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문제 정의
- 따라서, 본 연구에서는 육계 EtOH 추출물이 HT-29 대장암 세포의 증식 및 PGE2, cGMP 생성, 또한 정상세포의 증식에 미치는 영향을 조사하여 유의한 결과를 얻어 대장암을 예방하는 보조식품으로서의 가능성이 있기에 이를 보고하는 바이다.
제안 방법
- 제조사의 방법에 따라 정량하였다. 48 weU plate에 세포를 분주하여 24시간 배 양한 후 육계 추출물을 10, 50, 100, 200 pg/mL 농도로 처리 하여 18시간 배 양하고, 배 양액을 시 료로 사용하였다. Goat anti-mouse IgG가 부착되 어있는 96 well plate에 PGE2 표준액 또는 시료를 가한 후, PGE2~peroxidase conj나gate와 mouse anti-PGE?를 각각 50 pL씩 가하고 실온에서 1시간 반응시킨 후, 0.
- 제조사의 방법에 따라 정량하였다. 48 weU plate에 세포를 분주하여 24시간 배 양한 후 육계 추출물을 10, 50, 100, 200 pg/mL 농도로 처리 하여 18시간 배 양하고, 배 양액을 시 료로 사용하였다. Goat anti-mouse IgG가 부착되 어있는 96 well plate에 PGE2 표준액 또는 시료를 가한 후, PGE2~peroxidase conj나gate와 mouse anti-PGE?를 각각 50 pL씩 가하고 실온에서 1시간 반응시킨 후, 0.
- 96 well plate에 세포를 분주하여 24시간 배 양한 후 육계 추출물을 10, 50, 100, 200 pg/mL 농도로 처리 하고 12, 24, 48, 72시간 배양하였다. 배양완료 후 0.
- 즉, 세포를 PBS로 세척한 후 lysis buffer에 묭해하고, chloroform을 가한 후 13, 000 rpnr게서 10분동안 원심분리하여 RNA가 있는 상증액을 얻고, 이를 RNA-binding column에 통과시켰다. Column을 2회 세척한 후, elution buffer를 통과시켜 RNA를 얻은 후 정량하여 total RNA가 500 ng이 되 도록 각각 맞춘 후, Maxime RT-PCR Premix kitdntron biotechnology, Korea)을 이용하여 COX-2에 대한 semi-quantitive RT-PCR을 실시하였는데, p-actin 발현량이 일정함을 확인한 후 실시하였다. 사용된 COX-2 priiner의 염기서열은 다음과 같다; 5'-TTC AAA TGA GAT TGT GGG AAA AT-3'(sense strand), 5'-AGA TCA TCT CTG CCT GAG TAT CTT-3'(antisense strand).
- 48 weU plate에 세포를 분주하여 24시간 배양한 후 육계 추출물을 10, 50, 100, 200 pg/mL 농도로 처리 하여 18시간 배양하고, 배양액을 시료로 사용하였다. Goat antirabbit IgG가 부착되어 있는 96 well plate에 cGMP 표준액 또는 시료를 가한 후, alkaline phosphatase conjugate와 rabbit anti-cGMPS 각각 50 pL씩 가하고 실온에서 2시간 반응시킨 후 항체와 결합하지 않은 cGMP 혹은 conjugate를 제거하였다. 항원-항체 복합체에 p-nitrophenyl phosphate가 함유된 substrate 용액을 가하여 실온에서 30분간 반응시키고, trisodium phosphate 묭액으로 발색반응을 정지시킨 후 405 nm에서 흡광도를 즉정하였다.
- HT-29 세포에 육계 추출물을 10 pg/m止에서 200 pg/mL 까지 농도별로 처리하고 6, 12, 24, 72시간동안 배양한 후, MTT 즉정 방법으로 세포생존률을 관찰하였다. 6시간 처 리 군의 경우 세포 생존률이 10, 50, 100, 200 pg/inL의 농도에서 각각 대조군의 99.
- 대조군(438.03 ±2.3 pM)과 비교하여 보면 육계 추출물은 10, 50, 100, 200 pg/mL의 농도에서 각각 10.04%(394.7±8.81 pg/mL), 15% (372.3 + 4.21 pg/mL), 29.5%(308.6±6.14 pg/mL), 50.5%(216.9 + 9.75 pg/mL)로 유의하게 cGMP 생성을 저해하였다 (Fig. 5).
- 따라서 HT-29 세포에 육계추출물을 10 pg/mL에서 200 pg/inL까지 농도별로 처 리하고 18시간동안 배양한 후, PGE2 생성량을 관찰하였다. 대조군(254.
- 96 well plate에 세포를 분주하여 24시간 배 양한 후 육계 추출물을 10, 50, 100, 200 pg/mL 농도로 처리 하고 12, 24, 48, 72시간 배양하였다. 배양완료 후 0.1% MTT 용액을 넣어 37℃, 3시간동안 배양한 다음 상증액을 제거하고 formazan 침 전물에 DMSO를 가하여 15분간 실온에서 shaking 한 후 570 nm의 파장에서 ELISA reader로 흡광도를 즉정하여 세포생존률을 계산하였다.
- 거상세포인 CCD-LL2CcN릐 경우. 세포 분열시간을 고려해 세포와 차별하셕 1일, $일 6일 후 MTT 측거을 실시하였다. 그 철과 윽제 추专을 200 叩 T릐 농도로 6일 처리군에서 세포생존을이 태조군릐 88.
- 항원-항체 복합체에 발색시약을 가하여 실온에서 30분간 발색시킨 후 405 nin에서 흡광도를 즉정하였다. 시료의 PGE2와 첨가된 PGE2-peroxidase conjugate와의 경 쟁반응으로 흡광도 변화와 농도와의 관계를 나타내는 표준 검량선을 이용하여 각 세포배양액에 함유된 PGE2의 함량을 계산하였다.
- 항원-항체 복합체에 p-nitrophenyl phosphate가 함유된 substrate 용액을 가하여 실온에서 30분간 반응시키고, trisodium phosphate 묭액으로 발색반응을 정지시킨 후 405 nm에서 흡광도를 즉정하였다. 시료의 cGMP와 첨가된 cGMP-alkaline phosphatase conjugate와의 경 쟁반응으로 흡광도 변화와 농도와의 관계를 나타내는 표준 검량선을 이용하여각 세포배양액에 함유된 cGMP의 함량을 계산하였다.
- 육계 추출물에 의하여 대장암 세포의 cGMP 생성량이 변화하는지 알아보기 위하여 HT-29 세포에 육계 추출물을 10 pg/mL에서 200 pg/m止까지 농도별로 처리하고 18시간 동안 배양한 후, cGMP 생성량을 관찰하였다. 대조군(438.
- 육계 추출물의 대장암 세포에 미치는 영향을 HT-29 인체결장암 세포주를 이용하여 조사하였다. 육계 추출물은 대장정 상세 포인 CCD-112CoN의 성장에는 크게 영향을 미치지 않았으나, 대장암 세포인 HT-29의 성장은 농도, 시간에 의존적으로 크게 억제하였고, 대장암의 진행 과정에서 매우 중요한 COX-2 mRNA 발현량 및 PGE2 생성, cGMP 생성을 농도 의존적으로 억제하였다.
- 이와 같은 육계 추출물에 의한 HT-29 세포 생존률의 감소 현상이 단순히 육계추출물의 독성에 의한 세포 손상 때문인지 조사하기 위하여 정상 대장세포인 CCDTJNCoN 세포에 육계 추출물을 각 농도별로 처리하고, MTT 방법으로 세포생존을을 측거하였다. 거상세포인 CCD-LL2CcN릐 경우.
대상 데이터
- 주었다. 대장 정상세포인 CCD-112CoN(CRL 1541)은 American type culture collection(ATCC, Rockvile, MD, USA)에서 구입하였으며, EMEM 배지에 10% FBS, pen-icillin-streptoinycin을 첨가하여 사용하였다. 세포배양은 모두 37℃ CO2 incubator(5%)에서 실시하였다.
- 본 연구에 사용된 대장암 HT-29 세포주(KCLB 30038)는 Korean cell line bank(Seoul, Korea)에서 구입하여 10% FBS가 포함된 RPMU640 배지에 penicillin-streptomycin을 첨가하여 사용하였으며, 약 48시간 주기로 배양액을 교체하여 주었다. 대장 정상세포인 CCD-112CoN(CRL 1541)은 American type culture collection(ATCC, Rockvile, MD, USA)에서 구입하였으며, EMEM 배지에 10% FBS, pen-icillin-streptoinycin을 첨가하여 사용하였다.
- 본 연구에 사용된 육계는 대영제약에서 국내산을 구입하여 시료로 사용하였고, 육계 50 g에 70% EtOH 100 m 止를 첨가하여 12시간동안 침지 추출하였고, 추출액을 여과한 후 여과액을 감압농축하고, 동결건조하여 분말을 얻었고, 이를 200 mg/mL 농도로 DMSO에 녹인 후 실험에 사용하였다.
데이터처리
- 본 연구에서 얻은 결과는 mean土SD로 표시하였으며, 대조군과 육계추출물 사이의 유의성은 paired Student's lest를 이용하여 p<0.05, ^<0.01, 心p<0.001인 경우 유의성을 인정하였다.
이론/모형
- 세포 내 염증성 cytokine들로 유발된 C0XT에 기인한 PGE2의 농도변화를 assay kit(Cayman chemical, USA)를사용하여 enzyme-linked immuno absorbent assay(ELISA) 방법으로 제조사의 방법에 따라 정량하였다. 48 weU plate에 세포를 분주하여 24시간 배 양한 후 육계 추출물을 10, 50, 100, 200 pg/mL 농도로 처리 하여 18시간 배 양하고, 배 양액을 시 료로 사용하였다.
- 세포배양액으로 분비된 cGMP의 농도변화를 ELISA kit (R&D systems, USA)를 사용하여 제조사의 방법에 따라 정량하였다. 48 weU plate에 세포를 분주하여 24시간 배양한 후 육계 추출물을 10, 50, 100, 200 pg/mL 농도로 처리 하여 18시간 배양하고, 배양액을 시료로 사용하였다.
- 세포의 RNA를 easy-spin RNA extraction kit(Intron biotechnology, Korea)를 사용하여 제조사의 방법에 따라 분리하였다. 즉, 세포를 PBS로 세척한 후 lysis buffer에 묭해하고, chloroform을 가한 후 13, 000 rpnr게서 10분동안 원심분리하여 RNA가 있는 상증액을 얻고, 이를 RNA-binding column에 통과시켰다.
- 세포의 증식률은 Mosmann(22)의 방법에 의하여 즉정하였다. 96 well plate에 세포를 분주하여 24시간 배 양한 후 육계 추출물을 10, 50, 100, 200 pg/mL 농도로 처리 하고 12, 24, 48, 72시간 배양하였다.
성능/효과
- 즉정 방법으로 세포생존률을 관찰하였다. 6시간 처 리 군의 경우 세포 생존률이 10, 50, 100, 200 pg/inL의 농도에서 각각 대조군의 99.7, 99.9, 97.1, 97.5%로 저해효과를 보이지 않았으나, 12, 24, 72시간 처리 군의 경우에는 시간, 농도에 의존적으로 HT-29 세포의 생존률 억제효과를 나타내었다 (Fig. 1).
- 세포주를 이용하여 조사하였다. 육계 추출물은 대장정 상세 포인 CCD-112CoN의 성장에는 크게 영향을 미치지 않았으나, 대장암 세포인 HT-29의 성장은 농도, 시간에 의존적으로 크게 억제하였고, 대장암의 진행 과정에서 매우 중요한 COX-2 mRNA 발현량 및 PGE2 생성, cGMP 생성을 농도 의존적으로 억제하였다. 이상의 결과에서 육계 추출물은 정상세포에는 독성 없이 대장암 세포의 C0X-2 및 PGE2, cGMP 생성을 억제함으로써 결과적으로 대장암 세포의 성장을 감소시킨 것으로 판단된다.
- 육계 추출물은 대장정 상세 포인 CCD-112CoN의 성장에는 크게 영향을 미치지 않았으나, 대장암 세포인 HT-29의 성장은 농도, 시간에 의존적으로 크게 억제하였고, 대장암의 진행 과정에서 매우 중요한 COX-2 mRNA 발현량 및 PGE2 생성, cGMP 생성을 농도 의존적으로 억제하였다. 이상의 결과에서 육계 추출물은 정상세포에는 독성 없이 대장암 세포의 C0X-2 및 PGE2, cGMP 생성을 억제함으로써 결과적으로 대장암 세포의 성장을 감소시킨 것으로 판단된다. 따라서 육계는 부작용이 없는 대장암 예방 건강 보조식품으로서 개발 가능성이 있으며, 암세포 사멸에 대한 더욱 정확한 작묭기전의 규명과 활성 성분의 분리 및 정제, 응묭법 등의 연구가 필요할 것으로 사료된다.
- 성가을억거! 할 수 丸기 패분에 COK-2 유 전가릐 발현 양상은 태가압릐 성가에 애우 昔요한 요소인 겄으로 보고되어 丸다(20. 따라서 윽제 추专을에 릐한 8X・2 유전가릐 발현 양상을왇아보기 위해 HT-29 세 포에 윽졔 추专을을 L0 叩mL에 서 200 叩T屏기 농도별로 처 리하고 24시 간동안 배양한 후 RT-PCR을 실시하역 윽제 추专을 농도의 증가에 따라 세포 내 8*2mPNA 발현량이 감소하였을을 확인하였다叫 S).
후속연구
- 이상의 결과에서 육계 추출물은 정상세포에는 독성 없이 대장암 세포의 C0X-2 및 PGE2, cGMP 생성을 억제함으로써 결과적으로 대장암 세포의 성장을 감소시킨 것으로 판단된다. 따라서 육계는 부작용이 없는 대장암 예방 건강 보조식품으로서 개발 가능성이 있으며, 암세포 사멸에 대한 더욱 정확한 작묭기전의 규명과 활성 성분의 분리 및 정제, 응묭법 등의 연구가 필요할 것으로 사료된다.
- 위 결과에서 육계 추출물은 HT-29 세포의 COX-2 mRNA 발현량과 PGE2 생성 량을 감소시킴으로써, 결과적으로 HT-29 세포의 성장을 억제한 것으로 사료되며, 세포사멸 기전에 대한 연구가 더욱 필요할 것으로 사료된다.
- Nitric oxide(NO)에 의한 Fe-nitrosyl complex는 cGMP 합성 을 촉진시 키고, 따라서 cGMP에 의존적 인 protein kinase C(PKC)를 활성 화시 키게 되는데, PKC가 활성화, 즉, phosphorylation되면 chloride의 유출, sodium의 유실로 인한 이온 불균형, potassium 불균형 등으로 인하여 대장내에서 배변 조절능력이 손실되어 결국 설사로 이어지게 된다는 연구 결과들이 있다(36, 37). 위 결과에서 육계 추출물은 HT-29 세포의 PGE2 생성과 cGMP 생성을 억제하였고, 이들 억제기전이 서로 연관되어있는지는 PGE2 및 cGMP/iNOS inhibitor 또는 overexpression, knockdown 등의 기법을 이용한 연구가 더욱 필요할 것으로 사료된다.
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