녹용약침액(鹿茸藥鍼液)의 간암세포주(肝癌細胞柱)에 대한 DNA 및 단백질 발현(發顯) DNA and Proteomic Expression of Cervi parvum cornu Herbal-acupuncture Solution (CPC-HAS) in HepG2 carcinomar cells원문보기
Objective : It has long been known about the osteogenic effect of CPC-HAS on bone tissues. However, it has not been determined the effect of CPC-HAS on cancer cells. The purpose of this study is to screen the CPC-HAS mediated differentially expressed genes in cancer cells such as HepG2 hepatoma cell...
Objective : It has long been known about the osteogenic effect of CPC-HAS on bone tissues. However, it has not been determined the effect of CPC-HAS on cancer cells. The purpose of this study is to screen the CPC-HAS mediated differentially expressed genes in cancer cells such as HepG2 hepatoma cells. Oligonucleotide microarray and proteomics approaches were employed to screen the differential expression genes. Methods : CPC-HAS was prepared by boiling and stored at $-70^{\circ}C$ until use. Cells were treated with various concentrations of CPC-HAS (0.1, 0.5, 1.5, 10, 20mg/ml) for 24 h. Cell toxicity was tested by MTT assay. To screen the differentially expressed genes in cancer cells, cells were treated with 1.5mg/ml of CPC-HAS. For oligonucleotide microarray assay, total RNA was used for gene expression analysis using oligonucleotide Genechip(Human genome Ul33 Plus 2.0., Affimatrix Co.). For proteomic analysis, total protein was analyzed by 2D gel electrophoresis and Q-TOF mass spectrometer. Results : It has no cytotoxic effects on both HepG2 cell in all concentrations(0.l, 0.5, 1.5, 10, 20mg/ml). In oligonucleotide microarray assay, the number of more than twofold differentially regulated known genes was 23 with 5 up-regulated and 18 down-regulated genes in HepG2 cells. In proteomic analysis, three spots were identified by 2D-gel electrophoresis and Q-TOF analysis. Two down-regulated proteins were aldehyde dehydrogenase 1 and enolase 1, and up-regulated protein was fatty acid binding protein 1 by 1.5mg/ml of CPC-HAS. Discussion : This study showed the screening of CPC-HAS mediated differentially regulated genes using combined approaches of oligonucleotide microarray and proteomic analysis. The screened genes will be used for the better understanding of the therapeutic effects of CPC-HAS on cancer fields.
Objective : It has long been known about the osteogenic effect of CPC-HAS on bone tissues. However, it has not been determined the effect of CPC-HAS on cancer cells. The purpose of this study is to screen the CPC-HAS mediated differentially expressed genes in cancer cells such as HepG2 hepatoma cells. Oligonucleotide microarray and proteomics approaches were employed to screen the differential expression genes. Methods : CPC-HAS was prepared by boiling and stored at $-70^{\circ}C$ until use. Cells were treated with various concentrations of CPC-HAS (0.1, 0.5, 1.5, 10, 20mg/ml) for 24 h. Cell toxicity was tested by MTT assay. To screen the differentially expressed genes in cancer cells, cells were treated with 1.5mg/ml of CPC-HAS. For oligonucleotide microarray assay, total RNA was used for gene expression analysis using oligonucleotide Genechip(Human genome Ul33 Plus 2.0., Affimatrix Co.). For proteomic analysis, total protein was analyzed by 2D gel electrophoresis and Q-TOF mass spectrometer. Results : It has no cytotoxic effects on both HepG2 cell in all concentrations(0.l, 0.5, 1.5, 10, 20mg/ml). In oligonucleotide microarray assay, the number of more than twofold differentially regulated known genes was 23 with 5 up-regulated and 18 down-regulated genes in HepG2 cells. In proteomic analysis, three spots were identified by 2D-gel electrophoresis and Q-TOF analysis. Two down-regulated proteins were aldehyde dehydrogenase 1 and enolase 1, and up-regulated protein was fatty acid binding protein 1 by 1.5mg/ml of CPC-HAS. Discussion : This study showed the screening of CPC-HAS mediated differentially regulated genes using combined approaches of oligonucleotide microarray and proteomic analysis. The screened genes will be used for the better understanding of the therapeutic effects of CPC-HAS on cancer fields.
* AI 자동 식별 결과로 적합하지 않은 문장이 있을 수 있으니, 이용에 유의하시기 바랍니다.
문제 정의
이에 著者는 壯腎陽, 補氣血, 益精髓, 强筋骨 效能이 있는 鹿茸關(antler, Cervi parvum comu ; CPC)으로 藥鉞液 을 조제하여, 抗癌效能을 밝히고자 肝癌細胞柱에 최신 oligonucleotide chip assay 법 과 proteomic analysis기 법을 이용하여 遺傳子 發顯을 分析한 結果 有意性을 얻었기에 報吿하는 바이다.
제안 방법
하였다. HepG2細胞에 鹿茸藥鉞液을 처리 한 후 發顯 단백질들의 양적 차이를 비교하였다. 비교 후 增加나 減少를 나타내는 단백질들 중 발현차이가 뚜렷한 것들을 선정하여 동정 하였다.
확인하였다. Q-TOF 分析으로 얻어진 단백질 조각들의 분자량은 ProID Database 프로그램 (MDS Sciex, U.S.A.)을 이용하여 검색한 후 각 단백질을 동정하였다.
SA)에서 구입 확보하였다. 細胞 培養에 사용된 미디어는 DMEW12k (50:50) (GibcoBRL, U.S.A.)에 FBS(fetal bovine serum) (GibcoBRL, U.S.A.)10%를 첨가하여 사용하였다.배 양기의 약 70% 정도 細胞가 자라면 (2.
0으로 chip 위에 총 probe 數가 54, 676개 이 고 遺傳子 數로는 40, 000개가 집적되어 있다. 細胞 毒性 실험에서 비교적 毒性이 적고 鹿茸藥鉞液의 약효를 중분히 나타낼 수 있는 실험군(L5mg/ml)과 대조군으로 나누어 分析하였다.
細胞柱에 鹿茸藥緘液을 1.5mg/ml로 처리한 후 24시간 동안 반응시켜 얻어진 細胞에 8M urea, 2% Nonidet P-40 (NP-40), 2% ampholytes (Ampholine pH 3.5 and pH 5.8; Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden, 5% polyvinylpyrrolidone)/]- 포함된 시 약을 사용하여 일차적으로 細胞를 破碎 시킨 다음 15, 000rpm (Kubota, Tokyo, Japan)에서 5분 동안 원심 분리를 2회 실시 한 후 上淸液을 2D PAGE에 사용하였다. 단백 질은 IEF (Isoelectric focusing) 에 의한 pH gradient (pH 6-10, Daiici-Kagaku, Tokyo, Japan)에 따라서 첫 번째 분리를 시도하였다.
鹿茸藥緘液 처리 후 增加되는 단백질 중 일부를 spot 3라 명 명하고 같은 방법으로 동정 하였다. Spot 3은 fatty acid binding protein 1 (GB No.
鹿茸藥緘液 처리에 發顯 增減을 나타내는 단백질들을 찾기 위하여 2D-gel 전기 영동과 Q-TOF 分析을 시 행 하였다. HepG2細胞에 鹿茸藥鉞液을 처리 한 후 發顯 단백질들의 양적 차이를 비교하였다.
鹿茸藥緘液의 抗癌效能을 밝히고자 肝癌細胞柱에 최신 oligonucleotide chip assay 법고} proteomic analysis 기법을 통하여 大量의 遺傳子 發顯을 分析한 結果 다음과 같은 結論를 얻었다.
시료를 처리하기 12시간 전에 培養液을 serum이 없는 상태로 만들어서 serum 내의 cytokine 및 단백질의 영향을 배제하였다. 鹿茸藥緘液의 농도를 0.1, 0.5, 1.5, 10 및 20mg/ml되게 HepG2 細胞에 24시간 처리하였다. 細胞를 trypsin-EDTAlml 을 첨가하여 PBS로 씻은 후 원심 분리하여 회수하였다.
鹿茸藥織液에 의한 細胞 增殖 抑制를 分了生物學的 기 전으로 설명 하기 위하여 cDNA microarray 分析을 시행하였다.
8; Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden, 5% polyvinylpyrrolidone)/]- 포함된 시 약을 사용하여 일차적으로 細胞를 破碎 시킨 다음 15, 000rpm (Kubota, Tokyo, Japan)에서 5분 동안 원심 분리를 2회 실시 한 후 上淸液을 2D PAGE에 사용하였다. 단백 질은 IEF (Isoelectric focusing) 에 의한 pH gradient (pH 6-10, Daiici-Kagaku, Tokyo, Japan)에 따라서 첫 번째 분리를 시도하였다. 그런 다음 분자량에 따라서 분리를 실시하기 위 하여, 8M urea, 3.
Q-TOF는 혼합물에 존재하는 특정 물질의 선택기능이 우수할 뿐만 아니라 CID를 이용한 fragment를 높은 감도로 측정할 수 있다. 따라서 鹿茸藥緘液 처 리에 發顯 增減을 나타내는 단백질들을 찾기 위하여 2Dgel 전기영동과 Q-TOF 分析을 시행하였고, HepG2 細胞 에 鹿茸藥鹹液을 처리한 후 發顯 단백질들의 양적 차이를 비교 후 增加나 減少를 나타내는 단백질들 중 발현차이가 뚜렷한 것들을 선정하여 동정하였다.
培養 종료 시 plate# 450gx5분간 원심 분리하여 생성된 fonnazan 결정을 가라앉힌 후 각 well에 형성된 결정이 흐트러지지 않도록 주의하면서 배지를 30μ1 정도만 남기고 multidispensei■를 이용하여 모두 제거하였다. 배지가 제거된 각 well에 생성된 formazan 결정을용해시키기 위하여 DMSO를 150“1 씩 가한 후 formazan결정이 녹을 수 있도록 약 15분간 가볍게 진탕해 주고 96-wellplate용 광도계 (ELISA reader)로 540nm 에서의 흡광도를 측정하였다. 이 흡광도는 MTT가 細胞에 의해 환원된 양을 나타내며 각 well에 존재하는 생존 細胞數와 비례한다.
HepG2細胞에 鹿茸藥鉞液을 처리 한 후 發顯 단백질들의 양적 차이를 비교하였다. 비교 후 增加나 減少를 나타내는 단백질들 중 발현차이가 뚜렷한 것들을 선정하여 동정 하였다.2D-gel 전기 영동 후 나타나는 단백질들의 사진으로 시료처치 후 減少된 단백질을 spot 1과 spot 2라 명명하였다.
5X105)계대 培養한 후 사용하였다. 시료를 처리하기 12시간 전에 培養液을 serum이 없는 상태로 만들어서 serum 내의 cytokine 및 단백질의 영향을 배제하였다. 鹿茸藥緘液의 농도를 0.
여러 농도(0.1, 0.5, 1.5, 10, 20mg/ml)의 鹿茸藥緘液을 처리한 細胞를 l, 000rpm에서 5분 정도 원심 분리한 후 남은 細胞에 10ml의 細胞 培養 溶液을 넣고 멸균 피펫을 통한 반복 흡입으로 단일 細胞 부유액을 얻었다. 부착성 細胞의 경우에는 tiypsin을 처리하여 細胞를 플라스크 바닥으로부터 떼어낸 후 細胞 培養 溶液으로 중화 시켜 LOOOrpm으로 다시 5분 정도 원심 분리한 후 10 ml의 細胞 培養 溶液으로 멸균피펫을 통한 반복 흡입으로 단일 細胞 부유액을 얻었다.
예비 실험에서 결정된 적정 농도를 기준으로 細胞의 數를 결정한 후 준비된 단일 細胞 부유액을 넓은 Cane 에서 잘 혼합한 뒤 multichannel 피펫을 이용하여 각 well에 180贝의 細胞 부유액을 접종하였다, 측정하고자 하는 시료를 PBS에 녹인 후 농도별로 20μ1씩 각 well 에 첨가하였다.
따라서 human genome project가 끝나면 여러가지 遺傳구들의 조절을 이용한 약물 개발이 활발히 진행될 것으로 예상되며, 韓醫學的 지식을 바탕으로 각종 질환에 대한 治療 가능한 물질의 체계적인 검색은 미래의 生命科學 分野에 중요한 연구 전략으로 생각된다珈. 이를 위하여 각종 질환 또는 약재 개발에 필요한 실험 모델을 개발하고, 나아가 그 모델로 찾고자 하는 물질들을 검색할 수 있는 방법을 알아내어, 최종적으로 검색된 물질의 效能을 分析 . 評價할 수 있는 체계를 갖추는 것이 필수적이다.
이에 臨床的 作用機轉을 보다 깊이 이해하고 臨床的 應用의 폭을 넓히는 데에 도움이 되는 기초 자료로 쓰일 수 있도록, 鹿茸으로 藥鐵液을 조제하여 抗癌 效能을 밝히고자, 肝癌細胞柱에 최신 oligonucleotide chip assay 법 과 proteomic analysis기 법 을 통해 大量의 遺傳子 發顯 을 分析하였다.
이온화 방법(MALDI)으로 생성된 이온을 mass analyzer인 Q-TOF에서 질량/하전량과의 비에 따라 분리 검출된 질 량스펙트럼을 分析, 해석 하여 분석물질의 질량을 확인하였다. Q-TOF 分析으로 얻어진 단백질 조각들의 분자량은 ProID Database 프로그램 (MDS Sciex, U.
대상 데이터
cells)(GB (Genebank) No. BG389789), regulator of G protein signaling RGS12(GB No. AF030110.1), MAPK(mitogen-activated protein kinase)8 interacting protein 3(GB No. BF445013), PPI650 unknown mRNA(GB No. AF217988.1) 등 5개 였다(Table 1, Fig. 4-1).
本 實驗에서 사용된 鹿茸(antler, Cervi parvum comu ; CPC)(러시아産)은 대구한의대학교 부속 대구한방병원 藥劑科에서 300g을 購入한 후 精選하여 使用하였다.
發顯이 2배 이상 減少된 遺傳구는 olfactory receptor family2(GB No. N54813), TR2(GB No. M21985.1), crystalline, yA(GB No. NM_014617.2), CA11(GB No. NM_ 019617.1), type H Golgi membrane protein(GB No. AI811298) 등 18개였으며, 이 외에도 lactate dehydrogenase A(GB No. AY 009108.1) 등의 發顯이 減少되 었다(Table 2, Fig. 4-2).
본 실험에 사용된 細胞柱는 肝癌 細胞에서 유래한 HepG2(hepatic cancer cell)는 ATCC(U.SA)에서 구입 확보하였다. 細胞 培養에 사용된 미디어는 DMEW12k (50:50) (GibcoBRL, U.
본 실험에 사용된 遺傳子 chipe Human Genome U133 Plus 2.0으로 chip 위에 총 probe 數가 54, 676개 이 고 遺傳子 數로는 40, 000개가 집적되어 있다. 細胞 毒性 실험에서 비교적 毒性이 적고 鹿茸藥鉞液의 약효를 중분히 나타낼 수 있는 실험군(L5mg/ml)과 대조군으로 나누어 分析하였다.
데이터처리
2D 전기영동 결과 얻어진 spot에 대한 상호 비교 데이터를 소프트웨어 (Bio-Rad, U.S.A.)를 사용하여 정량적인 데이터를 얻었다.鹿茸藥鐵液에 대하여 단백질 發 顯의 양적 차이를 보이는 spot을 다음과 같이 동정하였다.
이는 增加(I), 미 약한 增 加(MI), 減少(D) 미약한 減少(MD) 및 변화 없음(NC)으로 분류된다. 각각의 구분에는 “Change p-value”도 제시되며, 이러한 모든 통계적인 데이터는 microarray data를 分析하는데 사용하였다, 分析은 Affymetrix社에서 나온 MAS version 5.0 software를 이 용하였다(Fig. 1).
이 흡광도는 MTT가 細胞에 의해 환원된 양을 나타내며 각 well에 존재하는 생존 細胞數와 비례한다.통계처리는 studentHest로 처리하였으며, 유의수준은 pvO.05로 하였다.
이론/모형
본 실험에서는 먼저 鹿茸藥緘液의 癌細胞 增殖 抑制 效能 및 적정 농도를 알아보기 위해 MTT-assay 分析을 하였다. 鹿茸藥緘液 처리 후 24시간 뒤 細胞 增殖을 살펴보면, 胃癌 細胞柱의 경우 0.
성능/효과
1. MTT 分析에서 肝癌細胞柱는 0.5, 1.0mg/ml에서 細胞 增殖이 增加되었으며, 다른 농도에서는 對照 群에 비해 有意한 細胞 數의 변화를 보이지 않았다.
2. 鹿茸藥誠液 處置 時 對照群에 비해 發顯이 2배 이상 增加된 遺傳子는 human mRNA UCIA, regulator of G protein signaling RGS12, MAPK 8 interacting protein 3 등 5개 였다.
發顯 에 관한 情報를 硏究하는 方法으로서 기존의 개별 遺 傳子 發顯을 관찰하던 方法에서 탈피하여 microarray chip을 利用함으로써 大量의 遺傳子 發顯 情報를 한꺼번에 평가하는 方法이 개발되어 보다 많은 量의 遺傳 發顯情報를 한 번에 파악할 수 있게 되었다. 따라서 遺 傳子 자체의 情報 뿐 아니라 치료 후의 變化를 폭넓게 파악할 수 있게 되어 硏究 發展에 획기적인 전기를 마련할 수 있게 되 었다*”.
또한, 癌腫에서 다발성 약제 내성은 抗癌治療가 실패하게 되는 원인이고 이전의 胃癌細胞柱에서 행한 연구에 서 hsp27, rcl, aldehyde dehydrogenase 1, vimentinS] 發 顯 增加를 관찰할 수 있었으며 이들은 抗癌劑 내성과 연관이 있는 것으로 보여 진다湖. 따라서, aldehyde dehydrogenase 1의 發顯을 減少는 鹿茸이 抗癌劑 내성과 관련이 있는 효소의 發顯을 抑制함으로써 癌腫에 대한 抗癌劑 감수성을 增加시킬 수 있을 것임을 의미한다. Fatty acid binding protein 1의 發顯 增加는 鹿茸에 포함되어 있을 것으로 믿어지는 지방성분과 결합하기 위하여 增加된 것으로 思料된다.
후속연구
CA11은 정상 자궁경부 조직에서는 發顯이 되나 자궁경부 癌腫이나 자궁 경부 癌腫의 細胞柱에서는 發顯이 되지 않는 것이며眄, 82%의 胃癌에서도 CAllgene의 發 顯이 減少된 것으로 報吿되 었으나, 腫瘍의 크기 나 임 파선 전이와 같은 임상적인 변수와의 연관관계는 없는 것으로 報吿되었다叫 CA11은 鹿茸에 의하여 發顯이 減 少되는 것으로 나타났으나, 아직 CAIS] 癌腫에서 어떠한 역할을 하는 지에 대하여는 불명확한 상태이며, 이 부분에 대하여는 추가적인 연구가 필요할 것으로 思料된다. 흥미 있는 것은 Q-TOF 分析에서 發顯이 減少 된 것으로 나타난 dehydrogenase와 비슷한 효소가 microarray에서도 減少된다는 사실이다.
本 實驗의 結果 肝癌細胞柱에 鹿茸藥緘液 處理 時 癌 細胞의 成長에 관련되는 遺傳子 뿐 아니라 轉移에 관련되는 遺傳구의 發顯도 抑制하였으며, 특히 抗癌劑 감수성을 높일 수 있다는 가능성을 보인 것은 抗癌劑 治 療를 받는 환자에서 鹿茸을 같이 처방하는 경우 그 效 果가 增加될 수 있음을 의미하나, 자세한 機轉을 糾明 하기 위해서는 더 많은 硏究가 진행되어야 할 것으로 思慮된다.
많은 수의 CBs가 다양한 형태의 細胞柱에서 발견이 되는데, 어떤 인자가 그 수를 조절하는지 아직 모르나 coilin으] 카복시 말단이 그 수를 결정하는데 중요한 역할을 담당한다고 한다세. 그런데 coilin이 癌腫에서 어떠한 역할을 수행하는지에 대하여는 알려진 바가 거의 없으므로 이 부분에 대하여는 추가적인 연구가 필요할 것으로 思料된다.
셋째로 돌연변이를 검색할 수 있고, 넷째로 병의 진단, 遣傳子 發顯 청사진을 만드는데 이용 가능하다. 다섯째로 인체 遺傳구의 機能分析 연구에 이용 가능하며, 여섯째로 산업용 遺傳子 재조합 동식물 및 미생물 연구에 이용 가능하고, 일곱째로 실험용 동식물 모델 연구, 癌 및 질병 관련 遺傳子 진단, 遺傳子 治療 및 임상 병리학, 동식물 검역 및 환경변화에 따른 생태학 연구에 이용 가능하다. 이외에도 식품 안전성 검사, 신약 개발, 약제내성 검색 진단 및 DNA염기서열 분석에 이용 가능하다.
이상과 같이 鹿茸藥緘液에 대한 肝癌細胞柱의 遺傳 子 發顯을 oligonucleotide分析과 proteomic analysis 7]^ 으로 大量 檢索할 수 있었고, 심한 發顯 差異를 나타내는 각 遺傳子는 癌化 過程이나, 鹿甘藥緘液에 반응하는 遺傳구로 치료제 개발을 위한 기초 자료로 활용할 수 있을 것으로 想料된다.
참고문헌 (38)
서울대학교 의과대학. 종양학. 서울: 서울대학교 출판부. 1992 : 1, 3, 27, 36, 91, 99, 137-192.
통계청. 2003년 사망원인통계연보. 대전: 통계청. 2004 : 22-4.
박재갑. 인간생명과학. 서울: 서울대학교출판부. 1993:662-73.
El-Aneed A. Current strategies in cancer gene therapy. European Journal of Pharmacology. 2004;498(1-3):1？18.
Collins FS, Patrinos A, Jordan E, Chakravarti A, Gesteland R, Walters L. New goals for the U.S. human genome project: 1998-2003. Science 1998;282(5389):682？746.
Hedric SM, Cohen DI, Nielsen EA, Davis MM. Isolation of cDNA clones encoding T-cell specific membrane associated proteins. Nature 1984;308(5955):149？53.
Mason IJ, Taylor A, Williams JG, Sage H, Hugan BLM. Evidence from molecular cloning that SPARC, a major product of mouse embryropariental endoderm is related to an endothelial cell cu1ture shock glycoprotein of Mr. 43000. EMBO J 1986;5(9):1465？72.
Liang P, Averboukh L, Keyomarsi K, Sager R, Pardee AB. Differential display and cloning of messenger RNAs from human breast cancer versus mammary epithelial cells. Cancer Res. 1992;52(24):6966？8.
Han C, Demetris AJ, Liu Y, Shelhamer JH, Wu T. Transforming growth factor-beta (TGF-beta) activates cytosolic phospholipase A2alpha (cPLA2alpha)-mediated prostaglandin E2 (PGE)2/EP1 and peroxisomeproliferator -activated receptor-gamma (PPAR-gamma)/Smad signaling pathways in human liver cancer cells. A novel mechanism for subversion of TGF-beta-induced mitoinhibition. J Biol Chem 2004;279(43):44344？54.
Shpargel KB, Ospina JK, Tucker KE, Matera AG, Hebert MD. Control of Cajal body number is mediated by the coilin C-terminus. J Cell Sci 2003;116(Pt 2):303？12.
Sun QA, Wu Y, Zappacosta F, Jeang KT, Lee BJ, Hatfield DL, Gladyshev VN. Redox regulation of cell signaling by selenocysteine in mammalian thioredoxin reductases. J Biol Chem 1999;274(35):24522？30.
Ko J, Ryu KS, Lee YH, Na DS, Kim YS, Oh YM, Kim IS, Kim JW. Human secreted frizzled-related protein is down-regulated and induces apoptosis in human cervical cancer. Exp Cell Res 2002;280(2):280？7
Spence JP, Liang T, Eriksson CJ, Taylor RE, Wall TL, Ehlers CL, Carr LG. Evaluation of aldehyde dehydrogenase 1 promoter polymorphisms identified in human populations. Alcohol Clin Exp Res 2003;27(9):1389？94
Ludwig A, Dietel M, Lage H. Identification of differentially expressed genes in classical and atypical multidrug-resistant gastric carcinoma cells. Anticancer Res 2002;22(6A):3213？21.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.