[논문]SH-SY5Y 세포에서 도네페질과 병용투여시 신경보호 효과를 나타내는 한약재의 in vitro 선별 연구

송수진; 류천봉; 홍민호; 김근우; 구병수

doi:10.7231/jon.2019.30.3.199

SH-SY5Y 세포에서 도네페질과 병용투여시 신경보호 효과를 나타내는 한약재의 in vitro 선별 연구
In Vitro Screening of Traditional Medicinal Herbs Combined with Donepezil for Neuroprotective Effects in SH-SY5Y Cells 원문보기

동의신경정신과학회지 = Journal of oriental neuropsychiatry, v.30 no.3, 2019년, pp.199 - 207

송수진 (동국대학교 한의과대학 한방신경정신과학교실) , 류천봉 (동국대학교 한의과대학 한방신경정신과학교실) , 홍민호 (동국대학교 한의과대학 한방신경정신과학교실) , 김근우 (동국대학교 한의과대학 한방신경정신과학교실) , 구병수 (동국대학교 한의과대학 한방신경정신과학교실)

Abstract ▼ AI-Helper

Objectives: The purpose of this study was to evaluate the neuroprotective effects of donepezil and 33 kinds of herbal extract combinations in SH-SY5Y cells with $A{\beta}_{25-35}$ treatment. Methods: MTT assay was performed to measure the cell viability of each herbal extract combined with donepezil against $A{\beta}$-induced neurotoxicity. The most active extracts were then subjected to assess the effects on CREB phosphorylation and COX-2 expressions through the western blot analysis. Results: There were eight herbal extracts representing significant increase on the cell viability: 1) Erycibe obtusifolia, 2) Polygonum multiflorum, 3) Polygala tenuifolia, 4) Illicium verum, 5) Santalum album, 6) Loranthus parasticus, 7) Platycladus orientalis, and 8) Zanthoxylum piperitum. Especially, when Santalum album and donepezil were treated together, the phosphorylation of CREB significantly increased and COX-2 protein expression was significantly inhibited. Conclusions: Among the screened herbal extracts, combination treatment of each of the eight herbs and donepezil showed neuroprotective effects in SH-SY5Y cells. Additionally, the combination of Santalum album and donepezil suggested cognitive improvement by up-regulation of p-CREB and down-regulation of COX-2.

주제어

표/그림 (4)

표 Table 1. List of Tested Herbal Medicinal Extracts with Donepezil and Their Neuroprotective Effects against Aβ _25–35-induced Neurotoxicity in SH-SY5Y Cells
표 Table 1. Continued 1
그림 Fig. 1. Effects of the herbal extract with donepezil on the viability of SH-SY5Y cells with Aβ_25–35 treatment.
그림 Fig. 2. Expression of p-CREB and COX-2 in SH-SY5Y cells. (A) To evaluate the protein level of p-CREB and COX-2 expression, cells were incubated with 200 μg/ml S. album and 5 μM donepezil. For the control, non-incubated cells were analyzed. The level of (B) p-CREB and (C) COX-2 in cell lysates was measured by immunoblotting.

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구에서는 서른 세 가지의 한약재를 사용하여 SHSY5Y 세포 모델에서 Aβ의 신경독성에 대한 한약 및 도네 페질 병용 투여의 세포보호 효과를 관찰하였다. 결과적으로 Aβ에 의한 세포생존율의 감소는 정공등(丁公藤), 하수오(何首烏), 원지(遠志), 대회향(大茴香), 백단향(白檀香), 상기생 (桑寄生), 측백엽(側柏葉), 촉초(蜀椒)와 도네페질의 복합 투여에 의하여 유의하게 완화되었다.
33종의 단일 한약재를 선택하였고, Aβ로 신경독성을 유도한 SH-SY5Y 세포에 단일 한약재의 추출물을 도네페질과 함께 처리하여 세포생존율을 관찰하였다. 이를 통해 개별 한약재와 도네페질의 상호 연관성과 알츠하이머병의 치료 효과에 대하여 알아보고자 하였으며, 나아가 도네페질과 병용하여 약효 상승을 기대하는 한약의 개발 가능성을 보고자 하였다.

제안 방법

1. 도네페질과 한약 추출물을 SH-SY5Y 세포 모델에 동시 처리하여 MTT assay를 수행함으로써 효과적인 한약재를 스크리닝하였다. 그 결과, Aβ로 유도된 신경독성에 대해 정공 등, 하수오, 원지, 대회향, 백단향, 상기생, 측백엽, 촉초 각각의 한약과 도네페질의 복합 투여는 신경보호 효과를 가진다.
백단향과 도네페질 병용 투여가 인지기능 향상 효과를 나타내는 작용 기전을 밝히기 위하여 SH-SY5Y 세포 모델에서 CREB 인산화 및 COX-2 단백질 발현을 검토하는 일련의 실험을 수행하였다(Fig. 2).
본 연구에서는 기존의 선행 연구 및 문헌 고찰 논문을 바탕으로 하여^10-17)33종의 단일 한약재를 선택하였고, Aβ로 신경독성을 유도한 SH-SY5Y 세포에 단일 한약재의 추출물을 도네페질과 함께 처리하여 세포생존율을 관찰하였다. 이를 통해 개별 한약재와 도네페질의 상호 연관성과 알츠하이머병의 치료 효과에 대하여 알아보고자 하였으며, 나아가 도네페질과 병용하여 약효 상승을 기대하는 한약의 개발 가능성을 보고자 하였다.

대상 데이터

실험에 사용된 한약은 Table 1에서 확인할 수 있으며, 태원당약업사(Daegu, Korea)에서 구입하였다. 예외적으로 백단향(白檀香)은 TFS Corporation Ltd.

데이터처리

모든 자료는 평균값±표준오차(mean±standard error) 로 표시하였고, 실험 결과에 대한 통계학적 유의성은 Student’s t-test로 검증하여 p-value가 0.05 이하인 경우를 유의한 것으로 판정하였다(*p＜0.05, **p＜0.01, ***p＜0.001).

이론/모형

8, 2% SDS, 20% glycerol, 10% 2-mercaptoethanol)를 사용하여 단백질을 분리하였다. 단백질 정량은 bicinchoninic acid (BCA, Pierce) 법을 사용하였다. 정량된 단백질 시료 30 μg을 4∼12% sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gradient gel (Invitrogen) 전기영동법(SDS-PAGE)으로 분리되었고, nitrocellulose paper (Amersham)로 옮겼다.
도네페질과 함께 투여된 여러 가지 한약재가 Aβ로 유도된 신경세포 독성에 대해 보호 효과를 가지는지 검토하기 위하여 MTT assay를 수행하였다. 도네페질 5 uM과 각각의 한약재 추출물의 농도를 각각 10, 50, 200 μg/ml씩 조합한 복합제제를 SH-SY5Y 세포 모델에 처리하여 세포생존율을 측정한 결과, Aβ로 인해 감소되었던 세포생존율이 유의성 있게 증가한 한약재는 정공등(丁公藤) 200 μg/ml (p＜0.

성능/효과

2. 세포생존율이 Aβ에 의해 감소했던 상태에서 도네페질과 한약 추출물 복합 투여에 의해 증가한 결과를 토대로, 백단향과 도네페질의 조합이 가장 효과가 우수하였다.
3. 백단향과 도네페질의 병용은 CREB 활성화 및 COX-2 활성 저해를 통해 인지기능 저하를 개선할 수 있음을 시사한다.
CREB은 뇌유래 신경성장인자(brain-derived neurotrophic factor; BDNF)의 발현을 조절하는 전사인자로 가장 유력하게 제시되고 있으며, BDNF는 신경세포 발생 및생존, 장기 기억력 강화, 시냅스 가소성 등과 관련되어 퇴행성 뇌질환에서 신경세포의 생존 및 보호에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다³⁸⁾. CREB의 활성화는 백단향과 도네페질을 병용 처리한 경우 CREB의 인산화를 통하여 활성화되어 p-CREB 형태가 증가되었으며, 이는 BDNF의 발현 증가를 통한 기억력 향상 효과를 매개할 것으로 추정된다. CREB은 기억력뿐만 아니라, 우울과 불안에도 관련이 있으며³⁹⁾, 따라서 치매의 행동심리증상에도 백단향과 도네페질의 병용 투여를 고려해 볼 수 있을 것이다.
본 연구에서는 서른 세 가지의 한약재를 사용하여 SHSY5Y 세포 모델에서 Aβ의 신경독성에 대한 한약 및 도네 페질 병용 투여의 세포보호 효과를 관찰하였다. 결과적으로 Aβ에 의한 세포생존율의 감소는 정공등(丁公藤), 하수오(何首烏), 원지(遠志), 대회향(大茴香), 백단향(白檀香), 상기생 (桑寄生), 측백엽(側柏葉), 촉초(蜀椒)와 도네페질의 복합 투여에 의하여 유의하게 완화되었다. 이들 8종 한약의 약용부 위는 다양하였으며, 기미(氣味)를 분석한 바에 의하면 평성 (平性) 약재 1종, 미온성(微溫性) 약재 2종, 온성(溫性) 약재 4종, 열성(熱性) 약재 1종이 있었다.
도네페질과 한약 추출물을 SH-SY5Y 세포 모델에 동시 처리하여 MTT assay를 수행함으로써 효과적인 한약재를 스크리닝하였다. 그 결과, Aβ로 유도된 신경독성에 대해 정공 등, 하수오, 원지, 대회향, 백단향, 상기생, 측백엽, 촉초 각각의 한약과 도네페질의 복합 투여는 신경보호 효과를 가진다.
도네페질과 함께 투여된 여러 가지 한약재가 Aβ로 유도된 신경세포 독성에 대해 보호 효과를 가지는지 검토하기 위하여 MTT assay를 수행하였다. 도네페질 5 uM과 각각의 한약재 추출물의 농도를 각각 10, 50, 200 μg/ml씩 조합한 복합제제를 SH-SY5Y 세포 모델에 처리하여 세포생존율을 측정한 결과, Aβ로 인해 감소되었던 세포생존율이 유의성 있게 증가한 한약재는 정공등(丁公藤) 200 μg/ml (p＜0.05), 하수오(何首烏) 200 μg/ml (p＜0.01), 원지(遠志) 50 μg/ml (p＜0.01), 대회향(大茴香) 50 μg/ml (p＜0.05) 및 200 μg/ ml (p＜0.05), 백단향(白檀香) 50 μg/ml (p ＜0.05) 및 200 μg/ml (p＜0.01), 상기생(桑寄生) 200 μg/ml (p＜0.01), 측백엽(側柏葉) 200 μg/ml (p＜0.05), 촉초(蜀椒) 200 μg/ ml (p＜0.05), 총 8종이었다(Table 1).
또한 염증 인자인 COX-2 단백질의 발현 억제 효과를 실험한 결과, COX-2 단백질 발현량이 백단향과 도네페질의 병용 투여군에서 유의하게 억제되는 것을 확인하였다. 그러나 도네페질 단일 투여군에서는 COX-2 발현량이 소폭 감소함에도 불구하고 유의성은 나타나지 않았다.
본 연구에서는 이들 한약재 중에서도 백단향과 도네페 질의 병용에 대한 효능이 월등히 유의한 것을 관찰하였 는데, 백단향과 도네페질의 병용은 CREB 인산화와 COX2 단백질 수준에서도 유의한 변화를 나타내었다. CREB은 뇌유래 신경성장인자(brain-derived neurotrophic factor; BDNF)의 발현을 조절하는 전사인자로 가장 유력하게 제시되고 있으며, BDNF는 신경세포 발생 및생존, 장기 기억력 강화, 시냅스 가소성 등과 관련되어 퇴행성 뇌질환에서 신경세포의 생존 및 보호에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다³⁸⁾.
첫 번째로 신경세포 재생에 관여하는 전사인자인 cAMP 반응요소 결합단백질(cAMP response element binding protein;CREB)의 활성화를 인산화 특이 항체를 사용하여 확인하였으며, 그 결과 Aβ를 처리하였을 때 인산화된 CREB의 양이 대조군에 비해 현저히 감소하였고, 이후 백단향 및 도네페질을 병용 투여함으로써 CREB의 인산화가 대조군과 유사한 수준으로 유의하게 증가하였다. 도네페질 단일 투여군에서도 CREB의 인산화가 증가하였으나, 그룹간의 통계적인 차이는 보이지 않았다.

후속연구

특히 백단향에서는 CREB 활성화와 COX-2 활성 억제에 대한 효과를 확인하여 작용 기전을 구체적으로 제시하였다. 그러나 본 연구에 포함된 실험은 in vitro 수준 에서만 이루어졌으므로 이들 한약 효능에 대한 보다 신뢰도 높은 과학적 근거 제시를 위해서는 향후 동물 모델을 적용하여 비임상 유효성 검증이 필요할 것이다.
알츠하이머병은 Aβ가 발병에 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀져 Aβ를 통한 치매 유발 독성 실험이 다양 하게 진행되고 있다. 본 연구에서 스크리닝한 한약들이 도네 페질과 함께 투여되었을 때 Aβ 처리와 같은 치매 유발 독성에 대한 뇌신경세포 사멸을 보호하는 효과가 있다는 것은 향후 그들이 알츠하이머병의 예방 및 치료제로 이용될 가능성을 제시한다. 특히 백단향에서는 CREB 활성화와 COX-2 활성 억제에 대한 효과를 확인하여 작용 기전을 구체적으로 제시하였다.
항염증의 관점에서 보고된 연구가 있으나²³⁾, 직접적으로 치매와 관련된 보고는 없었다. 정공등에 대한 알츠하이머병 치료 효능을 보고하는 한의학적인 연구는 부족하므로 추가적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	치매는 무엇인가?	치매는 후천적 뇌질환에 의한 다발성 인지장애가 일상생활의 장애를 일으키는 상태로 뇌신경의 퇴화에 의해 발생하는 임상증후군이다1). DSM-5에서는 주요 신경인지 장애(Major Neurocognitive Disorder)로 기술된 상태에 해당하며, 학습, 기억, 언어, 집행 기능, 복합적 주의, 지각-운동, 사회 인지 능력에서 현저한 장애를 초래하여 일상에서의 독립적인 활동 능력을 점진적으로 저하시키는 증상을 특징으로 한다2).
	알츠하이머병 질환의 주원인은?	가장 대표적인 치매의 원인 질환은 알츠하이머병이며 치매의 60% 이상을 차지하는데3), 알츠하이머병은 베타아밀로이드(β-amyloid; Aβ) 단백질의 과다생성으로 인해 침착되는 아밀로이드반(amyloid plaques)이 주원인 중 하나로 알려져 있다4,5). Aβ는 신경세포사멸(neuronal apoptosis)을 유도하여 신경전달물질인 아세틸콜린의 활성 상태를 저하시키는데, 그 과정에서 활성산소종(reactive oxygen species; ROS)이 생성되어 산화적 스트레스를 유발하고, 염증 반응을 통해 점차적인 시냅스 손상이 발생하여 치매 발병 기전에 영향을 미친다6).
	알츠하이머병에 대한 약물요법 중 도네페질이 증상 완화 또는 지연시키는 원리는?	이에 따라 알츠하이머병에 대한 약물요법은 Aβ 신경독성, 신경전달물질 결핍, 산화적 스트레스, 세포손상, 염증 등과 관련된 여러 가지 경로를 표적으로 하지만, 이러한 약물은 근본적 치료제가 아닌 증상완화제로 작용한다7). 그 중에서도 도네페질(donepezil)은 아세틸콜린분해효소(acetylcholinesterase; AChE)를 비경쟁적, 선택적으로 억제함으로써 아세틸콜린의 양을 증가시켜 알츠하이머병 증상을 완화 또는 지연시킨다8). 그렇지만 알츠하이머병은 다양한 발병기전을 가지고 있으며, 그 중 하나의 기전만 억제해서는 의미 있는 치료 효과를 보이지 않는 것으로 알려져 있다9).

저자의 다른 논문 :

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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