보라우무 메탄올추출물의 HT-29 대장암세포 증식 억제 효과 Inhibitory Effect of the Methanolic Extract of Symphyocladia latiuscula on the Growth of HT-29 Human Colon Cancer Cells원문보기
해조류는 다양한 생리 활성을 나타내는 성분들을 함유하고 있어 항산화효과 등 다양한 생리활성 효과를 나타내는 것으로 보고되고 있다. 본 연구에서는 식용 가능한 28종의 해조류 메탄올추출물 중 보라우무 메탄올추출물이 인간의 대장에서 유래한 암세포인 HT-29세포의 세포증식을 억제함을 밝혔고, 가장 강한 HT-29 세포 증식 억제 효과를 나타낸 보라우무 메탄올추출물의 대장암세포 증식억제 기전을 밝히고자 하였다. 보라우무 메탄올추출물을 HT-29 세포 배양액에 여러 농도$(0{\sim}20{\mu}g/mL)$로 첨가하여 세포를 배양한 경우 보라우무 메탄올추출물 처리 농도가 증가할수록 세포증식이 현저히 감소하였고, apoptotic cell수는 현저히 증가하였다. Apoptosis의 주요한 조절인자인 Bcl-2family 단백질 중 Bcl-2는 보라우무 메탄올추출물에 의해 변화가 없었고 Bax는 고농도에서만 소폭 감소하였다. 반면, t-Bid 단백질 수준은 보라우무 메탄올추출물의 처리에 의해 현저하게 증가하였다 Bcl-2 family Protein과 더불어 apoptosis의 조절에 주요한 역할을 하는 caspase 단백질의 경우 보라우무메탄올추출물 처리에 의해 cleaved caspase-8, -9, -7, -3 단백질 수준이 현저히 증가하였고, cleaved PARP 단백질수준도 현저히 증가하였다. 또한, caspase-8의 활성화를 유도하는 Fas 단백질 수준도 보라우무 메탄올추출물에 의해 현저하게 증가하였다. 이 결과로부터 보라우무 메탄올추출물은 caspase-8의 활성 증가에 의한 미토콘드리아 막 투과성 변화와 caspase-7/-3 활성의 증가를 통해 apoptosis를 유도함으로써 암세포의 증식을 억제한다는 결론을 내릴 수 있다. 본 연구는 보라우무를 항암효과를 지니는 기능성식품이나 항암제로 개발할 수 있는 가능성을 제시하고 있으며 향후 보라우무를 이용한 제품의 개발을 위해서는 유효성분의 동정 및 그 성분의 작용 기전에 대한 면밀한 추가 연구가 필요할 것으로 보인다.
해조류는 다양한 생리 활성을 나타내는 성분들을 함유하고 있어 항산화효과 등 다양한 생리활성 효과를 나타내는 것으로 보고되고 있다. 본 연구에서는 식용 가능한 28종의 해조류 메탄올추출물 중 보라우무 메탄올추출물이 인간의 대장에서 유래한 암세포인 HT-29세포의 세포증식을 억제함을 밝혔고, 가장 강한 HT-29 세포 증식 억제 효과를 나타낸 보라우무 메탄올추출물의 대장암세포 증식억제 기전을 밝히고자 하였다. 보라우무 메탄올추출물을 HT-29 세포 배양액에 여러 농도$(0{\sim}20{\mu}g/mL)$로 첨가하여 세포를 배양한 경우 보라우무 메탄올추출물 처리 농도가 증가할수록 세포증식이 현저히 감소하였고, apoptotic cell수는 현저히 증가하였다. Apoptosis의 주요한 조절인자인 Bcl-2 family 단백질 중 Bcl-2는 보라우무 메탄올추출물에 의해 변화가 없었고 Bax는 고농도에서만 소폭 감소하였다. 반면, t-Bid 단백질 수준은 보라우무 메탄올추출물의 처리에 의해 현저하게 증가하였다 Bcl-2 family Protein과 더불어 apoptosis의 조절에 주요한 역할을 하는 caspase 단백질의 경우 보라우무메탄올추출물 처리에 의해 cleaved caspase-8, -9, -7, -3 단백질 수준이 현저히 증가하였고, cleaved PARP 단백질수준도 현저히 증가하였다. 또한, caspase-8의 활성화를 유도하는 Fas 단백질 수준도 보라우무 메탄올추출물에 의해 현저하게 증가하였다. 이 결과로부터 보라우무 메탄올추출물은 caspase-8의 활성 증가에 의한 미토콘드리아 막 투과성 변화와 caspase-7/-3 활성의 증가를 통해 apoptosis를 유도함으로써 암세포의 증식을 억제한다는 결론을 내릴 수 있다. 본 연구는 보라우무를 항암효과를 지니는 기능성식품이나 항암제로 개발할 수 있는 가능성을 제시하고 있으며 향후 보라우무를 이용한 제품의 개발을 위해서는 유효성분의 동정 및 그 성분의 작용 기전에 대한 면밀한 추가 연구가 필요할 것으로 보인다.
In the present study, twenty eight marine algae species were evaluated for their antiproliferative effect on HT-29 human colon cancer cells. Among these, the methanolic extract of Symphyocladia latiuscula (SL Ex) showed the highest inhibitory activity on HT-29 cell growth. In this study, we examined...
In the present study, twenty eight marine algae species were evaluated for their antiproliferative effect on HT-29 human colon cancer cells. Among these, the methanolic extract of Symphyocladia latiuscula (SL Ex) showed the highest inhibitory activity on HT-29 cell growth. In this study, we examined the mechanism by which SL Ex inhibited the HT-29 cell growth. Cells were cultured with various concentrations of $(0{\sim}20{\mu}g/mL)$ SL Ex. The SL Ex substantially decreased the viable cell numbers and induced apoptosis of HT-29 cells in a dose-dependent manner Western blot analyses of total cell lysates revealed that SL Ex increased the levels of cleaved caspase-8, -9, -7, and -3, and poly (ADP-ribose) polymerase in HT-29 cells. In addition, SL Ex increased truncated Bid levels but moderately decreased Bax levels at only $20{\mu}g/mL$. Furthermore, SL Ex did not affect Bcl-2 protein levels but increased the levels of Fas in HT-29 cells. The present results indicate that SL Ex inhibits cell growth via inducing apoptosis in human colon cancer cells. The mechanism of apoptosis induction by SL Ex involves caspase-8 activation leading to changes in mitochondrial events and subsequent activation of the caspase-7/caspase-3 cascade. Our finding may lead to the development of new therapeutic strategies for the treatment of colon cancer.
In the present study, twenty eight marine algae species were evaluated for their antiproliferative effect on HT-29 human colon cancer cells. Among these, the methanolic extract of Symphyocladia latiuscula (SL Ex) showed the highest inhibitory activity on HT-29 cell growth. In this study, we examined the mechanism by which SL Ex inhibited the HT-29 cell growth. Cells were cultured with various concentrations of $(0{\sim}20{\mu}g/mL)$ SL Ex. The SL Ex substantially decreased the viable cell numbers and induced apoptosis of HT-29 cells in a dose-dependent manner Western blot analyses of total cell lysates revealed that SL Ex increased the levels of cleaved caspase-8, -9, -7, and -3, and poly (ADP-ribose) polymerase in HT-29 cells. In addition, SL Ex increased truncated Bid levels but moderately decreased Bax levels at only $20{\mu}g/mL$. Furthermore, SL Ex did not affect Bcl-2 protein levels but increased the levels of Fas in HT-29 cells. The present results indicate that SL Ex inhibits cell growth via inducing apoptosis in human colon cancer cells. The mechanism of apoptosis induction by SL Ex involves caspase-8 activation leading to changes in mitochondrial events and subsequent activation of the caspase-7/caspase-3 cascade. Our finding may lead to the development of new therapeutic strategies for the treatment of colon cancer.
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문제 정의
세포질에 있던 t-Bid는 미토콘드리아로 이동하여 Bax와 결합하고, Bax의 구조적 변화를 초래하여 cytochrome c의 세포질로의 방출을 유도한다(29). HT-29 세포에서 보라우무 메탄올 추출물에 의해 초래된 apoptosis가 미토콘드리아 막 투과성 변화에기 인하는지를 알아보기 위해 보라우무 메탄올추출물에 의한 Bcl-2 family 단백질 수준의 변화를 조사하였다. 대표적인 anti-apoptotic Bcl~2 family 단백질인 Bcl-2 단백질 수준은 보라우무 메탄올추출물 처리에 의해 변화하지 않았고, pro-apoptotic Bcl-2 family 단백질인 Bax 단백질 수준은보라우무 메탄올추출물을 낮은 농도(0~10 ug/mL)로 첨가한 경우 변화하지 않았으나, 20 pg/mL 농도로 처리한 경우 유의 적으로 감소하였다.
PARP는 caspase-3의 주요한 표적 단백질 중의 하나로(36), caspase-3에 의해 쪼개어져 불활성화 되면 세포의 분해가 촉진되므로, cleaved PARP 수준 증가는 세포가 apoptosis 되고 있음을 나타낸다 (37). 보라우무 메탄올추출물에 의해 cleaved caspase-3 단백질 수준이 현저히 증가하였기 때문에 보라우무 메탄올 추출물이 PARP를 절단하여 apoptosis를 유도하는지를 알아보기 위해 보라우무 메탄올주줄물이 cleaved PARP 수준에 미치는 영향을 조사하였다. 보라우무 메탄올추출물의 처리농도가 증가할수록 cleaved PARP 단백질 수준은 현저히 증가하였으며 , 추출물을 처리 하지 않은 대조군에 비해 20 pg/ SL Ex (ug/mL) 단백질 수준이 7.
보라우무 메탄올추출물이 HT-29 세포의 증식을 현저히 억제하였으므로(Fig. 1) 보라우무 메탄올 추출물이 HT-29 세포의 apoptosis에 미치는 영향을 조사하였다.
7에 나타내었다. 본 연구는 보라우무를 항암효과를 가지고 있는 기능성식품이나 항암제로 개발할 수 있는 가능성을 제시한다. 그러나 보라우무를 이용한 제품을 개발하기 위해서는 향후 보라우무 메탄올 추출물에서 항암효과를 나타내는 성분을 동정하고, 그 성분의 작용기전에 대한 면밀한 연구 수행이 필요할 것으로 사료된다.
본 연구에서는 인간에서 유래한 대장암세포인 HT-29 세포를 사용하여 여러 종류의 식용 가능한 해조류 메탄올 추출물의 암세포 증식 억제 효과를 비교하고, 그 중 HT-29 세포의 증식을 현저하게 억제한 보라우무 메탄올추출물의 암세포 증식 억제 기전을 조사하기 위해 HT-29 세포의 apoptosis에 미치는 영향을 조사하였다.
활성화된caspase-8 또는 caspase-9은 effector caspase인 caspase-7 또는 caspase-3을 활성화하고, 활성화된 effector caspasee apoptosis의 형 태학적 특징 에 관여하는 lamin A, a-fodrin, DNA fragmentation factor(DFF), PARP 등의 단백질을 분해하여 apoptosis# 유도한다(31-34). 여러 연구에서 다양한 항암 성 분은 caspase의 활성을 조절하여 암세포의 apoptosis를 유도한다고 보고된(20-22) 바 있어 본 연구에서는 보라 우무 메탄올추출물이 caspase의 활성에 미치는 영향을 조사하기 위해 caspase의 활성화된 형태인 cleaved caspase들의 단백질 수준을 조사하였다. Initiator caspase인 caspase-8과 caspase-9의 활성화된 cleaved form 단백질 수준이 보라우무 메탄올추출물 처리에 의해 증가하였다.
해조류가 항암제 연구의 좋은 소재가 될 수 있으므로, 본연구에서는 우리나라에서 식용되고 있는 해조류의 메탄올 추출물을 제조하여 암세포 증식 억제 효과를 탐색하였다. 그 결과 28종의 해조류 메탄올추출물 중 보라우무(Sy冲/woc/adia latiuscula) 메탄올추출물이 인간의 대장에서 유래한 암세포인 HT-29 세포의 증식을 가장 현저히 억제함을 밝혔다 (Table 1).
제안 방법
세포질로 방출된 cytochrome c는 apoptosis protease-activating factor-1 (Apaf-l)ef- 함께 caspase-9을 활성화하여 apoptosis# 유도한다(25). HT-29 세포에서 보라 우무 메탄올추출물에 의해 유도된 apoptosis가 cell death receptor의 활성화에 의해 매개되는 외적 경로에 의한 것인지를 조사하기 위해 Fas와 Fas ligand(FasL)의 단백질 수준이 보라우무 메탄올추출물에 의해 변화하는 지를 조사하였다. 니T-29 세포에서 세포막에 결합되어 있는 FasL를 본연구에서 사용한 방법으로 검출하지 못했으나 분자량 43 kDa인 Fas 단백질은 검출할 수 있었다.
그러므로 apoptosis를 유도하는 각 성분의 apoptosis 유도 기전 연구는 apoptosis 유도를 통해 항암활성을 나타내는 항암제 개발에 매우 중요하다. HT-29 세포에서 보라우무 메탄올추출물의 apoptosis 유도 경로를 조사하기 위해 보라우무 메탄올추출물을 세포 배양액에 첨가하여 48시간 동안 세포를 배양한 후 세포를 수거하고 cell lysate를 만들어 Western blot을 실시하여 apoptosis 조절 단백질의 변화를 조사하였다.
Cell lysate(50 iig 또는 100 yg protein)를 4 — 20% 또는 10 — 20% sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE)로 분리한 후 polyvinylidene difluoride membrane(Millipore, Bedford, MA, USA)에 이동 시 켰다. Membranee 5% skim milk-TBST(20 mM Tris ■HCl, pH 7, 5, 150 mM NaCl, 0.1% Tween 20)에서 1시간 동안 blocking하고, anti-bcl-2 항체(l:1000 희석), anti-bax 항체 (l:1000 희석), anti-Fas 항체 (L1000 희석), anti-Bid 항체(l:1000 희석), anti-cleaved caspase-3 항체(l:1000 희석), anti-cleaved caspase-8 항체(1:100。희석), anti-cleaved caspase-9 항체(l:1000, 희석), anti-cleaved PARP 항체 (l:1000 희석), anti-P-actin 항체(l:2000 희석) 등 측정하고자 하는 항체를 각각 첨가하여 4℃에서 16시간 또는 상온에서 1시간 동안 교반하였다. 그 후 horse radish peroxidaselinked anti—rabbth IgG 또는 horse radish peroxidase-linked anti-mouse IgG를 첨가하여 1시간 교반하였다.
가하여 세포를 48시간 배양한 후 MTT assay 방법 (16) 으로살아있는 세포수를 측정하였다. Table 1에서 나타난 것과 같이 잎파래, 톳, 곤포, 참모자반, 지충이, 보라우무 메탄올 추출물이 HT-29 세포의 증식을 억제하였으며, 그 증 보라 우무메탄올 추출물이 가장 강한 HT-29 세포 증식 억제 효과를 나타내었다.
각 protein band는 SuperSignale West Dura Extended Duration Substrate (Pierce)# 사용하여 enhanced chemiluminescence 방법으로 가시화하였다. 각 단백질 밴드의 강도는 Bioprofile Bio-1D applicationCVilber-Lourmat, Marine la Vallee, FranceX 사용하여 측정하였다.
1% Tween 20)에서 1시간 동안 blocking하고, anti-bcl-2 항체(l:1000 희석), anti-bax 항체 (l:1000 희석), anti-Fas 항체 (L1000 희석), anti-Bid 항체(l:1000 희석), anti-cleaved caspase-3 항체(l:1000 희석), anti-cleaved caspase-8 항체(1:100。희석), anti-cleaved caspase-9 항체(l:1000, 희석), anti-cleaved PARP 항체 (l:1000 희석), anti-P-actin 항체(l:2000 희석) 등 측정하고자 하는 항체를 각각 첨가하여 4℃에서 16시간 또는 상온에서 1시간 동안 교반하였다. 그 후 horse radish peroxidaselinked anti—rabbth IgG 또는 horse radish peroxidase-linked anti-mouse IgG를 첨가하여 1시간 교반하였다. 각 protein band는 SuperSignale West Dura Extended Duration Substrate (Pierce)# 사용하여 enhanced chemiluminescence 방법으로 가시화하였다.
농도를 달리하여 보라우무 메탄올추출물을 처리하여 세포를 48시간 배양한 후 Annexin V로 세포를 염색하여 flow cytometry 방법으로 apoptotic cell 수를 정 량한 결과를 Fig. 2에 나타내었다. 보라우무 메탄올추출물 처리 농도가 증가할수록 살아있는 세포수는 감소하였고, early apoptotic cell 수는 현저히 증가하였다(Fig.
개발의 좋은 소재라고 할 수 있다. 독성과 부작용이 없는 안전한 항암제 소재를 탐색하기 위해 식용 가능한 28종의 해조류 메탄올추출물을 제조하여 대장암세포인 HT-29 세포의 증식에 미치는 영향을 조사하였다. HT-29 세포 배양액에 20 pg/mL 농도로 해조류 메탄올추출물을 첨
메 탄올추출물을 처리 하였다. 보라우무 메 탄 올 추출물을 첨가하여 48시간이 경 과한 후 trypsin-EDTA로 처리하여 세포를 수집하였다. 세포에 phycoerythrin(PE)-conjugated Annexin V와 7 -amino-actinomycin D(BD Pharmingen, Franklin Lakes, NJ, USA)를 넣어 15분 동안 암실에서 염색한 후 Annexin V 또는 7 -amino-actinomycin D에 의해 염색된 세포를 FACScan™(Becton Dickinson, Franklin Lake, NJ, USA)을 사용하여 flow cytometry 방법에 의해 측정하였다.
Table 1에서 나타난 것과 같이 잎파래, 톳, 곤포, 참모자반, 지충이, 보라우무 메탄올 추출물이 HT-29 세포의 증식을 억제하였으며, 그 증 보라 우무메탄올 추출물이 가장 강한 HT-29 세포 증식 억제 효과를 나타내었다. 보라우무 메탄올추출물의 HT-29 세포 증식 에미치는 영향을 자세히 조사하기 위해 보라우무 메탄올 추출물의 농도를 0, 5, 10 또는 20 pg/mL 농도로 달리하여 세포배양액에 첨가하고 세포를 배양한 후 살아있는 세포수를 측정하였다. 보라우무 메탄올추출물 처리 농도가 증가할수록 유의적으로 세포 증식이 감소하였다(Fig.
배양하였다. 세포가 배양 접시의 80% 정도 차면 phos-phate-buffered saline(PBS, pH 7.4)으로 세포의 단층을 씻어낸 후 0.25% trypsin-2.65 mM EDTA로 처리하여 계대 배양하였고 배지는 2일마다 교환하였다.
24시간이 지난 후 1% FBS가 포함되어 있는 배지로 교환하여 혈청에 들어있는 여러 성분들의 효과를 최소화하였다. 세포를 1% FBS가 포함되어 있는 배지에서 24시간 배양한 후 1% FBS가 포함되어있는 배지에 20 ug/mL 해조류 메탄올추출물을 첨가한 배지로 교환하여 48시간 세포를 배양하거나, 또는 여러 농도의 보라 우무 메탄올추출물(0, 5, 10, 20 ug/mL)을 첨가한 배지로 교환하여 세포를 24시간, 48시간, 72시간 세포를 배양한 후 MTT assay 방법(16)을 이용하여 살아있는 세포수를 측정하였다.
분쇄시료 1 kg에 5 L의 메탄올을 가하여 환류조건하에서 70℃의 조건으로 3시간 추출하였다. 추출물을 여과지로 여과한 다음 감압농축기로 감압 농축한 후, 동결 건조하여 해조류 메탄올 추출물을 얻었다.
대상 데이터
Bcl-2, Bax, Fas 항체는 Santa Cruz Biotechnology Inc.(Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하였고, cleaved caspase-3, cleaved caspase-8, cleaved caspase-9, cleaved poly (ADP-ribose) pol-ymerase(PARP), Bid 에 대한 항체는 Cell Signaling (Beverly, MA, USA)에서 구입하여 사용하였다. Horse radish perox-idase-linked anti-rabbit IgG와 horse radish peroxidaselinked anti-mouse IgG는 Amersham(Bukinghamshire, England)에서 구입하여 사용하였다.
세포배양에 사용한 Dulbecco's Modified Ease's Medium: Nutrient Mixture Ham's F12(DMEM/F12)는 Gibco/BRL(Gaitherburg, MD, USA)에서 구입하였다. Fetal bovine serum(FBS), penicillin - streptomycin 등은 Cambrex Bio Technology(Walkersville, MD, USA) 에서 구입하였다. Bovine serum albumin(BSA), 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide(MTT), anti-P-actin 항체와 본 연구에 사용한 일반적인 시 약은 Sigma Chemical Co.
(Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하였고, cleaved caspase-3, cleaved caspase-8, cleaved caspase-9, cleaved poly (ADP-ribose) pol-ymerase(PARP), Bid 에 대한 항체는 Cell Signaling (Beverly, MA, USA)에서 구입하여 사용하였다. Horse radish perox-idase-linked anti-rabbit IgG와 horse radish peroxidaselinked anti-mouse IgG는 Amersham(Bukinghamshire, England)에서 구입하여 사용하였다.
세포배양에 사용한 Dulbecco's Modified Ease's Medium: Nutrient Mixture Ham's F12(DMEM/F12)는 Gibco/BRL(Gaitherburg, MD, USA)에서 구입하였다. Fetal bovine serum(FBS), penicillin - streptomycin 등은 Cambrex Bio Technology(Walkersville, MD, USA) 에서 구입하였다.
인간의 대장에서 유래한 암세포인 HT-29 세포는 American Type Culture Collection(Rockville, MD, USA)에서 구입 하였다. 세포배양에 사용한 Dulbecco's Modified Ease's Medium: Nutrient Mixture Ham's F12(DMEM/F12)는 Gibco/BRL(Gaitherburg, MD, USA)에서 구입하였다.
데이터처리
수집된 결과는 S AS (Statistical Analysis System) PC 프로그램을이용하여 통계 분석하였으며, 각 실험군들의 평균치간의 유의성은 a=0.05 수준에서 analysis of variance와 Duncan's multiple range test에 의해 분석하였다.
이론/모형
그 후 horse radish peroxidaselinked anti—rabbth IgG 또는 horse radish peroxidase-linked anti-mouse IgG를 첨가하여 1시간 교반하였다. 각 protein band는 SuperSignale West Dura Extended Duration Substrate (Pierce)# 사용하여 enhanced chemiluminescence 방법으로 가시화하였다. 각 단백질 밴드의 강도는 Bioprofile Bio-1D applicationCVilber-Lourmat, Marine la Vallee, FranceX 사용하여 측정하였다.
보라우무 메 탄 올 추출물을 첨가하여 48시간이 경 과한 후 trypsin-EDTA로 처리하여 세포를 수집하였다. 세포에 phycoerythrin(PE)-conjugated Annexin V와 7 -amino-actinomycin D(BD Pharmingen, Franklin Lakes, NJ, USA)를 넣어 15분 동안 암실에서 염색한 후 Annexin V 또는 7 -amino-actinomycin D에 의해 염색된 세포를 FACScan™(Becton Dickinson, Franklin Lake, NJ, USA)을 사용하여 flow cytometry 방법에 의해 측정하였다.
성능/효과
24 well plate에 분주하였다. 24시간이 지난 후 1% FBS가 포함되어 있는 배지로 교환하여 혈청에 들어있는 여러 성분들의 효과를 최소화하였다. 세포를 1% FBS가 포함되어 있는 배지에서 24시간 배양한 후 1% FBS가 포함되어있는 배지에 20 ug/mL 해조류 메탄올추출물을 첨가한 배지로 교환하여 48시간 세포를 배양하거나, 또는 여러 농도의 보라 우무 메탄올추출물(0, 5, 10, 20 ug/mL)을 첨가한 배지로 교환하여 세포를 24시간, 48시간, 72시간 세포를 배양한 후 MTT assay 방법(16)을 이용하여 살아있는 세포수를 측정하였다.
대표적인 anti-apoptotic Bcl~2 family 단백질인 Bcl-2 단백질 수준은 보라우무 메탄올추출물 처리에 의해 변화하지 않았고, pro-apoptotic Bcl-2 family 단백질인 Bax 단백질 수준은보라우무 메탄올추출물을 낮은 농도(0~10 ug/mL)로 첨가한 경우 변화하지 않았으나, 20 pg/mL 농도로 처리한 경우 유의 적으로 감소하였다. BH3 only 단백질 인 Bid 단백질 수준은 보라우무 메탄올추출물 처리에 의해 변화하지 않았으나, Bid의 분절화된 형태인 t-Bid 단백질 수준이 보라 우무메탄올 추출물에 의해 유의적으로 증가하여 20 μg/mL 농도로 보라우무 메탄올추출물을 처리한 경우 추출물을 처리하지 않은 군에 비해 3.1 배 증가하였다(Fig. 4). 이 결과는 보라 우무 메탄올추출물이 t-Bid의 단백질 수준을 증가시켜 미토콘드리아의 막 투과성 증가를 초래하여 apoptosis를 유도했음을 제시한다.
Palmaria palmata, 다시 마과 해조류인 Macrocystis integrifolia, Laminaria setchellii, Nereocystis leutkeana 등의 식용 해조류는 자궁경부암 세포주인 HeLa 세포의 증식을 억 제하였고(3), Sargassum sten~ ophyHuma에서 추출된 다당류인 SargA는 흑색소세포종인 B16F10 세포의 증식과 암전이 억제 효과를 나타내었다(6). Ecklonia azua(감태)에 함유되어 있는 다당류와 폴리페놀 성분이 쥐에서 유래한 대장암세포인 CT-26 세포의 증식을 억제하였으며(5), Ecklonia caua(감태)의 에탄올 추출물은 암전이 에 관련하는 matrix metalloproteinase(MMP)-2, -9 의 활성을 현저히 억제하였다(7, B). 여러 연구결과를 통해 해조류가 암세포의 증식을 억제함이 입증되어, 해조류는 항암제 연구의 좋은 소재로 관심이 증가되고 있다.
또한 해조류의 암세포 증식 억제 효과는 다양한 연구에 의해 알려 지고 있다. Palmaria palmata, 다시 마과 해조류인 Macrocystis integrifolia, Laminaria setchellii, Nereocystis leutkeana 등의 식용 해조류는 자궁경부암 세포주인 HeLa 세포의 증식을 억 제하였고(3), Sargassum sten~ ophyHuma에서 추출된 다당류인 SargA는 흑색소세포종인 B16F10 세포의 증식과 암전이 억제 효과를 나타내었다(6). Ecklonia azua(감태)에 함유되어 있는 다당류와 폴리페놀 성분이 쥐에서 유래한 대장암세포인 CT-26 세포의 증식을 억제하였으며(5), Ecklonia caua(감태)의 에탄올 추출물은 암전이 에 관련하는 matrix metalloproteinase(MMP)-2, -9 의 활성을 현저히 억제하였다(7, B).
세포수를 측정하였다. Table 1에서 나타난 것과 같이 잎파래, 톳, 곤포, 참모자반, 지충이, 보라우무 메탄올 추출물이 HT-29 세포의 증식을 억제하였으며, 그 증 보라 우무메탄올 추출물이 가장 강한 HT-29 세포 증식 억제 효과를 나타내었다. 보라우무 메탄올추출물의 HT-29 세포 증식 에미치는 영향을 자세히 조사하기 위해 보라우무 메탄올 추출물의 농도를 0, 5, 10 또는 20 pg/mL 농도로 달리하여 세포배양액에 첨가하고 세포를 배양한 후 살아있는 세포수를 측정하였다.
제조하여 암세포 증식 억제 효과를 탐색하였다. 그 결과 28종의 해조류 메탄올추출물 중 보라우무(Sy冲/woc/adia latiuscula) 메탄올추출물이 인간의 대장에서 유래한 암세포인 HT-29 세포의 증식을 가장 현저히 억제함을 밝혔다 (Table 1). 보라우무는 홍조식물 빨간검둥이과의 바닷말로 한국, 일본 등지에 주로 분포하며 우무가사리의 형태로 식용되고 있다.
HT-29 세포에서 보라 우무 메탄올추출물에 의해 유도된 apoptosis가 cell death receptor의 활성화에 의해 매개되는 외적 경로에 의한 것인지를 조사하기 위해 Fas와 Fas ligand(FasL)의 단백질 수준이 보라우무 메탄올추출물에 의해 변화하는 지를 조사하였다. 니T-29 세포에서 세포막에 결합되어 있는 FasL를 본연구에서 사용한 방법으로 검출하지 못했으나 분자량 43 kDa인 Fas 단백질은 검출할 수 있었다. 보라우무 메탄올 추출물에 의해 Fas 단백질 수준은 증가하였고, 추출물을 처리하지 않은 군에 비해 보라우무 메탄올추출물을 20 yg/mL 농도로 처리한 경우 1.
5). 또한 effector caspase인 cleaved caspase-7과 cleaved caspase-3 단백질 수준이 보라우무 메탄올추출물 처리에 의해 현저히 증가하였다(Fig. 5). 이 결과는 caspase 활성 증가가 보라우무 메탄올추출물에 의한 HT-29 세포의 apoptosis 에 중요 조절 인자임을 제시한다.
1). 보라우무 메탄올 추출물에 의한 세포 증식 감소는 추출물 처리 후 24시간부터 나타났으며 시간이 경과함에 따라 세포 증식 감소는 더욱 현저히 나타났다. Kim 등은 보라우무 메탄올추출물이 전립선암세포인 DU145 세포와 유방암세포인 MCF-7 세포의 증식을 억제하였으나 정상 섬유아세포인 CCD1108Sk 세포의 증식에는 영향을 미치지 않음을 보고하였다(17).
니T-29 세포에서 세포막에 결합되어 있는 FasL를 본연구에서 사용한 방법으로 검출하지 못했으나 분자량 43 kDa인 Fas 단백질은 검출할 수 있었다. 보라우무 메탄올 추출물에 의해 Fas 단백질 수준은 증가하였고, 추출물을 처리하지 않은 군에 비해 보라우무 메탄올추출물을 20 yg/mL 농도로 처리한 경우 1.9배 증가하였다(Fig. 3). 이 결과는 보라 우무 메 탄올추출물에 의한 apoptosis가 death receptor에 의한 외적 경로에 의해 시작됨을 제시한다.
2에 나타내었다. 보라우무 메탄올추출물 처리 농도가 증가할수록 살아있는 세포수는 감소하였고, early apoptotic cell 수는 현저히 증가하였다(Fig. 2). 이를 통해 보라우무 메탄올 추출물에 의한 암세포 증식 억제는 암세포의 apoptosis를 유도함으로써 이루어진다는 것을 알 수 있다.
보라우무 메탄올추출물의 HT-29 세포 증식 에미치는 영향을 자세히 조사하기 위해 보라우무 메탄올 추출물의 농도를 0, 5, 10 또는 20 pg/mL 농도로 달리하여 세포배양액에 첨가하고 세포를 배양한 후 살아있는 세포수를 측정하였다. 보라우무 메탄올추출물 처리 농도가 증가할수록 유의적으로 세포 증식이 감소하였다(Fig. 1). 보라우무 메탄올 추출물에 의한 세포 증식 감소는 추출물 처리 후 24시간부터 나타났으며 시간이 경과함에 따라 세포 증식 감소는 더욱 현저히 나타났다.
보라우무 메탄올추출물에 의해 cleaved caspase-3 단백질 수준이 현저히 증가하였기 때문에 보라우무 메탄올 추출물이 PARP를 절단하여 apoptosis를 유도하는지를 알아보기 위해 보라우무 메탄올주줄물이 cleaved PARP 수준에 미치는 영향을 조사하였다. 보라우무 메탄올추출물의 처리농도가 증가할수록 cleaved PARP 단백질 수준은 현저히 증가하였으며 , 추출물을 처리 하지 않은 대조군에 비해 20 pg/ SL Ex (ug/mL) 단백질 수준이 7.9배 증가하였다(Fig. 6).
5). 이 결과는 caspase 활성 증가가 보라우무 메탄올추출물에 의한 HT-29 세포의 apoptosis 에 중요 조절 인자임을 제시한다.
3). 이 결과는 보라 우무 메 탄올추출물에 의한 apoptosis가 death receptor에 의한 외적 경로에 의해 시작됨을 제시한다.
4). 이 결과는 보라 우무 메탄올추출물이 t-Bid의 단백질 수준을 증가시켜 미토콘드리아의 막 투과성 증가를 초래하여 apoptosis를 유도했음을 제시한다.
2). 이를 통해 보라우무 메탄올 추출물에 의한 암세포 증식 억제는 암세포의 apoptosis를 유도함으로써 이루어진다는 것을 알 수 있다. 암세포의 apoptosis 유도는 항암활성을 가지고 있는 성분들의 중요한 특징 중의 하나이며(19), 현재 이용되고 있는 많은 항암제가 암세포의 apoptosis를 유도함으로써 그 효과를 나타내는 것으로 알려지고 있匸只14, 15).
후속연구
본 연구는 보라우무를 항암효과를 가지고 있는 기능성식품이나 항암제로 개발할 수 있는 가능성을 제시한다. 그러나 보라우무를 이용한 제품을 개발하기 위해서는 향후 보라우무 메탄올 추출물에서 항암효과를 나타내는 성분을 동정하고, 그 성분의 작용기전에 대한 면밀한 연구 수행이 필요할 것으로 사료된다.
Kim 등은 보라우무 메탄올추출물이 전립선암세포인 DU145 세포와 유방암세포인 MCF-7 세포의 증식을 억제하였으나 정상 섬유아세포인 CCD1108Sk 세포의 증식에는 영향을 미치지 않음을 보고하였다(17). 이는 보라 우무 메탄올추출물이 독성과 부작용이 없는 안전한 항암제개발의 좋은 소재가 될 수 있음을 제시한다.
참고문헌 (37)
Yang JH. 2005. The effect of foot reflexology on nausea, vomiting and fatigue of breast cancer patients undergoing chemotherapy. J Korean Acad Nurs 35: 177-185
Kim HS, Kim GJ. 1998. Effect of the feeding Hijikia fusiforme (Harvey) Okamura on lipid composition of serum in dietary hyperlipidemic rats. J Korean Soc Food Sci Nutr 27: 718-723
Yuan YV, Walsh NA. 2006. Antioxidant and antiproliferative activities of extracts from a variety of edible seaweeds. Food Chem Toxicol 44: 1144-1150
Athukorala Y, Kim KN, Jeon YJ. 2006. Antiproliferative and antioxidant properties of an enzymatic hydrolysate from brown alga, Ecklonia cava. Food Chem Toxicol 44: 1065- 1074
Dias PF, Siqueira JM Jr, Vendruscolo LF, de Jesus Neiva T, Gagliardi AR, Maraschin M, Ribeiro-do-Valle RM. 2005. Antiangiogenic and antitumoral properties of a polysaccharide isolated from the seaweed Sargassum stenophyllum. Cancer Chemother Pharmacol 56: 436-446
Kim MM, Ta QV, Mendis E, Rajapakse N, Jung WK, Byun HG, Jeon YJ, Kim SK. 2006. Phlorotannins in Ecklonia cava extract inhibit matrix metalloproteinase activity. Life Sci 79: 1436-1443
Lim CW, Lee JS, Cho YJ. 2000. Structures and some properties of the antimicrobial compounds in the red alga, Symphyocladia latiuscula. J Korean Fish Soc 33: 280-287
Hengartner MO. 2000. The biochemistry of apoptosis. Nature 407: 770-777
Denizot F, Lang R. 1986. Rapid colorimetric assay for cell growth and survival modifications to the tetrazolium dye procedure giving improved sensitivity and reliability. J Immunol Methods 89: 271-277
Kim EJ, Lim SS, Shin MJ, Shin HK, Park JHY. 2006. Effect of Symphyocladia latiuscula extract on the growth of cancer cells. Abstract No P11-035 presented at 73rd Annual Meeting of Korean Society of Food Science & Technology. Jeju, Korea
Kim EJ, Lee YJ, Shin HK, Park JHY. 2006. A study on the mechanism by the aqueous extract of Inonotus obliquus induces apoptosis and inhibits proliferation in HT-29 human colon cancer cells. J Korean Soc Food Sci Nutr 35: 516-523
Kim EJ, Park SY, Shin HK, Kwon DY, Surh YJ, Park JHY. 2007. Activation of caspase-8 contributes to 3,3'-diindolymethane-induced apoptosis in colon cancer cells. J Nutr 137: 31-36
Jung JI, Lim SS, Choi HJ, Cho HJ, Shin HK, Kim EJ, Chung WY, Park KK, Park JHY. 2006. Isoliquiritigenin induces apoptosis by depolarizing mitochondrial membranes in prostate cancer cells. J Nutr Biochem 17: 689-696
Kim EJ, Lee YJ, Shin HK, Park JHY. 2005. Induction of apoptosis by the aqueous extract of Rubus coreanum in HT-29 human colon cancer cells. Nutrition 21: 1141-1148
Koesmeyer SJ, Shutter JR, Veis DJ, Merry DE, Oltvai ZN. 1993. Bcl-2/Bax: a rheostat that regulates an anti-oxidant pathway and cell death. Semin Cancer Biol 4: 327-332
Luo X, Budihardjo I, Zou H, Slaughter C, Wang X. 1998. Bid, a Bcl2 interacting protein, mediates cytochrome c release from mitochondria in response to activation of cell surface death receptors. Cell 94: 481-490
Nijhawan LP, Budihardjo D, Srinivasula I, Ahmad SM, Alnemri M, Wang X. 1997. Cytochrome c and dATP-dependent formation of Apaf-1/caspase-9 complex initiates an apoptotic protease cascade. Cell 91: 479-489
Nichoson DW, Ali A, Thornberry NA, Vaillancourt JP, Ding CK, Gallant M. 1995. Identification and inhibition of the ICE/CED-3 protease necessary for mammalian apoptosis. Nature 376: 37-43
Oliver FJ, de la Rubia G, Rolli V, Ruiz-Ruiz MC, de Murcia G, Murcia JM. 1998. Importance of poly(ADP-ribose) polymerase and its cleavage in apoptosis. Lesson from an uncleavable mutant. J Biol Chem 273: 33533-33539
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