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문제 정의
- 따라서 본 연구는 RANKL에 유도된 파골세포의 분화 억제에 대한 우슬과 인삼 열수추출물의 효과를 밝히고자 시행하였다. 또한, 우슬과 인삼 혼합물 처리가 골다공증 골 대사 질환에 관여하고 있는 파골세포와 조골세포의 분화 효과를 규명하여 골 질환 개선제로써의 가능성을 제시하고자 한다.
- 또한, 우슬과 인삼 혼합물 처리가 골다공증 골 대사 질환에 관여하고 있는 파골세포와 조골세포의 분화 효과를 규명하여 골 질환 개선제로써의 가능성을 제시하고자 한다.
- 본 연구는 골 흡수와 골 형성의 불균형에 의해 골밀도 감소를 초래하는 대사성 골질환인 골다공증 개선제로서 우슬과 인삼 열수추출물 혼합물의 가능성을 제시하고자 시행하였다. 인삼의 고농도 처리에서 나타나는 세포 독성은 우슬에 의해 감소되었고, 인삼의 농도 의존적에 따른 파골세포의 분화 억제와 조골세포 분화 활성이 촉진되어 골 항상성 유지에 관여하고 있음을 확인하였다.
- Kim 등 (2010)은 마우스로부터 채취한 대식세포 (bone marrow macrophages, BMM)에 우슬 열수추출 20㎍/㎖ 농도로 처리하여 세포독성 없이 현저하게 억제된 파골세포 분화에 따른 골 흡수 억제 효과를 확인하였다. 본 연구에서는우슬 열수추출물 모든 농도에서 파골세포 분화 억제가 나타나지 않았다. 이는 다른 파골전구세포 (대식세포주, RAW264.
제안 방법
- 1. Cytotoxicity and proliferation profile were evaluated using the MTT assay after 3 days of culture. RAW264.
- RAW264.7 세포로부터 유도 분화된 파골세포에서 TRAP (tartate resistant acid phosphate) 염색을 통하여 성숙 파골세포 형태를 관찰하였다. 분화제와 시료처리 3일된 세포는 PBS 로 수세 후 10% formalin으로 5분간 고정하고, DW로 다시 수세하였다.
- (Mok and Shin, 1996). RAW264.7 세포에 RANKL을 첨가하고, 우슬과 인삼 열수추출물에 의한 세포 치사 활성이 보이지 않는 25와 50㎍/㎖ 농도에서 3일간 배양한 후 TRAP 염색과 TRAP assay를 통하여 성숙 파골세포의 분화 형태와 세포막의 특이 효소인 TARAP 효소 활성을 확인하였다. RANKL만 처리한 대조군에서 둥근 모양 형태 파골세포 (ROC) 즉, 세포가 융합되면서 형성된 다핵의 성숙 파골세포가 골 표면에 부착하여 골 흡수 작용 (Karst et al.
- 골조직에 존재하는 조골세포와 유사하여 골기질의 축적, 석회화와 성장요소 및 대사 변화 등 (Choi and Koh, 2003) 의연구에 이용되고 있는 MC3T3-E1 세포에 우슬과 인삼 열수 추출물을 처리하여 세포증식 및 세포 생존율에 따른 세포 독성평가와 석회화 결절 (calcium accumulation) 형성의 관찰을 통하여 조골세포 후기 분화단계 활성을 확인하였다. 대조군을 포함한 모든 실험군의 농도에서 24시간 처리 후 세포 생존율에는 영향을 미치지 않았다 (Fig.
- 안정시켰다. 동일한 배지에 조골세포 분화제 (osteoblastic differentiation reagents; OS, 1M 2-glycerophosphate, 50mM ascorbic acid, and 10mM dexamethasone)를 첨가하였고, 인삼과 우슬 그리고 혼합물의 시료를 0, 25, 50㎍/㎖ 농도로 각각 처리한 뒤 5% CO2, 37℃ incubator에서 24시간 배양 후 생존율을 측정하기 위해 MTT assay를 시행하였다.
- 세척된 우슬은 일정 간격으로 절단 후 물 3L에 시료 100g의 비율로 가하여 20분씩 100℃에서 3회 추출하였다. 또한, 뇌두가 제거된 인삼 역시 일정 간격으로 절단하여 물 1L에 시료 100g의 비율로 가하여 6시간씩 85℃에서 3회 반복 추출하고, 실온에서 냉각(cid:129)여과한 후 추출액을 회전 감압농축기 (Rotavapor RⅡ, Buchi, Switzerland)로 농축하였다. 획득된 추출물을 동결건조 (Martin Christ, Osterode.
- 마우스 대식 세포주 RAW264.7 세포를 이용하여 RANKL 에 의해 유도된 파골세포에 대한 각 추출물의 10, 25, 50, 100㎍/㎖ 농도에 따른 세포 생존율을 측정하였다. 우슬 열수 추출물은 모든 농도에서 대조군과 유사한 생존율을 보였다.
- PCR primer 순서는 Table 1에 나타낸 바와 같다. 반응 끝난 시료는 2% agarose gel에서 전기영동하고 Et-Br로 염색하여 UV상에서 관찰 및 densitometric analysis를 이용하여 수치화하였다.
- Louis, MO, USA) 사용 설명에 따라 신선한 TRAP 용액으로 30분간 처리하였다. 염색된 세포는 광학현미경 (CKX41, Olympus, Tokyo, Japan)으로 관찰하고, 디지털 영상카메라 (DIXI 3000, Olympus, Tokyo, Japan)로 이미지를 영상화하여 둥근 모양 형태의 파골세포 (round-shaped osteoclast, ROC) 수를 측정하였다.
- 24-well plate (2×104 cells/ well)에 10% FBS와 1% penicillin-streptomycin이 첨가된 α-MEM 배지에 분주하여 24시간 동안 세포를 안정시켰다. 조골세포 유도 분화제와 우슬, 인삼 및 혼합물의 시료를 0, 25, 50㎍/㎖의 농도로 처리한 후 21일 동안 배양하였다. ice-cold 4% paraformaldehyde로 4℃에서 30분간 세포를 고정하고, 40mM AR-S staining 용액으로 실온에서 10분 동안 염색하였다.
- 조골세포로부터 석회화 결절 형성은 alizarin red-sulfate (AR-S)를 이용하여 측정하였다. 24-well plate (2×104 cells/ well)에 10% FBS와 1% penicillin-streptomycin이 첨가된 α-MEM 배지에 분주하여 24시간 동안 세포를 안정시켰다.
- 중합 효소 연쇄반응 (polymerase chain reaction, PCR)은 Emerald Taq을 이용하여 초기 번성 과정을 95℃에서 10분간 시행한 후, 95℃ 1분, 51~58℃에서 30초, 72℃에서 1분으로 총 25~32 주기를 시행한 후, 최종 증폭 과정을 72℃에서 10분간 시행하였다. PCR primer 순서는 Table 1에 나타낸 바와 같다.
- 96-well plate에 1×104cells/well 농도로 분주하여 DMEM에 10% FBS와 1% penicillin-streptomycin 조건으로 24시간 동안 안정화 시켰다. 파골세포 분화 유도를 위하여 10% FBS와 1% penicillinstreptomycin이 첨가된 α-MEM에 RANKL (100ng/㎖)을 첨가한 뒤 우슬과 인삼 열수추출물은 각각 0, 10, 25, 50, 100㎍/㎖ 농도, 우슬과 인삼 혼합물은 동량의 농도 비율이 되도록 혼합하여 처리하였다. 3일 후 MTT 용액(2㎎) 첨가하여 5% CO2, 37℃ incubator에서 2시간 동안 반응시킨 뒤 생성된 formazan crystals을 DMSO로 용해하였다.
- 파골세포의 calcitonin receptor (Cal-R)와 TRAP의 발현을 관찰하기 위하여 TRIzol을 사용하여 total RNA를 추출하고, iScript cDNA synthesis kit으로 cDNA를 합성 하였다. 중합 효소 연쇄반응 (polymerase chain reaction, PCR)은 Emerald Taq을 이용하여 초기 번성 과정을 95℃에서 10분간 시행한 후, 95℃ 1분, 51~58℃에서 30초, 72℃에서 1분으로 총 25~32 주기를 시행한 후, 최종 증폭 과정을 72℃에서 10분간 시행하였다.
대상 데이터
- Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM; Bremen, Germany)과 alpha-modified minimum essential medium (α-MEM), fetal bovine serum (FBS) 및 penicillin-streptomycin 등은 Gibco BRL (Gaithersburg, MD, USA)사, 파골세포 분화제 RANKLe PeproTech EC (London, England)사, 조골세포 분화 제로 2-glycerophosphate, ascorbic acid, dexamethasone 등은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)사의 제품을 사용하였다. MTT 용액 [3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyl tetrazolium bromide]과 dimethyl sulfoxide (DMSO), TRAP 활성 분석을 위한 TRAP 염색 kit 및 TRAP 용액 (sodium tartrate, p-nitrophenyl phosphate), 그리고 석회화 결절 측정을 위한 AR-S 용액 (alizarin red-sulfate, cetylpyridinium chloride, sodium phosphate)등 모든 시약은 SigmaAldrich 사를 이용하였다.
- Louis, MO, USA)사의 제품을 사용하였다. MTT 용액 [3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyl tetrazolium bromide]과 dimethyl sulfoxide (DMSO), TRAP 활성 분석을 위한 TRAP 염색 kit 및 TRAP 용액 (sodium tartrate, p-nitrophenyl phosphate), 그리고 석회화 결절 측정을 위한 AR-S 용액 (alizarin red-sulfate, cetylpyridinium chloride, sodium phosphate)등 모든 시약은 SigmaAldrich 사를 이용하였다. RT-PCR 분석을 위하여 TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), iScript cDNA synthesis kit (Bio-Rad, Hercules, CA, USA), Emerald Taq (Takara, Japan) 등을 구입하였다.
- MTT 용액 [3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyl tetrazolium bromide]과 dimethyl sulfoxide (DMSO), TRAP 활성 분석을 위한 TRAP 염색 kit 및 TRAP 용액 (sodium tartrate, p-nitrophenyl phosphate), 그리고 석회화 결절 측정을 위한 AR-S 용액 (alizarin red-sulfate, cetylpyridinium chloride, sodium phosphate)등 모든 시약은 SigmaAldrich 사를 이용하였다. RT-PCR 분석을 위하여 TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), iScript cDNA synthesis kit (Bio-Rad, Hercules, CA, USA), Emerald Taq (Takara, Japan) 등을 구입하였다.
- 우슬과 인삼은 시중에 유통되고 있는 원료를 이용하였다. 세척된 우슬은 일정 간격으로 절단 후 물 3L에 시료 100g의 비율로 가하여 20분씩 100℃에서 3회 추출하였다.
- 3%이었다. 이를 실험 직전 DPBS (Dulbecco’s phosphate buffered saline, Daegu, Korea) 에용해하여 사용하였다.
- 파골세포 분화 유도를 위한 마우스 대식 세포주 RAW264.7 세포와 마우스 두개관에서 유래한 전조골세포주인 MC3T3-E1 세포는 American Type Culture Collection (ATCC; Rockville, MD, USA)로부터 구입하였다. RAW264.
데이터처리
- 모든 실험군은 3개 이상 수행하였으며 정량적 결과는 대조군에 대한 백분율로 평균±표준편차로 나타냈다. 모든 실험은 3번 이상 반복하여 동일한 실험결과로 사용하였고, two-tailed Student’s t-test로 통계적 유의성을 분석하여 p<0.
- 대한 백분율로 평균±표준편차로 나타냈다. 모든 실험은 3번 이상 반복하여 동일한 실험결과로 사용하였고, two-tailed Student’s t-test로 통계적 유의성을 분석하여 p<0.05 이하를 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
이론/모형
- 각 추출물의 RAW264.7 세포에 대한 생존 및 간접적 독성평가를 위하여 MTT assay를 시행하였다. 96-well plate에 1×104cells/well 농도로 분주하여 DMEM에 10% FBS와 1% penicillin-streptomycin 조건으로 24시간 동안 안정화 시켰다.
- 파골세포 특이 지표 TRAP 효소의 활성을 측정하기 위하여 TRAP solution assay를 Tintut 등 (2002)의 방법으로 수행하였다. 분화제와 시료처리 3일된 세포를 PBS로 수세 후 cold lysis buffer (90mM citrate, pH 4.
성능/효과
- Fig. 3에서와 같이 우슬 추출물의 TRAP 활성도는 농도와 관계없이 대조군과 유의한 차이가 없었지만 인삼 추출물 25와 50㎍/㎖의 모든 농도에서 각각 43.51%와 55.19%의 현저한 감소율을 나타냈다. 우슬과 인삼 혼합물 역시 25㎍/㎖ (42.
- 40%) 농도에서 뚜렷하게 감소되었다. TRAP 활성과 마찬가지로 ROC 수 역시 인삼을 포함한 모든 군의 25와 50㎍/㎖ 농도에서 농도 의존적으로 유의하게감소되었다. Kim 등 (2010)은 마우스로부터 채취한 대식세포 (bone marrow macrophages, BMM)에 우슬 열수추출 20㎍/㎖ 농도로 처리하여 세포독성 없이 현저하게 억제된 파골세포 분화에 따른 골 흡수 억제 효과를 확인하였다.
- 5A). alizarin red에 염색된 석회화 결절을 용해하여 흡광도를 측정한 결과 인삼 추출물의 25㎍/㎖ 농도 (25.96 %), 우슬과 인삼 혼합물 25㎍/㎖ 농도 (26.41 %)에서 대조군과 비교하여 유의하게 증가하였다 (Fig. 5B). 우슬 추출물 역시 증가의 경향을 보이지만 통계적으로 유의성을 나타내지 않았다.
- 그러나 Fig. 1에서와 같이 우슬과 인삼 추출물을 동량의 비율로 혼합 처리한 경우 100㎍/㎖ 농도에서 87.06%의 생존율로 통계적 유의한 세포 독성을 보였으나 인삼 단독 처리 군보다 세포 생존율이 높았고, 더욱이 세포 생존율이 현저하게 감소된 인삼 단독 처리군의 50㎍/㎖ 농도 보다 우슬과 인삼의 동량 혼합물 50㎍/㎖ 농도에서는 높은 생존율(95.76%)을 나타내고 있다. 우슬은 lipopolysaccharide (LPS) 유도로 증가되는 염증성 사이토카인과 매개물질의 억제 (kim et al.
- , 2012). 그러므로 인삼 열수 추출물은 파골세포 분화 전사인자인 NFATc1의 억제를 통한 Cal-R와 TRAP의 감소가 유발되었을 것으로 예상되고, 최종적으로 골 기질 흡수가 억제될 것으로 사료된다.
- Kim (2012) 등은 MC3T3 E1 세포에서 진세노사이드 Rd가 AMPK와 BMP-2 신호전달 경로의 활성을 통하여 활발한 조골세포로 분화를 유도한다고 보고하였다. 본 연구결과 조골세포 분화 활성의 증가는 인삼이 포함된 처리군에서 뚜렷하게 나타났다. 이는 인삼의 사포닌계 진세노사이드 성분이 영향을 미쳤을 것으로 사료된다.
- , 2012). 본 연구에서 세포 독성을 보이는 고농도 인삼 추출물 처리군에서의 감소되었던 세포 생존율이 우슬 추출물의 항염과 항산화 작용에 의한 세포 보호 작용에 기인하여 세포 생존율이 증가된 것으로 사료된다.
- , 2003). 성숙 파골세포의 골 기질 흡수단계에서 우슬과 인삼 추출물에 의한 Cal-R와 TRAP의 mRNA 발현양 변화를 분석한 결과, 우슬과 인삼을 동량으로 혼합물의 25㎍/㎖ (50.96%)와 50㎍/㎖ (64.43%)의 모든 농도에서 Cal-R의 현저한 감소율과 25㎍/㎖에 비해 50 ㎍/㎖ 농도에서도 유의하게 감소된 발현양을 확인하였다. TRAP 발현양 역시 우슬과인삼 혼합물에서 대조군과 비교하여 50㎍/㎖ 농도에서 현저한 감소율 (38.
- , 2004)을 하는 TRAP 양성 다핵형 파골세포가 뚜렷하게 관찰되었다. 우슬추출물 25와 50㎍/㎖ 농도 처리군에서 대조군과 유사한 파골세포 분화 형태를 보이는 반면, 인삼 추출물이 포함된 실험군 (인삼 단독 처리군과 우슬과 인삼 혼합 처리군)의 모든 농도에서 대조군에 비해 현저하게 감소된 ROC와 융합되지 않은 단 핵의 전파골세포와 불규칙 모양 형태 파골세포(irregular shaped osteoclast, IOC)가 풍부하게 관찰되었다 (Fig. 2). 이상의 결과는 RANKL에 의해 유도되는 파골세포 분화과정 중에 우슬은 영향을 미치지 못하였으나 인삼이 파골세포 분화억제에 직접적으로 관여한다는 것을 의미한다.
- 2). 이상의 결과는 RANKL에 의해 유도되는 파골세포 분화과정 중에 우슬은 영향을 미치지 못하였으나 인삼이 파골세포 분화억제에 직접적으로 관여한다는 것을 의미한다.
- 인삼의 고농도 처리에서 나타나는 세포 독성은 우슬에 의해 감소되었고, 인삼의 농도 의존적에 따른 파골세포의 분화 억제와 조골세포 분화 활성이 촉진되어 골 항상성 유지에 관여하고 있음을 확인하였다. 이러한 결과는 우슬과 인삼 혼합물이 골다공증 치료제로서 가능성을 제시하며 좀 더 효율적인 치료제 개발을 위한 기초 자료 제공을 위하여 추후 우슬과 인삼혼합물의 파골세포와 조골세포 분화 작용 기전에 대한 연구가 필요할 것이다.
- Germany) 하여분말의 형태로 −20℃에서 보관하였다. 최종 수율 (yield) 은우슬 24.8%, 인삼 33.3%이었다. 이를 실험 직전 DPBS (Dulbecco’s phosphate buffered saline, Daegu, Korea) 에용해하여 사용하였다.
후속연구
- 7 세포)의 이용과 처리된 농도가 높았기 때문인 것으로 판단된다. 그러므로 골수세포 (bone marrow cell, BMC), BMM 및 RAW264.7 세포와 같은 다양한 파골전구세포에서 낮은 농도 처리에 의한 파골세포 분화 효과 규명을 위한 연구가 추가적으로 이루어져야할 것이다.
- 인삼의 고농도 처리에서 나타나는 세포 독성은 우슬에 의해 감소되었고, 인삼의 농도 의존적에 따른 파골세포의 분화 억제와 조골세포 분화 활성이 촉진되어 골 항상성 유지에 관여하고 있음을 확인하였다. 이러한 결과는 우슬과 인삼 혼합물이 골다공증 치료제로서 가능성을 제시하며 좀 더 효율적인 치료제 개발을 위한 기초 자료 제공을 위하여 추후 우슬과 인삼혼합물의 파골세포와 조골세포 분화 작용 기전에 대한 연구가 필요할 것이다.
- 골 형성과 재형성 과정 동안 조골세포로의 성장 및 분화유도는 골형성단백질 (bone morphogenetic protein, BMP)에서부터 시작되어 조골세포 특이 전사인자인 Runx2 (Lee, 2009)가 osteocalcin, osteopontin, bone sialoprotein 그리고 alkaline phosphatase 등과 같은 분화 인자를 조절하여 이루어진다 (Komori, 2006). 이러한 파골세포와 조골세포의 성장과 분화 조절인자 정보는 골 질환 치료 및 예방을 위한 신약후보 물질의 주요 목표 인자로 적용될 것이다.
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