을 검토하였으며 우슬의 지표물질인 20-hydroxy ecdysone이 추출분획에 검출되는지 TLC 및 HWLC를 이용하여 분석하였으며 우슬의 지표물질이 cathepsin B 에 대한 저해활성여부를 확인한바 다음과 같은 결과를 얻었다. 우슬 뿌리에 대해 methanol/water(4:1, v/v) 추출물을 ethyl acetate, chloroform, chloroform/methanol(3.1, v/v), methanol의 각 용매로 분획한 결과, 분획 F4(methanol 분획)에서 수율이 가장 높아 8.27%를 나타내었다. 각 분획별에 따라 cathepsin B에 대한 저해활성을 측정한 결과 F4분획물에서 가장 저해활성이 높았으며 F1 분획에서도 높은 저해활성을 나타내었다.
이상의 결과로 볼 때 우슬의 지표물질인 20-hydroxy ecdysone은 cathepsin B 에 대한 저해력을 어느 정도 가지긴 하지만 F1 분획과 같은 농도의 20-hydroxy ecdysone를 함유한 우슬 추출분획 인 F4에서 cathepsin B 에 대한 저해력이 더 높은 것을 볼 때 우슬 뿌리 추출물이 cathepsin B 에 대한 저해활성이 높아 예로부터 관절염 예방 및 치료에 우슬을 한약재로 사용하였을 경우 효과가 있었을 것으로 생각되며 또한 이 우슬 지표물질이 관절염 예방의 주된 원인 물질이 아니고 또 다른 물질이 관여함을 알 수 있었다. 이에 현재까지 보고된 것들 중 calhepsin B 에 대한 저해력이 높은 물질들을 미생물 배양 시 생산되는 물질로부터 분리한 연구들(13, 16, 17, 19, 24)과 난백으로부터 저해물질로 분리 보고한 cystatin 등(15)의 구조 분석 결과를 살펴본바 대부분이 질소를 함유한 염기성유기화합물인 알칼로이드류 물질로 나타난 것으로 미루어 보아 본 실험에서 용매별 순차 분획한 분획 중 F4 분획물이 알칼로이드 물질 분리 분획 인 것으로 볼 때 20-hydroxy ecdysone이외에 질소를 함유한 알칼로이드 물질이 관여할 것으로 생각되어 추가적인 연구가 수행되어야 할 것으로 판단된다.
이는 Kim(25)이 보고한 바에 의하면 사양 토보다는 양토에서, 무피복 재배보다는 흑색비닐 피복재배 에서, 수확시기가 빠른 것보다 12월 중순정도로 늦어질수록, 재배 연수가 1년보다는 2년 재배 시 무기질 함량이 더 높게 나타났다고 보고하였다. 이에 본 실험에서 사용한 우슬의 무기질 함량과는 다소 차이가 있었는데 이러한 재배조건에 따라 다소 차이가 있는 것을 알 수 있었으며 무기질 함량분포는 거의 비슷한 함량을 보여주었다.
3과 같다. 전개용매를 ethanol/ethyl acetate(l:5, v/v)를 사용하여 20-hydroxy eodysone만을 전개시킨 결과 UV 254 nm에서 Rf 0.44에서 표준물질과 같은 band가 F4 분획 에서 뚜렷하게 확인되었으며 F3 분획에서도 미비하게 나타나는 것이 확인되었다.
후속연구
F4인 methanol 분획에서 cathepsin B에 대한 저해활성이 가장 높게 나타났으며 다음으로 F1 인 ethyl acetate 분획, F3인 chloroform/methanol(3:1, v/v)분획 에서 cathepsin B에 대한 저해활성이 나타났는데 chkmform 분획에서는 오히려 cathepsin B에 대한 저해활성보다는 촉진효과가 나타났다. 이는 분획물 자체가 정제된 단일물질이 아니어서 그 분획물 내에 cathepsin B 에 대한 활성을 억제 및 촉진하는 인자가 존재하고 있는 것으로 생각되며 이는 앞으로 더 연구해볼 필요가 있다고 생각된다.
이상의 결과로 볼 때 우슬의 지표물질인 20-hydroxy ecdysone은 cathepsin B 에 대한 저해력을 어느 정도 가지긴 하지만 F1 분획과 같은 농도의 20-hydroxy ecdysone를 함유한 우슬 추출분획 인 F4에서 cathepsin B 에 대한 저해력이 더 높은 것을 볼 때 우슬 뿌리 추출물이 cathepsin B 에 대한 저해활성이 높아 예로부터 관절염 예방 및 치료에 우슬을 한약재로 사용하였을 경우 효과가 있었을 것으로 생각되며 또한 이 우슬 지표물질이 관절염 예방의 주된 원인 물질이 아니고 또 다른 물질이 관여함을 알 수 있었다. 이에 현재까지 보고된 것들 중 calhepsin B 에 대한 저해력이 높은 물질들을 미생물 배양 시 생산되는 물질로부터 분리한 연구들(13, 16, 17, 19, 24)과 난백으로부터 저해물질로 분리 보고한 cystatin 등(15)의 구조 분석 결과를 살펴본바 대부분이 질소를 함유한 염기성유기화합물인 알칼로이드류 물질로 나타난 것으로 미루어 보아 본 실험에서 용매별 순차 분획한 분획 중 F4 분획물이 알칼로이드 물질 분리 분획 인 것으로 볼 때 20-hydroxy ecdysone이외에 질소를 함유한 알칼로이드 물질이 관여할 것으로 생각되어 추가적인 연구가 수행되어야 할 것으로 판단된다.
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