[논문]미생물 세포 기반의 에폭사이드 가수분해효소 활성 측정을 위한 분광학적 분석법 최적화

김희숙; 이은열

doi:10.5352/jls.2005.15.1.136

문제 정의

Epoxide hydrolase를 이용한 광학활성 에폭사이드 제조 관련 상업화 연구에서 선행되어야 할 일이 보다 효율적으로 다양한 기질 특이성을 가진 신규 epoxide hydrolase를 선별 할 수 있는 효율적인 epoxide hydrolase 활성 평가법을 개발 하는 일이다. 일반적으로 사용되는 GC 및 HPLC 분석법은 정교한 분석 기술과 긴 분석시간이 요구되는 반면, 자외 선 분 광기와 같은 광학적 분석방법은 샘플 다루기가 쉬우며, 짧은 분석시간이 요구되므로 대용량 탐색에 보다 적합한 활성 평 가방법이다.
특히, colorimetric assay의 경우 정확성이 떨어지거나, 낮은 기질 전환 율에서는 재현성이 문제가 될 정도로 assay 방법이 최적화되 지 못하였다. 본 논문에서는 효소 분리 과정의 불편함을 제 거하기 위하여 cell-based spectrometric assay를 개발하고, 최적화하고자 하였다. 미생물 세포를 생촉매로 사용하고, epoxide hydrolase 활성에 의해 styrene oxide로부터 가수분해 된 phenyl-l, 2-ethanedi이의 양을 NalQ를 이용하여 benzal- dehyde로 산화시킨 다음 흡광도 측정을 통해 정량화하였다.
정제된 효소를 이용하는 경우 효소를 분리하는데 드는 비용이 많아 경제적이지 못하며, 여러 미생물 균주를 다 루는 경우 효소 분리정제에 많은 시간이 소요되며, 분리된 효소는 분석 조건에 따라 경우에 따라서는 활성 자체가 심하 게 저하될 수 있다는 단점이 있어 신규 epoxide hydrolase 생촉매 선별을 위한 탐색방법으로는 적합하지 못하다. 본 연구에서는 미생물 whole cell을 기반으로 자외선 분광기를 이용한 epoxide hydrolase 활성 측정을 위하여 반응조건이미치는 영향을 분석하고, 분석조건을 최적화하였다. 우선, epoxide hydrolase에 의해 diol이 생성됨과 동시에 NalQ에 의해 benzaldehyde로 산화시킴으로써, 두 단계 반응을 한 단계 로 줄일 수 있는지를 알아보기 위하여 세포 생촉매와 NalOt 를 함께 넣어 반응을 수행하였다.
미생물 세포를 생촉매로 사용하고, epoxide hydrolase 활성에 의해 styrene oxide로부터 가수분해 된 phenyl-l, 2-ethanedi이의 양을 NalQ를 이용하여 benzal- dehyde로 산화시킨 다음 흡광도 측정을 통해 정량화하였다. 이러한 방법을 이용하여 다양한 농도에서 Rhododorula glutinis 를 세포 생촉매로 사용한 에폭사이드 가수분해반응 동력학 을 평가해봄으로써 세포 기반의 신규 epoxide hydrolase 활 성 검색을 위한 screening 방법으로써의 가능성을 평가하고 자 하였다.

제안 방법

자외선 분광기를 이용하여 미생물 세포의 epoxide hydrolase 활성 측정 결과들이 GC를 이용하여 분석한 결과와 일치 성이 있는지를 평가하였다. 30 mM styrene oxide에 대한 R. glutinis 생촉매의 가수분해 반응을 실시하면서, 반응기간 동안 분해되고 남은 styrene oxide의 농도는 GC를 이용하여 측 정하였고, 생성되는 diole 본 연구에서 얻은 자외선 분광기 를 이용한 분석조건에서 측정하였다. Fig.
4 mM 및 6 mM의 phenyl-12ethanediol 이 있는 반응액 에 같은 양의 sodium metaperiodate를 첨 가하고 산화반응에 필요한 반응시간을 측정하였다. Fig.
Epoxide hydrolase 활성 에 의하여 분해되는 epoxide와 생 성되는 diol의 일치성을 비교, 평가하기 위하여 sodium metaperiodate (NalQ)를 첨가하기 전 반응액을 취하여 cyclohe- xane으로 남은 epoxide# 추출한 후 유기용매층을 GC로 분 석하였다[6, 8]. 검출기로는 FID를, 분석용 column으로는 silica cyclodextrine capillary p-DEX 120(30 m length, 0.
Epoxide hydrolase 활성을 측정하기 위한 epoxide 기질에 대한 가수분해 반응, NaIC)4를 이용한 phenyl-lz2-ethanediol 의 산화반응 및 자외선 분광기를 이용한 분석은 다음과 같이 실시하였다. 우선, 미생물 세포(10 mg/ml)와 반응액의 10% (v/v) 에 해당하는 200 μ1의 dimethylformamide (DMF)를 첨가한 1, 800 μ1의 10 mM sodium phosphate buffer (pH 6.
4 mM 및 6 mM의 phenyl-12ethanediol 이 있는 반응액 에 같은 양의 sodium metaperiodate를 첨 가하고 산화반응에 필요한 반응시간을 측정하였다. Fig. 3에서와 같이 diol의 농도 에 관계없이 40초 이후에는 흡광도 변화가 포화됨을 알 수 있어, diol의 완전한 산화를 위한 sodium metaperiodate와의 반응 시간을 1분으로 결정하였다. 또한, 에폭사이드 가수분 해 반응에 사용하는 세포 생촉매의 농도에 따른 흡광도 변화를 살펴보았다(Fig.
Epoxide hydrolase에 의한 (R)-styrene oxide 의 가수분해 반응을 설명하는 속도방정식으로 Michaelis-Menten 식을 적용하였다. Fig. 6에서와 같이 다양한 styrene oxide 농도에서 초기 5분간의 분해 속도를 측정하였고, Linewea- ver-Burk plot을 이용하여 기울기 및 y절편으로부터 #과 Km을 각각 구하였다. (R)-styrene oxide에 대한 Vmax과 Kme 각각 41.
기존에는 라세믹 에폭사이드 기질로부터 광학활성 에폭사 이드를 제조할 수 있는 epoxide hydrolase 활성 분석을 위하여 수용액 반응액에 있는 에폭사이드 기질을 유기용매로 추 출한 다음 반응수율 및 광학순도를 chiral gas chromatography 또는 HPLCt 이용하여 분석하였다[8, 9, 11]. 이 방법은 광학순도 및 생성물의 chirality를 정확하게 분석할 수 있다는 장점이 있지만, 대용량의 library로부터 효율적으로 epoxide hydrolase 활성을 검색하기에는 적합하지 못한 방법이다.
다양한 라세믹 에폭사이드 기질에 대한 입체선택적 가수 분해 반응을 촉매하는 epoxide hydrolase 활성을 측정할 수 있는 미생물 세포 기반의 자외선 활성 분석법을 최적화하였다. 2.
3에서와 같이 diol의 농도 에 관계없이 40초 이후에는 흡광도 변화가 포화됨을 알 수 있어, diol의 완전한 산화를 위한 sodium metaperiodate와의 반응 시간을 1분으로 결정하였다. 또한, 에폭사이드 가수분 해 반응에 사용하는 세포 생촉매의 농도에 따른 흡광도 변화를 살펴보았다(Fig. 4). 2.
먼저 세포 생촉매에 의한 epoxide 가수분해반응을 통해 생성되는 diol의 농도에 따라 benzaldehyde로의 산화반응에 요구되는 NaIO₄ 농도를 결정하기 위하여, 세포 생촉매가 없는 상태에서 10mM sodium phosphate buffer에 있는 다양한 농도의 phenyl-l, 2-ethanediol에 대하여 NalQ의 농도를 달 리하여 산화반응을 진행한 다음 280 nm에서 흡광도를 측정하였다. Fig.
본 논문에서는 효소 분리 과정의 불편함을 제 거하기 위하여 cell-based spectrometric assay를 개발하고, 최적화하고자 하였다. 미생물 세포를 생촉매로 사용하고, epoxide hydrolase 활성에 의해 styrene oxide로부터 가수분해 된 phenyl-l, 2-ethanedi이의 양을 NalQ를 이용하여 benzal- dehyde로 산화시킨 다음 흡광도 측정을 통해 정량화하였다. 이러한 방법을 이용하여 다양한 농도에서 Rhododorula glutinis 를 세포 생촉매로 사용한 에폭사이드 가수분해반응 동력학 을 평가해봄으로써 세포 기반의 신규 epoxide hydrolase 활 성 검색을 위한 screening 방법으로써의 가능성을 평가하고 자 하였다.
위의 반응액에 80 μ1의 sodium metaperiodate 용액 (stock solution: 100 mM NalQ in DMF) 을 첨가하고 약 2분간 vortexing함으로써 반응액내 생성된 diol과의 산화반응을 실시하였다. 반응액내 현탁되어 있는 세포는 원심분리하여 제거시키고, 상등액을 취한 후 희석하여 280 nm에서 흡광도를 측정함으로써 epoxide 분해 활성을 분석하였다.
본 연구에서 개발된 epoxide hydrolase 활성 측정 법을 이용하여 R. glutinis 세포 생촉매에 의한 styrene oxide의 가수 분해 반응에 대한 반응 동력학을 분석하고 관련 매개변수를계산하였다. Epoxide hydrolase에 의한 (R)-styrene oxide 의 가수분해 반응을 설명하는 속도방정식으로 Michaelis-Menten 식을 적용하였다.
본 연구에서는 미생물 whole cell을 기반으로 자외선 분광기를 이용한 epoxide hydrolase 활성 측정을 위하여 반응조건이미치는 영향을 분석하고, 분석조건을 최적화하였다. 우선, epoxide hydrolase에 의해 diol이 생성됨과 동시에 NalQ에 의해 benzaldehyde로 산화시킴으로써, 두 단계 반응을 한 단계 로 줄일 수 있는지를 알아보기 위하여 세포 생촉매와 NalOt 를 함께 넣어 반응을 수행하였다. 효소를 생촉매로 사용하는 경우에서는 NalS첨가에 의해 활성 저해가 심하게 일어나므 로 산화반응을 가수분해 반응과 분리시킨 것인데, 세포 생촉 매의 경우에서도 NaIO₄에 의한 활성 저해 현상이 관찰되어 두 단계 반응을 분리 수행하기로 하였다(data not shown).
8)에 정해진 농도의 epoxide를 첨가하고 전체 반응 부피를 1, 920 μ1 로 한 다음, 진탕배양기를 이용하여 교반속도 250 rpmz 온도 3(TC에서 15분간 반응시켰다. 위의 반응액에 80 μ1의 sodium metaperiodate 용액 (stock solution: 100 mM NalQ in DMF) 을 첨가하고 약 2분간 vortexing함으로써 반응액내 생성된 diol과의 산화반응을 실시하였다. 반응액내 현탁되어 있는 세포는 원심분리하여 제거시키고, 상등액을 취한 후 희석하여 280 nm에서 흡광도를 측정함으로써 epoxide 분해 활성을 분석하였다.
25 pm film thickness; Supelco, USA)을 사용하였다. 이동가스로 질소를 사용하였으며 column, injector, 그리고 detects의 온도는 각각 100, 220, 220℃ 였다.
GC 및 HPLC를 이용한 epoxide hydrolase 활성 검색의 비효율성을 극복하기 위하여 다양한 colorimetric assay를 이용한 spectrometric assay 방법이 제 시되었다[5, 10]. 이들 방법에서는 epoxide hydrolase를 분리 정제하거나, 적어도 crude extract 수준의 효소촉매를 제조하여 epoxide hydrolase 활성을 검색하였다. 이러한 접근 방법 역시 효소 제조 과정에서의 비효율성 등으로 인하여 대용 량 .
자외선 분광기를 이용하여 미생물 세포의 epoxide hydrolase 활성 측정 결과들이 GC를 이용하여 분석한 결과와 일치 성이 있는지를 평가하였다. 30 mM styrene oxide에 대한 R.

이론/모형

glutinis 세포 생촉매에 의한 styrene oxide의 가수 분해 반응에 대한 반응 동력학을 분석하고 관련 매개변수를계산하였다. Epoxide hydrolase에 의한 (R)-styrene oxide 의 가수분해 반응을 설명하는 속도방정식으로 Michaelis-Menten 식을 적용하였다. Fig.

성능/효과

다양한 라세믹 에폭사이드 기질에 대한 입체선택적 가수 분해 반응을 촉매하는 epoxide hydrolase 활성을 측정할 수 있는 미생물 세포 기반의 자외선 활성 분석법을 최적화하였다. 2.5 mg/ml의 세포 농도에서도 비교적 쉽게 흡광도 변화 량을 인식할 수 있는 흡광도 범위인 0.5 이상을 얻을 수 있고, 반응 동력학 분석에도 응용할 수 있었다. 기존의 GC, HPLC 분석법 보다 분석시간을 줄일 수 있으며, 효소를 별도로 분리 .
glutinis 세포 생촉매의 농도를 변화시키면서 10 mM styrene oxide에 대하여 초기 10분간 변화된 흡광도를 측정한 결과, 세포 농 도 증가에 따라 생성되는 diol의 농도가 증가되므로 흡광도 역시 증가됨을 알 수 있다. 2.5 mg/ml의 세포 농도에서도 비교적 쉽게 흡광도 변화량을 인식할 수 있는 범위인 0.5 이상 을 얻을 수 있어 세포 기반의 epoxide hydrolase 활성 측정 에 효과적으로 응용할 수 있음을 알 수 있었다.
4). 2.5에서 25(mg/ml) 농도로 R. glutinis 세포 생촉매의 농도를 변화시키면서 10 mM styrene oxide에 대하여 초기 10분간 변화된 흡광도를 측정한 결과, 세포 농 도 증가에 따라 생성되는 diol의 농도가 증가되므로 흡광도 역시 증가됨을 알 수 있다. 2.
2에서와 같이 2 mM에서 8 mM의 Nald 농도 범위에서 다양한 농도의 diol에 대하여 산화 반응을 진행한 다음 흡광도를 측정한 결과, diol 산화에 필요한 NaIO₄ 농도 비가 비 례적 임을 알 수 있었다. Diol의 농도가 증가할수록 비 례적으로 흡광도도 증가하는 것을 확인하였고, 흡광도(A)와 diol (D)의 농도 관계식을 결정할 수 있었다(D=1.04A-0.11). 따라서, epoxide로부터 생성되는 diol의 산화물에 의한 흡광 도 변화를 측정함으로써 epoxide hydrolase 활성을 분석할 수 있음을 알 수 있었다.
농도를 결정하기 위하여, 세포 생촉매가 없는 상태에서 10mM sodium phosphate buffer에 있는 다양한 농도의 phenyl-l, 2-ethanediol에 대하여 NalQ의 농도를 달 리하여 산화반응을 진행한 다음 280 nm에서 흡광도를 측정하였다. Fig. 2에서와 같이 2 mM에서 8 mM의 Nald 농도 범위에서 다양한 농도의 diol에 대하여 산화 반응을 진행한 다음 흡광도를 측정한 결과, diol 산화에 필요한 NaIO₄ 농도 비가 비 례적 임을 알 수 있었다. Diol의 농도가 증가할수록 비 례적으로 흡광도도 증가하는 것을 확인하였고, 흡광도(A)와 diol (D)의 농도 관계식을 결정할 수 있었다(D=1.
NalO% styrene oxide 및 phenyl-l, 2-ethanediol 의 반응액상 에서의 용해도 향상을 위해 첨가하는 DMF 또는 dimethylsulfoxide (DMSO) 의 경우, 일정 농도 이상 첨가하면 세포 생 촉매의 epoxide hydrolase 활성을 저하시킬 수 있다[3, 10]. 기존의 연구 결과에 의하면 20%(v/v) 이상을 사용하는 경우 26% 이상의 세포 생촉매 활성 저하 현상을 보인다고 하였으며, 2~ 10%(v/v)를 사용한 본 실험의 경우에서는 세포 생 촉매의 epoxide hydrolase 활성에 영향을 주지 않음을 확인할 수 있었다(data not shown). 또한 세포 생촉매가 없는 경 우에서나 R.
5에서와 같이 반응 시간에 따라 분해되고 남은 styrene oxide의 양과 생성되는 di이의 양이 서로 보완적인 모습을 보여주었다. 따라서, GC 분석 결과와 자외선 분광기를 이용하여 측정한 결과가 일치 함을 알 수 있고, 자외선 분광기를 이용하여 보다 쉽게 미생 물 세포 기반의 epoxide hydrolase 활성 측정 이 가능함을 알 수 있다.
11). 따라서, epoxide로부터 생성되는 diol의 산화물에 의한 흡광 도 변화를 측정함으로써 epoxide hydrolase 활성을 분석할 수 있음을 알 수 있었다. 반응액에 세포 생촉매가 있는 경우 정확한 흡광도 측정을 위해 흡광도 측정전에 원심분리를 하여 세포를 제거하는 경우 benzaldehyde가 세포에 흡착되어 제거된다면 흡광도 측정에서 오차가 발생할 수 있다.
glutinis 세포 생촉매를 사용하는 경우에서 모두 10%(v/v) DMF를 첨가해주어도 같은 흡광도 변화를 보여주 었다. 따라서, 수용액에 잘 녹지 않는 styrene oxide의 용해도 를 향상시키기 위하여 DMF 첨가함으로써, styrene oxide의 수용액상의 용해도인 6 mM 이상의 고농도의 epoxide 기질 에서도 미생물 세포 유래의 epoxide hydrolase 활성 측정이 가능함을 알 수 있었다.
반응액에 세포 생촉매가 있는 경우 정확한 흡광도 측정을 위해 흡광도 측정전에 원심분리를 하여 세포를 제거하는 경우 benzaldehyde가 세포에 흡착되어 제거된다면 흡광도 측정에서 오차가 발생할 수 있다. 이와 같은 오차가 발생하는지를 알아보기 위하여 같은 조건에서 세 포를 넣은 다음 산화반응을 시킨 후 세포를 제거하고 280 nm 에서 흡광도를 측정한 결과 세포 없이 수행한 실험과 같은 결과를 얻었으며 세포 사용이 흡광도 측정에 있어서 문제가 되지 않음도 확인하였다(Fig. 2).

후속연구

5 mM로 결정할 수 있었으 며 이러한 결과는 기존의 GC 분석법을 이용하여 얻은 결과와 비슷하였으므로 자외선 분광기를 이용한 분석법이 미생 물 세포 유래의 epoxide hydrolase 활성을 정확하게 분석하 는데 유용함을 알 수 있다[8]. 수십분 이상의 분석시간이 요 구되고 유기용매 추출 등의 시료 처리과정도 요구되는 GC, HPLC 등을 사용하는 비효율적인 분석방법에 비해 본 연구에서 최적화시킨 미생물 세포 기반의 자외선 분광기를 이용한 epoxide hydrolase 활성 측정법을 통하여 보다 효율적으로 활성을 측정할 수 있으며, 직접 미생물 세포에 적용할 수 있으므로 미생물 pool로부터 신규 epoxide hydrolase 특성을 가진 미생물 생촉매 선별에 응용될 수 있을 것으로 기대된다.
기존의 GC, HPLC 분석법 보다 분석시간을 줄일 수 있으며, 효소를 별도로 분리 . 정제하지 않고 미생물 세포 자체의 epoxide hydrolase 활성 분석이 가능하므로 상업 적 특성이 우수한 epoxide hydrolase을 가진 미생물을 효율적으로 선별하는데 웅용될 수 있을 것으로 기대된다.

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