Ginsenoside Rg1 및 Rb1을 처리한 신경세포주(SH-SY5Y세포)의 유전자 발현양상 Gene Expression Profiling of SH-SY5Y Human Neuroblastoma Cells Treated with Ginsenoside Rg1 and Rb1원문보기
Objectives:The ginsenoside Rg1 and Rb1, the major components of ginseng saponin, have neurotrophic and neuroprotective effects including promotion of neuronal survival and proliferation, facilitation of learning and memory, and protection from ischemic injury and apoptosis. In this study, to investi...
Objectives:The ginsenoside Rg1 and Rb1, the major components of ginseng saponin, have neurotrophic and neuroprotective effects including promotion of neuronal survival and proliferation, facilitation of learning and memory, and protection from ischemic injury and apoptosis. In this study, to investigate the molecular basis of the effects of ginsenoside on neuron, we analyzed gene expression profiling of SH-SY5Y human neuroblastoma cells treated with ginsenoside Rg1 or Rb1. Methods:SH-SY5Y cells were cultured and treated in triplicate with ginsenoside Rg1 or Rb1($80{\mu}M$, $40{\mu}M$, $20{\mu}M$). The proliferation rates of SH-SY5Y cells were determined by MTT assay and microscopic examination. We used a high density cDNA microarray chip that contained 8K human genes to analyze the gene expression profiles in SH-SY5Y cells. We analyzed using the Significance Analysis of Microarray(SAM) method for identifying genes on a microarray with statistically significant changes in expression. Results:Treatment of SH-SY5Y cells with $80{\mu}M$ ginsenoside Rg1 or Rb1 for 36h showed maximal proliferation compared with other concentrations or control. The results of the microarray experiment yielded 96 genes were upregulated(${\geq}$3 fold) in Rg1 treated cells and 40 genes were up-regulated(${\geq}$2 fold) in Rb1 treated cells. Treatment with ginsenoside Rg1 for 36h induced the expression of some genes associated with protein biosynthesis, regulation of transcription or translation, cell proliferation and growth, neurogenesis and differentiation, regulation of cell cycle, energy transport and others. Genes associated with neurogenesis and neuronal differentiation such as SCG10 and MLP increased in ginsenoside Rg1 treated cells, but such changes did not occur in Rb1-group. Conclusion:Our data provide novel insights into the gene mechanisms involved in possible role for ginsenoside Rg1 or Rb1 in mediating neuronal proliferation or cell viability, which can elicit distinct patterns of gene expression in neuronal cell line. Ginsenoside Rg1 have more broad and strong effects than ginsenoside Rb1 in gene expression and related cellular physiology. In addition, we suggest that SCG10 gene, which is known to be expressed in neuronal differentiation during development and neuronal regeneration during adulthood, may have a role in enhancement of activity dependent synaptic plasticity or cytoskeletal regulation following treatment of ginsenoside Rg1. Further, ginsenoside Rg1 may have a possible role in regeneration of injured neuron, promotion of memory, and prevention from aging or neuronal degeneration.
Objectives:The ginsenoside Rg1 and Rb1, the major components of ginseng saponin, have neurotrophic and neuroprotective effects including promotion of neuronal survival and proliferation, facilitation of learning and memory, and protection from ischemic injury and apoptosis. In this study, to investigate the molecular basis of the effects of ginsenoside on neuron, we analyzed gene expression profiling of SH-SY5Y human neuroblastoma cells treated with ginsenoside Rg1 or Rb1. Methods:SH-SY5Y cells were cultured and treated in triplicate with ginsenoside Rg1 or Rb1($80{\mu}M$, $40{\mu}M$, $20{\mu}M$). The proliferation rates of SH-SY5Y cells were determined by MTT assay and microscopic examination. We used a high density cDNA microarray chip that contained 8K human genes to analyze the gene expression profiles in SH-SY5Y cells. We analyzed using the Significance Analysis of Microarray(SAM) method for identifying genes on a microarray with statistically significant changes in expression. Results:Treatment of SH-SY5Y cells with $80{\mu}M$ ginsenoside Rg1 or Rb1 for 36h showed maximal proliferation compared with other concentrations or control. The results of the microarray experiment yielded 96 genes were upregulated(${\geq}$3 fold) in Rg1 treated cells and 40 genes were up-regulated(${\geq}$2 fold) in Rb1 treated cells. Treatment with ginsenoside Rg1 for 36h induced the expression of some genes associated with protein biosynthesis, regulation of transcription or translation, cell proliferation and growth, neurogenesis and differentiation, regulation of cell cycle, energy transport and others. Genes associated with neurogenesis and neuronal differentiation such as SCG10 and MLP increased in ginsenoside Rg1 treated cells, but such changes did not occur in Rb1-group. Conclusion:Our data provide novel insights into the gene mechanisms involved in possible role for ginsenoside Rg1 or Rb1 in mediating neuronal proliferation or cell viability, which can elicit distinct patterns of gene expression in neuronal cell line. Ginsenoside Rg1 have more broad and strong effects than ginsenoside Rb1 in gene expression and related cellular physiology. In addition, we suggest that SCG10 gene, which is known to be expressed in neuronal differentiation during development and neuronal regeneration during adulthood, may have a role in enhancement of activity dependent synaptic plasticity or cytoskeletal regulation following treatment of ginsenoside Rg1. Further, ginsenoside Rg1 may have a possible role in regeneration of injured neuron, promotion of memory, and prevention from aging or neuronal degeneration.
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문제 정의
그러나 이런 기능은 Rb1보다 Rg1의 역할이 더 광범위하고 다양하게 나타났다. 그리고 특히 Rg1을 처리했을 때, 신호변환, 세포증식과 성장, 세포주기 조절 등에 관련된 유전자 발현을 증가시키는 기능을 더함으로서 신경세포의 유전자기전에 대한 ginsenoside의 가능한 역할에 대해 새로운 통찰을 제공한다. 또한 Rg1 처리 후 초기 신경발달 동안에 높은 발현을 보이고 아울러 신경가소성에 중요한 역할을 한다고 알려진 SCG10의 발현을 상향조절함으로서 Rg1이 신경세포증식이나 발아(sprouting), 성장에 어떤 역할을 할 것으로 생각되며, 나아가 신경세포의 시냅스 구조변화를 용이하게 하고, 구조적 가소성 작용에 중요한 역할을 함으로서 손상된 세포의 재건, 학습 및 기억항진 기능, 세포사멸 방지 및 퇴행성 신경질환의 예방에 이르기까지 일부 역할을 할 가능성을 제시한다.
또한 ginsenoside의 유전자 발현에 대한 연구가 거의 없고 더구나 microarray를 이용한 연구는 저자가 아는 한 아직까지 보고된 바가 없다. 따라서 이 연구는 microarray를 이용 하여 인삼사포닌이 신경세포의 유전자 발현에 어떤 변화를 일으키는지 조사하여 가능한 분자생물학적 기전을 추정하고자 고안되었다. 그동안 유전자 발현에 자주 사용되었던 신경세포주의 하나인 SH-SY5Y 세포에 진세노사이드 Rb1과 Rg1을 처리한 후 human 8K cDNA microarray를 이용하여 유전자 발현양상을 최초로 분석하였다.
더구나 그 기본이 되는 유전자 발현에 대한 연구가 거의 없으며 저자들이 아는한 microarray를 사용하여 ginsenoside 에 의한 유전자 발현분석을 보고한 경우는 아직까지 없 었다. 따라서 이 연구의 목적은 ginsenoside를 신경세포에 처리했을 때 과연 세포내의 유전자가 어떻게 발현될 것인가에 대한 일차적인 세포내부의 변화를 조사하기 위해 고안되었다. 유전자 발현변화는 전체 단백질수준 (proteomics)에서 측정되거나, mRNA수준(transcriptomics)에서 측정될 수 있겠으나 여기서는 transcriptome 분석에서 유용하게 널리 쓰이고 있는 cDNA microarray 방법을 사용하였다.
이 연구에서 진세노사이드의 농도를 몇가지로 다르게 설정한 이유는 농도에 따른 세포증식에 대한 가장 큰 영향을 주는 적절한 농도를 알지 못했기 때문이며 시간을 12시간 간격으로 이틀간 실험한 이유도 가장 세포가 활발할 때의 시간을 정하기 위해서 였다. 이 실험에서는 Rb1군에서 Rg1군보다 초기부터 세포증식이 이미 진행되었고 현미경 사진상 80μM의 Rb1군이 확연히 구분될 정도로 증식이 두드러졌다.
유전자 발현변화는 전체 단백질수준 (proteomics)에서 측정되거나, mRNA수준(transcriptomics)에서 측정될 수 있겠으나 여기서는 transcriptome 분석에서 유용하게 널리 쓰이고 있는 cDNA microarray 방법을 사용하였다. 이 연구에서는 신경세포의 유전자 발현연구에 흔히 사용되는 SH-SY5Y human neuroblastoma 세포45-47)에 Rb1과 Rg1을 처리한 후 8천개 이상의 Human cDNA가 포함된 microarrary를 사용하여 유전자 발현양상을 최초로 분석하여 ginsenoside의 신경세포에 대한 분자생물학적 기전을 추정하고자 하였다.
가설 설정
XAB2는 세포주기조절, pre-mRNA splicing 및 전사에 관여 하는 여러 기능이 있고, 특히 전사를 실제 방해하는 손상이 있을 때 혹은 전 유전체 복구(global genomic repair) 가 충분치 않을 때 전사조합복구(transcription-coupled repair)60)를 통해 우선적으로 제거하여 RNA 합성을 빠르게 회복시키는 기능을 한다.61) ZNF45은 일차적으로는 전사요소로서 작용하며 일부 세포증식이나 성장에도 영향을 준다.62)
Rb1과 Rg1, 특히 Rg1의경우 많은 RPs의 발현이 증가하였는데, 최근 DNA microarray 기술을 사용한 실험은 RPs mRNA의 발현이 성장상태에 따른 여러 변화들에 반응하여 철저히 조절된다고 보고된다.71) 인간 transcriptome의 체계적 분석은 번역조절이 RPs의 유전자 발현에서 필수적인 역할을 한다는 점은 분명한 것 같다.72) Rb1과 Rg1은 RPs의 발현을 증가시켜 단백질 합성을 위한 필수단백질을 만들어 냄으로서 단백질합성능력을 증가시켜 세포내 동화작용을 돕는 것으로 생각된다.
이들 단백질들은 세포분열 촉진시도(mitogen challenge) 후에 빠르게 유도되며 세포환경과 핵심적인 세포주기기전 사이에서 어떤 연결을 제공한다.85) 일관된 성장촉진 역할을 가진 Dcyclin은 oncogenes으로서 작용할 수 있다. 사실상 Dcyclins의 과발현은 많은 human cancer에서도 보여진다.
59 (3-fold)에 해당된다. 이 연구에서 발현의 차이를 보이는 유전자 선정은 Rg1의 경우 3-fold(M=1.59)로, Rb1의 경우 2-fold(M=1)로 임의로 정하였다. 일반적으로 통계적으로 의미있게 발현이 차이가 나는 유전자를 선별하기 위해서는 4회의 반복실험이 필요한 것으로 알려져 있지만 이 실험에서는 Digital Genomics에서 제공한 TwinChipTM을 이용한 Dye-swap 실험을 하여, 2회의 반복실험으로 4회와 동일한 결과를 얻을 수 있었고, Significance analysis of microarrays(SAM)를 이용 하여 의미 있게 발현이 변화하는 유전자를 선별하였다.
제안 방법
MTT assay of SH-SY5Y cells treated with Rg1. Cells were treated in triplicate with each 20, 40, 80 μM Rg1 for 12, 24, 36 and 48 hours and MTT assays were performed. Y axis shows the percentages of each treatment group relative to the untreated matching control.
MTT assay of SH-SY5Y cells treated with Rb1. Cells were treated in triplicate with each 20, 40, 80μM Rb1 for 12, 24, 36 and 48 hours and MTT assays were performed. Y axis shows the percentages of each treatment group relative to the untreated matching control.
MTT assay of SH-SY5Y cells treated with total ginsenosides. Cells were treated in triplicate with each 8, 16, 32 μg of total ginsenosides for 12, 24, 36 and 48hours and MTT assays were performed. Y axis shows the percentages of each treatment group relative to the untreated matching control.
Human neroblastoma SH-SY5Y세포에 ginsenoside Rg1과 Rb1을 40μM과 80μM로 각각 처리하고, 같은 부피의 0.9% saline을 처리하여 12시간마다 세포증식을 현미경으로 관찰하였다. 그 결과 다른 세포들에 비해 Rb1을 처리한 세포들이 많아졌으며, 특히 80μM의 Rb1을 처리하였을 때 세포의 수가 가장 증가하였다(그림 1).
MTT assay를 바탕으로 Rg1과 Rb1 80μM을 처리 하여 36시간 배양한 후 total RNA를 분리하였으며, 대조군과 Rg1 그리고 대조군과 Rb1을 각각 cDNA mic- roarray에 hybridzation 하여 유전자 발현의 변화를 분석하였다. 이 연구에서 발현의 차이를 보이는 유전자 선정을 Rg1의 경우 3-fold(M=1.
이 후 60g, 5분, 실온에서 원심분리하여 건조시켰다. Microarray scanning은 Packard 사의 Scanarryseries QuantArray를 이용한 confocal laser scanning을 통하여 이미지를 얻은 후 GenePix(Axon, USA) 프로그램을 이용하여 각 유전자의 intesity 정량 및 유전자 발현 양상을 분석하고, normalization을 수행하였다. 이 연구의 각 유전자 발현 데이터는 Rg1이나 Rb1을 처리한 군은 Cy5 dye에 의한 signal을 붉은색으로, 대조군의 Cy3 dye에 의한 signal을 녹색으로 표시하여 두 image를 겹쳐서 표시하였고 자료의 표준화를 위하여 DNA chip 연구자들에게 일반적으로 받아들여지고 있는 intensity/location-dependent normalization 방법51)을 이용하였다.
Fig 1. The microscopic pictures(×200) of SH-SY5Y cells treated with ginsenoside Rb1 or Rg1 for 12, 24, 36 and 48 hours. Treatment of SH-SY5Y cells with 80μM Rb1 for 36hours showed maximal proliferation compared with other concentrations or control.
9% saline을 처리하였다. 각각의 시료 처리 후, 12시간 마다 현미경을 이용하여 관찰한 후 사진 촬영하였다.
따라서 이 연구는 microarray를 이용 하여 인삼사포닌이 신경세포의 유전자 발현에 어떤 변화를 일으키는지 조사하여 가능한 분자생물학적 기전을 추정하고자 고안되었다. 그동안 유전자 발현에 자주 사용되었던 신경세포주의 하나인 SH-SY5Y 세포에 진세노사이드 Rb1과 Rg1을 처리한 후 human 8K cDNA microarray를 이용하여 유전자 발현양상을 최초로 분석하였다.
시간대별(12, 24, 36, 48시간)로 25μL의 MTT[3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)2, 5- diphenyl tetrazolium bromide](5 mg/mL in PBS)를 가한 후 37℃, 5 % CO2 배양기에서 4시간 배양하였다. 배양이 끝난 플레이트에서 배지를 제거한 후 DMSO 100μL를 첨가하고 상온에서 30분 동안 천천히 교반한 후 ELISA reader로 측정하였다.48)
USA) 처리된 3차 증류수 30μL를 가하여 녹였다. 분광편광계(spectrophotometer VU 1601, Shimazu, Japan)를 이용하여 파장 260nm와 280nm로 흡광도를 측정하여 A260/A280의 값이 1.7 이상 인지를 확인하였다.
PCR 튜브에 대조군 total RNA와 실험군 total RNA로 각각 annealing 반응 혼합물(total RNA 100μg, control mRNA 1ng, oligo dT 시발체 2pmol)을 준비한 후 70℃5분간 방치하고 즉시 튜브를 얼음으로 옮겼다. 새 튜브에 실험군과 대조군 각각의 반응액 [5X AMV RT buffer, low dT dNTP, 1mM Cy3(대조군), Cy5(실험군)-dUTP, Rnase inhibitor(40U/μL) AMV reverse transcriptase(100units)]을 준비하여, annealing 반응 혼합물에 각각 첨가하고 42℃에서 1시간 동안 방치하였다. 0.
세포의 증식을 확인하기 위해 몇 가지 다른 농도의 total ginsenoside(32μg/10mL, 16μg/10mL, 8μg/10mL), Rg1(80μM, 40μM, 20μM) 그리고 Rb1(80μM, 40μM, 20μM)을 처리하고, 시간대별(12h, 24h, 36h, 48h) 로 MTT assay를 수행하였다. MTT assay 결과 대조군에 비해 total ginsenoside, Rg1, 그리고 Rb1을 처리한 세포들의 수가 더 많아졌으며, 전반적으로 36시간에서 세포의 수가 많이 증가하였다(그림 2-4).
총진세노사이드(32μg/10mL, 16μg/10mL, 8μg/10mL), Rg1(80μM, 40μM, 20μM), 그리고 Rb1(80μM, 40μM, 20μM)을 각 웰에 처리하였다. 시간대별(12, 24, 36, 48시간)로 25μL의 MTT[3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)2, 5- diphenyl tetrazolium bromide](5 mg/mL in PBS)를 가한 후 37℃, 5 % CO2 배양기에서 4시간 배양하였다. 배양이 끝난 플레이트에서 배지를 제거한 후 DMSO 100μL를 첨가하고 상온에서 30분 동안 천천히 교반한 후 ELISA reader로 측정하였다.
여기서는 Rb1과 Rg1에 의해 발현이 증가된 유전자를 세포내의 기능별로 분류하여 의미있다고 판단되는 각 유전자의 세포내 분자생물학적 기능이나 역할에 대해 고찰하여 ginsenoside의 효과를 가늠하고자 한다.
유전자 발현을 조사하기 위해 약 8170 유전자를 보유한 TwinChip TM Human-8K(Digital Genomics Inc, Korea)을 이용하여 cDNA microarrary를 수행하였다. PCR 튜브에 대조군 total RNA와 실험군 total RNA로 각각 annealing 반응 혼합물(total RNA 100μg, control mRNA 1ng, oligo dT 시발체 2pmol)을 준비한 후 70℃5분간 방치하고 즉시 튜브를 얼음으로 옮겼다.
이 연구에서는 먼저 ginsenoside Rb1과 Rg1을 SHSY5Y human neuroblastoma 세포에 처리했을 때 세포증식이나 세포생존력이 가장 활발할 때의 유전자 발현 변화를 보기 위하여 Rb1 또는 Rg1을 임의로 몇 가지 농도를 설정하여 처리하였고, 매 12시간마다 세포증식을 현미경으로 관찰하고 MTT assay로 확인하면서 세포생존력이 가장 활발할 때의 농도와 시간을 결정하였다.
Tusher 등52)에 의해 제안된 SAM은 서로 다른 두 실험 조건에서 어떤 유전자들이 차이가 있는지를 알아보기 위한 통계학적인 기술로서 유전자 발현과 반응변수 사이의 관계의 차이의 정도를 측정하는 방법이다. 이때 유전자별 통계량을 구하는 과정에서 SAM은 두 그룹간의 차이는 작음에도 불구하고 분산이 너무 작아 t-검증 통계량의 값이 커지는 것을 막기 위하여 보완인자(fudge factor)를 구하여 분모에 더해 줌으로서 유전자별 통계량을 계산한다.
Microarray는 작은 면적의 고체표면(유리판, nitrocellulose membrane 혹은 실리콘) 에 염기서열이 알려진 target DNA(cDNA 혹은 oligonucleotide)를 정해진 위치에 붙여 미세집적(microarray)시킨 것을 통칭한다. 이러한 DNA 칩에 분석하고자하는 시료 DNA 단편을 결합시키면 DNA 칩에 부착되어 있는 probe와 시료 DNA 단편상의 염기서열의 상보적 정도에 따라 각기 다른 결합(hybridization)상태를 이루게 되는데 이를 광학적인 방법 또는 방사능 화학적 방법 등을 통해 관찰 해석함으로써 시료 DNA의 염기 서열을 측정할 수 있다. 즉 수천 수만개의 유전자에 대한 DNA 배열(sequence)을 두 개의 클라스에 깔아놓고, 각기 다른 환경에서 채집된 mRNA를 역전사하여 만든 cDNA 를 hybridization하면 특정 유전자들이 이 cDNA와 특별히 많이 결합되어 발현수치가 높아진다.
59)로, Rb1의 경우 2-fold(M=1)로 임의로 정하였다. 일반적으로 통계적으로 의미있게 발현이 차이가 나는 유전자를 선별하기 위해서는 4회의 반복실험이 필요한 것으로 알려져 있지만 이 실험에서는 Digital Genomics에서 제공한 TwinChipTM을 이용한 Dye-swap 실험을 하여, 2회의 반복실험으로 4회와 동일한 결과를 얻을 수 있었고, Significance analysis of microarrays(SAM)를 이용 하여 의미 있게 발현이 변화하는 유전자를 선별하였다. Tusher 등52)에 의해 제안된 SAM은 서로 다른 두 실험 조건에서 어떤 유전자들이 차이가 있는지를 알아보기 위한 통계학적인 기술로서 유전자 발현과 반응변수 사이의 관계의 차이의 정도를 측정하는 방법이다.
SH-SY5Y human neuroblastoma 세포를 96-웰 플레이트에 각각 1×104개 분주하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 12시간 동안 배양하였다. 총진세노사이드(32μg/10mL, 16μg/10mL, 8μg/10mL), Rg1(80μM, 40μM, 20μM), 그리고 Rb1(80μM, 40μM, 20μM)을 각 웰에 처리하였다. 시간대별(12, 24, 36, 48시간)로 25μL의 MTT[3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)2, 5- diphenyl tetrazolium bromide](5 mg/mL in PBS)를 가한 후 37℃, 5 % CO2 배양기에서 4시간 배양하였다.
대상 데이터
SH-SY5Y human neuroblastoma 세포는 2mM Lglutamate와 Earle’s balanced salt가 포함된 minimal essential medium(MEM) 배지에 10% fetal bovine serum과 100IU/I penicillin, 10μg/ml stereptomycin 을 첨가하여 습기를 보유한 37℃, 95% air/5% CO2의 배양기에서 배양하였다. 세포는 5×106 cells/10-mm plate 가 되도록 polystyrene tissue culture dish에 분주하였으며 24시간 동안 세포를 부착시킨 후, 새로운 배지로 갈아주면서 80μL의 Rg1과 Rb1(80μM)을 각각 처리하였다.
SH-SY5Y human neuroblastoma 세포를 96-웰 플레이트에 각각 1×104개 분주하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 12시간 동안 배양하였다. 총진세노사이드(32μg/10mL, 16μg/10mL, 8μg/10mL), Rg1(80μM, 40μM, 20μM), 그리고 Rb1(80μM, 40μM, 20μM)을 각 웰에 처리하였다.
85) 또한 D-cyclins는 kinase-independent manner로서 p27Kip1과 상호작용하여 세포주기 진행을 조절하는 것으로 보인다. 본 실험에서 사용된 SH-SY5Y세포는 증식될수있는 종양세포로서 D-cyclin의 발현증가는 어쩌면 당연한 것일 수도 있겠다.
이론/모형
Chomczynski와 Sacchi50)에 의해 개발된 single-step RNA isolation method를 개선한 TRIZOL(Invitrogen, Carlsbad, CA) 방법으로 Total RNA 분리를 수행하였다. 진세노사이드 Rb1과 Rg1을 처리하고 36시간이 지난 후에 배지를 제거하고 차가운 phosphate buffered saline (PBS, pH 7.
따라서 이 연구의 목적은 ginsenoside를 신경세포에 처리했을 때 과연 세포내의 유전자가 어떻게 발현될 것인가에 대한 일차적인 세포내부의 변화를 조사하기 위해 고안되었다. 유전자 발현변화는 전체 단백질수준 (proteomics)에서 측정되거나, mRNA수준(transcriptomics)에서 측정될 수 있겠으나 여기서는 transcriptome 분석에서 유용하게 널리 쓰이고 있는 cDNA microarray 방법을 사용하였다. 이 연구에서는 신경세포의 유전자 발현연구에 흔히 사용되는 SH-SY5Y human neuroblastoma 세포45-47)에 Rb1과 Rg1을 처리한 후 8천개 이상의 Human cDNA가 포함된 microarrary를 사용하여 유전자 발현양상을 최초로 분석하여 ginsenoside의 신경세포에 대한 분자생물학적 기전을 추정하고자 하였다.
이 연구에서 세포생존력 또는 세포증식을 가장 증진시킬 수 있는 ginsenoside의 농도를 결정하기 위하여 MTT [3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)2, 5-diphenyl tetrazolium bromide] assay를 수행하였다. MTT assay 는 Mossman49)에 의해 개발되었으며 살아있는 세포의 mitochondrial dehydrogenases에 의한 MTT의 환원 (reduction)에 근거하고 있으며 노란색의 tetrazolium salt는 대사가 활발한 세포에서 환원되어 불용의 자줏빛의 formazan crystal을 형성한다.
각 세포형태는 세포수와 흡광도 사이에 선형관계(linear relationship)가 이루어져 세포생존력(cell viability)이나 세포증식(cell proliferation)의 변화를 정확하고 바르게 정량화할 수 있어 안전하고 정확한 검사법이다. 이 연구에서는 다음 순서에 따라 MTT assay를 시행하였다.
Microarray scanning은 Packard 사의 Scanarryseries QuantArray를 이용한 confocal laser scanning을 통하여 이미지를 얻은 후 GenePix(Axon, USA) 프로그램을 이용하여 각 유전자의 intesity 정량 및 유전자 발현 양상을 분석하고, normalization을 수행하였다. 이 연구의 각 유전자 발현 데이터는 Rg1이나 Rb1을 처리한 군은 Cy5 dye에 의한 signal을 붉은색으로, 대조군의 Cy3 dye에 의한 signal을 녹색으로 표시하여 두 image를 겹쳐서 표시하였고 자료의 표준화를 위하여 DNA chip 연구자들에게 일반적으로 받아들여지고 있는 intensity/location-dependent normalization 방법51)을 이용하였다.
성능/효과
1) 인삼 학명의 어원을 보면 Pan은“모든 것”Axos는“의학”이라는 뜻으로“만병통치약”이라는 의미이다.2) 인삼은 예부터 한국, 중국, 일본 등 동양에서 우수한 약재로 취급되었다.
총 ginsenoside를 처리했을 때 8μg군은 24시간이내에는 대조군과 차이가 없었으나(12시간 117%, 24시간 110%), 36시간이 지나면서 대조군에 비해 130%로 세포 생존력(cell viability)이 증가하여 48시간에 185%까지 증가하였다. 16μg군은 12시간에 146%로 대조군보다 생존력이 증가하였다가 24시간에 70%로 감소하였고 이후 회복되어 36시간에 120%, 48시간에는 158%로 대조군보다 더 증가하였다. 총 ginsenoside 32μg군은 12시간에 84%로 대조군보다 생존력이 떨어져 있다가 24시간에는 31%로 급격히 줄었고, 36시간에 140%, 48시간에 115%로 회복되었다.
1) 인삼 학명의 어원을 보면 Pan은“모든 것”Axos는“의학”이라는 뜻으로“만병통치약”이라는 의미이다.2) 인삼은 예부터 한국, 중국, 일본 등 동양에서 우수한 약재로 취급되었다. 인삼은 약재 중에서도 으뜸의 자리를 지켜온 선약 또는 영약으로 오늘날까지 동의약 처방에서 사용되고 있으며 미국에서도 식품보조제로 그 소비가 증가하고 있다.
한편, Rb1을 처리한 경우 20μM군은 대조군과 시간변화에 따른 차이가 없이 세포 생존력에 별 영향을 미치지 못했다. 40μM군과 80μM 군은 12시간에 각각 127%, 122%로 대조군에 비해 증가되었다가 24시간에 대조군수준(95%, 94%)으로 떨어졌으나 36시간에는 최대(123%, 150%)의 활성을 보이다가 48시간에서 다소 줄어드는 경향(81%, 120%)이있었다. Rg1군은 농도에 따른 영향이 대조군과 다른 세군 간에 비슷하게 나타났으나 36시간에 더 활발한 경향은 있었다.
이세단계 각각은 별개의 분자들, 즉 eukaryote initiation factors(eIF), eukaryote elongation factors(eEF), 그리고 eukaryote release factors(eRF)에 의해 수행되고 조절된다.69)70) Rb1과 Rg1을 처리한 신경세포에서도 eEF1B2, eIF3S5, eEF1b2 등의 번역조절인자들의 발현이 증가하는 점으로 보아 Rb1과 Rg1이 분명히 단백질 합성의 번역과정에 역할을 하는 것으로 보인다.
71) 인간 transcriptome의 체계적 분석은 번역조절이 RPs의 유전자 발현에서 필수적인 역할을 한다는 점은 분명한 것 같다.72) Rb1과 Rg1은 RPs의 발현을 증가시켜 단백질 합성을 위한 필수단백질을 만들어 냄으로서 단백질합성능력을 증가시켜 세포내 동화작용을 돕는 것으로 생각된다.
세포의 증식을 확인하기 위해 몇 가지 다른 농도의 total ginsenoside(32μg/10mL, 16μg/10mL, 8μg/10mL), Rg1(80μM, 40μM, 20μM) 그리고 Rb1(80μM, 40μM, 20μM)을 처리하고, 시간대별(12h, 24h, 36h, 48h) 로 MTT assay를 수행하였다. MTT assay 결과 대조군에 비해 total ginsenoside, Rg1, 그리고 Rb1을 처리한 세포들의 수가 더 많아졌으며, 전반적으로 36시간에서 세포의 수가 많이 증가하였다(그림 2-4).
Rg1을 처리한 경우 Rb1을 처리한 경우보다 훨씬 더 많은 단백질 생합성에 관여하는 RPs가 증가하였으며, 전사 (transcription)에 관여하는 eIF3S5, eEF1b2, RPLP0와 번역(translation)에 관여하는 HMGB1, HMGB2, MLL2, ZNF45와 같은 유전자의 발현이 증가되었다. HMGB1과 HMGB2는 전사의 조절, DNA 복구, 재조합, 분화, 그리고 세포외 신호전달에 관여하는 유전자63-65)로서 Rg1에 의해 발현이 증가된다.
Rg1을 처리한 경우 세포주기 조절에 관여하는 CDK2- AP1과 CCND1(cyclin D1)이 3배 이상 발현이 증가하였고, 세포증식과 성장에 관여하는 AF1Q, SUI1, DDX5의 발현이 증가하였다. CDK2AP1은 정상각화 세포(keratinocytes)로부터 발견, 분리된 가설적 성장억제 유전자이다.
9% saline을 처리하여 12시간마다 세포증식을 현미경으로 관찰하였다. 그 결과 다른 세포들에 비해 Rb1을 처리한 세포들이 많아졌으며, 특히 80μM의 Rb1을 처리하였을 때 세포의 수가 가장 증가하였다(그림 1).
이 연구에서 MTT assay를 바탕으로 Rb1과 Rg1 80μM을 처리하여 36시간 배양한 후 total RNA를 분리하였으며, 대조군과 Rb1 그리고 대조군과 Rg1을 각각 cDNA microarray에 hybridzation하여 유전자 발현변화를 분석한 결과, Rb1에 의해 40개의 유전자가 상대적인 발현비율이 2배 이상 증가하였다. 그리고 Rg1에 의해 125개의 유전자가 2배 이상 발현이 증가하였고, 3배 이상 증가된 유전자를 기준으로 했을 때는 96개의 유전자의 발현이 증가하였다. 반면에 2배 이상(50% 이하) 발현이 저하된 유전자는 34개였고, 7개의 유전자가 3배 이상(33% 이하) 발현이 저하되었다.
Rg1을 처리한 경우 발현이 증가한 유전자는 단백질 생합성에 관여하는 ribosomal proteins(RPs)이었는데, 그 수는 Rb1을 처리한 경우보다 더 많았다. 그리고 전사와 번역에 관여하는 EIF3S5, EEF1b2, RPLP0, HMGB1, HMGB2, MLL2, ZNF45와 같은 유전자의 발현이 증가하였으며, 신호변환(signal transduction)에 관련된 YWHAQ, YWHAE 및 CALM2 등의 유전자도 발현이 증가하였다. 그외 AF1Q, DDX5와 같은 세포증식과 세포 성장에 관여하는 유전자도 발현이 증가하였다(그림 5) (표 1-2).
이 연구가 신경세포주에서 이루어졌기 때문에, Rg1에 의해 상승된 유전자 발현이 유전자 프로그램에 따라 진행되는 일련의 신경발생과정과 분화에 영향을 주었다 기보다는 신경세포의 증식, 발아, 재생, 가소성 등 세포골격의 변화를 유발할수 있는 상태에 영향을 준다고 볼수 있을 것이다. Rg1이 신경세포증식과 성장에 효과가 있고, LTP유도 및 기억장애개선효과, 신경보호 및 세포사멸방지효과, 항노화 기능 등이 있음을 이미 밝혔다.
이 연구에서 MTT assay를 바탕으로 Rb1과 Rg1 80μM을 처리하여 36시간 배양한 후 total RNA를 분리하였으며, 대조군과 Rb1 그리고 대조군과 Rg1을 각각 cDNA microarray에 hybridzation하여 유전자 발현변화를 분석한 결과, Rb1에 의해 40개의 유전자가 상대적인 발현비율이 2배 이상 증가하였다. 그리고 Rg1에 의해 125개의 유전자가 2배 이상 발현이 증가하였고, 3배 이상 증가된 유전자를 기준으로 했을 때는 96개의 유전자의 발현이 증가하였다.
총 ginsenoside군에서 농도에 따른 이런 변화는 8μg군에서는 시간이 지남에 따라 차츰 세포생존력을 높여 48시간에 최고조로 증가하였으나 농도가 높을수록(32μg) 초기에는 세포독성을 나타내다가 시간이 지나면서 세포가 회복작용을 보이는 경향이 있었다. 이러한 결과를 바탕으로 세포생존력에 도움이 되는 적절한 농도는 8~16μg으로 추정하였고, 그 이상의 농도에서는 오히려 세포에 독성작용이 더 강한 것으로 생각되었다. 그러나 고농도로 처리했더라도 시간이 지나면서 회복작용을 보였다.
그러나 다음과 같이 다른 요인도 함께 작용할 수 있다는 점이 고려되어야 할 것이다. 첫째, 이 실험이 세포 생존력이나 세포증식이 활발할 때를 반영하고 있지만 그것은 일부에 지나지 않고 그 외의 유전자 발현에 영향을 미칠 수 있는 물리적, 화학적, 그리고 생물학적인 여러가지 요인들이 반영되어 나타났을 수 있고 Rg1이 이런 요인들이 Rb1보다 더 많이 반영되었을 수도 있겠다. 둘째, 처리한 농도가 Rg1과 Rb1 모두 80μM의 동일한 농도를 임의로 적용했기 때문에 세포생존력에 가장 적절한 농도가 반영되지 않았을 수도 있다.
16μg군은 12시간에 146%로 대조군보다 생존력이 증가하였다가 24시간에 70%로 감소하였고 이후 회복되어 36시간에 120%, 48시간에는 158%로 대조군보다 더 증가하였다. 총 ginsenoside 32μg군은 12시간에 84%로 대조군보다 생존력이 떨어져 있다가 24시간에는 31%로 급격히 줄었고, 36시간에 140%, 48시간에 115%로 회복되었다. 총 ginsenoside군에서 농도에 따른 이런 변화는 8μg군에서는 시간이 지남에 따라 차츰 세포생존력을 높여 48시간에 최고조로 증가하였으나 농도가 높을수록(32μg) 초기에는 세포독성을 나타내다가 시간이 지나면서 세포가 회복작용을 보이는 경향이 있었다.
총 ginsenoside 32μg군은 12시간에 84%로 대조군보다 생존력이 떨어져 있다가 24시간에는 31%로 급격히 줄었고, 36시간에 140%, 48시간에 115%로 회복되었다. 총 ginsenoside군에서 농도에 따른 이런 변화는 8μg군에서는 시간이 지남에 따라 차츰 세포생존력을 높여 48시간에 최고조로 증가하였으나 농도가 높을수록(32μg) 초기에는 세포독성을 나타내다가 시간이 지나면서 세포가 회복작용을 보이는 경향이 있었다. 이러한 결과를 바탕으로 세포생존력에 도움이 되는 적절한 농도는 8~16μg으로 추정하였고, 그 이상의 농도에서는 오히려 세포에 독성작용이 더 강한 것으로 생각되었다.
총 ginsenoside를 처리했을 때 8μg군은 24시간이내에는 대조군과 차이가 없었으나(12시간 117%, 24시간 110%), 36시간이 지나면서 대조군에 비해 130%로 세포 생존력(cell viability)이 증가하여 48시간에 185%까지 증가하였다. 16μg군은 12시간에 146%로 대조군보다 생존력이 증가하였다가 24시간에 70%로 감소하였고 이후 회복되어 36시간에 120%, 48시간에는 158%로 대조군보다 더 증가하였다.
후속연구
그리고 특히 Rg1을 처리했을 때, 신호변환, 세포증식과 성장, 세포주기 조절 등에 관련된 유전자 발현을 증가시키는 기능을 더함으로서 신경세포의 유전자기전에 대한 ginsenoside의 가능한 역할에 대해 새로운 통찰을 제공한다. 또한 Rg1 처리 후 초기 신경발달 동안에 높은 발현을 보이고 아울러 신경가소성에 중요한 역할을 한다고 알려진 SCG10의 발현을 상향조절함으로서 Rg1이 신경세포증식이나 발아(sprouting), 성장에 어떤 역할을 할 것으로 생각되며, 나아가 신경세포의 시냅스 구조변화를 용이하게 하고, 구조적 가소성 작용에 중요한 역할을 함으로서 손상된 세포의 재건, 학습 및 기억항진 기능, 세포사멸 방지 및 퇴행성 신경질환의 예방에 이르기까지 일부 역할을 할 가능성을 제시한다.
그러므로 Rg1이 Rb1보다 더 적절한 농도여서 더 광범위한 유전자 발현변화를 보였을 수도 있는 것이다. 셋째, 이 연구가 정확히 ginsenoside를 36시간동안 처리하고 그 시점에서의 유전자 발현을 보았기 때문에 시간변동을 반영하지 못했다는 점이다. 예를 들면, 현미경 사진상 Rb1의 경우 초기부터 증식이 두드러졌는데, 36시간째의 microarray 결과에서는 이를 반영할 수 없었다.
더구나 이 연구가 최초의 연구 이기 때문에 비교할 수 있는 자료도 없는 실정이다. 이런 점들은 이 연구의 제한점으로 추후 보완연구가 수행되어야 할 것이다.
또 다른 기전으로 진세노사이드가 세포에 도움이 되는 어떤 기전이 작용하여 시간이 경과하면서 회복을 보이는 것일 수도 있 겠다. 이런 점에 대해서 더 명확한 결론을 위해서는 이 실험만으로는 불충분하므로 더 시간을 세분하고 길게 적용하고 아울러 농도를 더 다양하게 하여 시간과 농도에 따른 여러 조합을 사용하여 세포생존력 변화를 살펴보는 정밀한 연구가 필요할 수 있다.
한가지 아쉬운 점은 이 실험이 진세노사이드를 처리한지 36시간에 한번만 이루어졌기 때문에 시간에 따른 유전자 발현의 변화양상을 알수 없다는 점이다. 이점은 추후 연구에서 반드시 규명되어야 할 것으로 보인다.
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