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문제 정의
- 5)하지만 현재 지황의 경우에는 18S RNA의 염기서열이 전혀 알려져 있지 않다. 따라서 본 연구에서는 지황(Rehmannia g如而osa)의 18S rRNA의 완전한 염기서열을 밝혀내고, 이것을 진화적으로 근접한 다른 식물들의 18S rRNA의 염기서열과 비교해봄으로써 이들 간의 진화적 연관성에 대해서 조사해보았다.
제안 방법
- PCR 반응을 위해서는 DNA template 200 ng, forward primer 2.5 pmol, reverse primer 2.5 pmol, dNTPs mixture 2 id (10 nM each) 그■리고 Pfu DNA polymerase lyl (3 U)를 포함하는 100 M 의 반응액에서 반응을 진행하였다. PCR 반응에 사용된 forward primer 및 reverse primer는 Table 1 및 Fig.
- PCR 산물은 agarose gel 신ectrophoresis로 분석하여 예상되는 크기의 산물이 생성된 것을 확인한 후에 Promega-] Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System으로 정제하였다. 이렇게 정제된 DNA는 Sma [으로 절단된 pBhiescript SK II plasmid오} 섞어서 ligation 반응을 진행시킨 후 Eschehdiia coli DH5a competent c기 1 을 transfomiation 시키는 데에 사용되었다.
- 地黃 DNA를 사용한 PCR. 地黃으로부터 추출된 DNA를 template로 하여 PCR을 수행하였다. 이때에 사용된 forward primer 는 18S rRNA gene 들의 5'-ends의 conserved region을 target으로 하여 제조되었다, 현삼과 식물들의 18S rRNA genes에서 존재하지 않는 제한효소 Bg/II의 인식부위를 forward primer의 5'-말단에 첨가하여서 cloning시에 사용할 수 있도록 하였다Reverse primer는 5.
- 地黃으로부터 DNA의 추출. 地黃을 막자사발에서 분쇄하여 가루로 만든 후, 0.3g의 분말로 부터 DNA를 추출하였다. 이때에 glass beads를 첨가하고 vortex를 하였더니 그렇게 하지 않았을 때보다 더 많은 DNA를 얻을 수 있었다 (data not shown).
- 있다.妃冲)그러나 이러한 물질들이 지황 이외의 다른 식물들에서도 발견되고 있음을 감안할 때에 본 연구에서 얻어진 결과를 이용하여 지황과 진화적으로 가까운 식물들을 찾아내고, 그러한 식물들을 화학적으로 분석해 봄으로써 여러 가지 유용한 신물질의 발견, 또는 약용식물들의 품종개량에.기여할 수 있으리라고 여겨진다.
- 또한 지황의 염기서열을 BLAST search한 결과, Avicennia marina (Verteiaceae, 마편초과), Paidama torr^ntosa (Scn^hulariaceae, 현심과), Conophdis ' cdpina (Qrobamhac袈 열당과), Buddl^a dai)idii (Lc^aiiaceae, 마전과) 등의 식물들과 높은 sc*를 나타내었다. 따라서 이러한 식물들 외에 추가로 현삼과에 속하는 Pedicularis scwmz(구름송이풀) 및 Verbasa&rt 血asus(우단담배풀)를 추가하여 QustalW 1.8을 사용하여 multiple sequence aiigrm旬t를 수행하였다 이 자료를 가지고 phylogenetic tree를 그린 결과를 Fig. 3에 나타내었다. Fig.
- 2와 같이 관찰되었다. 또한 PCR 중에 발샐할 수 있는 error의 영향을 최소화하기 위하여 insert가 서로 다른 방향으로 삽입되어있는 plasmid들을 골라내어서 두 plasmid들의 염기서열을 모두 분석하고 비교해서 서로 일치 하는 것을 확인하였다.
- 막자사발을 이용하여 地黃을 분쇄하였다. 미세하게 분쇄된 地黃 분말 0.
- 1에 표시하였다 (3). 반응조건은 94C에서 2분간 한 cycle, 그리고 94P에서 1분, 58°C에서 1분, 72°C에서 3분씩 30 cycle을 진행시킨 후:, 최종적으로 72P에서 10분간 유지시켰다.
- 5剛인 glass beads 3ml를 첨가하였다. 여기에 4血의 TE bufferdOmM Tris-HCl, pH 8.0, ImM EDTA) 와 洞 의 10% SDS를 첨가하였다. 이것을 1분 동안 최고속도로 vortex하였다.
- 여기에 RNAse A를 첨가하여 37°C에서 2시간 동안 유지시켰다. 이것을 Qbiogene의 Genedean Turbo Kit를 사용하여 정제하였다.
- 地黃으로부터 추출된 DNA를 template로 하여 PCR을 수행하였다. 이때에 사용된 forward primer 는 18S rRNA gene 들의 5'-ends의 conserved region을 target으로 하여 제조되었다, 현삼과 식물들의 18S rRNA genes에서 존재하지 않는 제한효소 Bg/II의 인식부위를 forward primer의 5'-말단에 첨가하여서 cloning시에 사용할 수 있도록 하였다Reverse primer는 5.8S rRNA의 중간부위를 target 으로 하여 제조되었는데, 역시 cloning시에 사용하기 위하여 현삼과 식물들의 18S rRNA gene, 5.8S rRNA gene 그리고 사이의 intergenic transcribed spacer에 존재하지 않는 Hind IO의 인식부위를 첨가하였다. PCR에는 error가 많이 발생하는 Taq DNA polymerase 대신에 error가 훨씬 적게 발생하는 Pfu DNA polymerase를 사용함으로써 반응 중에 DNA sequence가 변경되는 것을 최소화하였다.
- Tnuisfonned cells는 ampici血(100昭/显)을 함유하는 MacG)nkey agar plate에 도말되었다. 흰색의 colony들로부터 plasmid DNA가 추출되었고, agarose gel 신ectrophoresis를 통해서 예상되는 크기의 insert DNA가 포함되어있는 것을 확인한 후, 염기서열 분석이 수행되었다.
대상 데이터
- 본 연구에 사용된 한국산 地黃은 경남 마산시 소재의 한의원들에 한약재를 주로 공급하고 있는 제약사를 통해서 수집되었다.
이론/모형
- 이렇게 얻어진 DNA는 PCR 반응시 template로 사용하는 데에 전혀 문제가 없음을 확인하였다. 본 연구에서는 지황 (Rehmannia glutinosa)의 18S rRNA 유전자의 염기서열을 최초로 밝혀내고, 그것을 GenBank에 등록하였다 (accession number DQ469606). 이 염기서열을 분자 분류학적으로 분석한 결과, 지황을 포함하는 현삼과(Scrophulariaceae) 식물들간의 유사성을 확인할 수 있었고, 또한 마전과 (Loganiaceae) 에 속하는 Buddleja davidii가 현삼과 식물들과 높은 유사성을 보이는 것을 확인할 수 있었다.
성능/효과
- 8S rRNA gene 그리고 사이의 intergenic transcribed spacer에 존재하지 않는 Hind IO의 인식부위를 첨가하였다. PCR에는 error가 많이 발생하는 Taq DNA polymerase 대신에 error가 훨씬 적게 발생하는 Pfu DNA polymerase를 사용함으로써 반응 중에 DNA sequence가 변경되는 것을 최소화하였다.이렇게 얻어진 PCR 산물을 agarose gel electrophoresis를 통하여 분석한 결과, 예상한 대로 약 2.
- 건조된 지황의 뿌리로부터 DNA를 추출할 때에 파쇄된 분말에 glass bead를 첨가하고 vorte汉하였더니 DNA 의 회수율이 높게 나타났다. 이렇게 얻어진 DNA는 PCR 반응시 template로 사용하는 데에 전혀 문제가 없음을 확인하였다.
- 3에 의하면 phylogenetics를 이용한 분류 결과가 기존의 분류결과와 대체적으로 일치하는 것을 알 수 있다. 그러나 마전과에 속하는 Buddleja 也侦面가 현삼과 식물들과 높은 유사성을 보인다는 것이 예상하지 못했던 결과이었다. Taskova et al.
- 본 연구에서 밝혀진 염기서열은 18S rRNA 유전자의 coding sequence인 1, 803니耳>로서, nudeotides의 조성은 A+T가 9()1개, 그리고 G+C 가 902개로서 G+C 함량은 50%로 나타났다. 또한 지황의 염기서열을 BLAST search한 결과, Avicennia marina (Verteiaceae, 마편초과), Paidama torr^ntosa (Scn^hulariaceae, 현심과), Conophdis ' cdpina (Qrobamhac袈 열당과), Buddl^a dai)idii (Lc^aiiaceae, 마전과) 등의 식물들과 높은 sc*를 나타내었다. 따라서 이러한 식물들 외에 추가로 현삼과에 속하는 Pedicularis scwmz(구름송이풀) 및 Verbasa&rt 血asus(우단담배풀)를 추가하여 QustalW 1.
- DQ469606). 본 연구에서 밝혀진 염기서열은 18S rRNA 유전자의 coding sequence인 1, 803니耳>로서, nudeotides의 조성은 A+T가 9()1개, 그리고 G+C 가 902개로서 G+C 함량은 50%로 나타났다. 또한 지황의 염기서열을 BLAST search한 결과, Avicennia marina (Verteiaceae, 마편초과), Paidama torr^ntosa (Scn^hulariaceae, 현심과), Conophdis ' cdpina (Qrobamhac袈 열당과), Buddl^a dai)idii (Lc^aiiaceae, 마전과) 등의 식물들과 높은 sc*를 나타내었다.
- 본 연구에서는 지황 (Rehmannia glutinosa)의 18S rRNA 유전자의 염기서열을 최초로 밝혀내고, 그것을 GenBank에 등록하였다 (accession number DQ469606). 이 염기서열을 분자 분류학적으로 분석한 결과, 지황을 포함하는 현삼과(Scrophulariaceae) 식물들간의 유사성을 확인할 수 있었고, 또한 마전과 (Loganiaceae) 에 속하는 Buddleja davidii가 현삼과 식물들과 높은 유사성을 보이는 것을 확인할 수 있었다.
- 의 회수율이 높게 나타났다. 이렇게 얻어진 DNA는 PCR 반응시 template로 사용하는 데에 전혀 문제가 없음을 확인하였다. 본 연구에서는 지황 (Rehmannia glutinosa)의 18S rRNA 유전자의 염기서열을 최초로 밝혀내고, 그것을 GenBank에 등록하였다 (accession number DQ469606).
- PCR에는 error가 많이 발생하는 Taq DNA polymerase 대신에 error가 훨씬 적게 발생하는 Pfu DNA polymerase를 사용함으로써 반응 중에 DNA sequence가 변경되는 것을 최소화하였다.이렇게 얻어진 PCR 산물을 agarose gel electrophoresis를 통하여 분석한 결과, 예상한 대로 약 2.1-kb의 DNA가 Fig. 2와 같이 관찰되었다. 또한 PCR 중에 발샐할 수 있는 error의 영향을 최소화하기 위하여 insert가 서로 다른 방향으로 삽입되어있는 plasmid들을 골라내어서 두 plasmid들의 염기서열을 모두 분석하고 비교해서 서로 일치 하는 것을 확인하였다.
- 이때에 glass beads를 첨가하고 vortex를 하였더니 그렇게 하지 않았을 때보다 더 많은 DNA를 얻을 수 있었다 (data not shown). 추출된 DNA의 순도를 확인하기 위하여 ODWODso의 비율을 측정한 결과, 1.94로 나타났다.
후속연구
- 기여할 수 있으리라고 여겨진다. 또한 지리적으로 다양한 지역에서 채취된 지황의 18S rRNA 유전자를 분석해 보는 것도 가치가 있는 연구일 것으로 생각된다.
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