A novel series of 4-senecioyloxymethyl-6,7-dimethoxycoumarin, isolated from Crinum latifolium, was prepared by reacting 4-bromomethyl or 4-bromomethyl-6,7- dimethoxycoumarin with various carboxylic acids and examined for their anti-angiogenic activities in human umbilical vein endothelial cells (HUV...
A novel series of 4-senecioyloxymethyl-6,7-dimethoxycoumarin, isolated from Crinum latifolium, was prepared by reacting 4-bromomethyl or 4-bromomethyl-6,7- dimethoxycoumarin with various carboxylic acids and examined for their anti-angiogenic activities in human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). Among them, 4e, 4f, 4g and 4i with noncyclic moiety exhibited potent anti-angiogenic activity. However, compounds with cyclic moiety such as phenyl, pyridinyl, thiophenyl and furanyl group did not exhibit any anti-angiogenic activity. Also, compounds 4f and 4g which exhibited strong anti-angiogenic activity in a dose-dependent manner showed antitumor activity.
A novel series of 4-senecioyloxymethyl-6,7-dimethoxycoumarin, isolated from Crinum latifolium, was prepared by reacting 4-bromomethyl or 4-bromomethyl-6,7- dimethoxycoumarin with various carboxylic acids and examined for their anti-angiogenic activities in human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). Among them, 4e, 4f, 4g and 4i with noncyclic moiety exhibited potent anti-angiogenic activity. However, compounds with cyclic moiety such as phenyl, pyridinyl, thiophenyl and furanyl group did not exhibit any anti-angiogenic activity. Also, compounds 4f and 4g which exhibited strong anti-angiogenic activity in a dose-dependent manner showed antitumor activity.
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문제 정의
즉, 쿠마린 환의 6번과 7번 위치에는 선도물질의 구조와 같이 메톡시 기로 고정시키고 4번 위치에 senecioyl 기 대신에 여러가지 alkyl 기 또는 thiophenyl, pyridinyl, furanyl 및 phenyl 기와 같은 cyclic 형태의 치환기가 도입된 유도체들을 합성하였다. 따라서 본 논문은 쿠마린 유도체의 합성방법과 유도체들의 신생 혈관억제효과 및 in vivo 항암효과에 대해서 기술하고자 한다.
본 연구실에서는 신생 혈관형성을 억제하여 항암효과를 나타내는 항암제를 개발하고자 인도문주란에서 분리한 4-senecioyl-oxymethyl-6, 7-dimethoxycoumarine 선도물질로 하여 여러 가지 유도체들을 합성하고자 하였다. 즉, 쿠마린 환의 6번과 7번 위치에는 선도물질의 구조와 같이 메톡시 기로 고정시키고 4번 위치에 senecioyl 기 대신에 여러가지 alkyl 기 또는 thiophenyl, pyridinyl, furanyl 및 phenyl 기와 같은 cyclic 형태의 치환기가 도입된 유도체들을 합성하였다.
가설 설정
6)신생 혈관형성은 기존의 혈관으로부터 새로운 혈관이 형성되는 일련의 과정으로 정상 상태에서 상처 치유, 생식 , 배아 발생 및 항체발달 등에 중요한 영향을 끼친다. 7)반면에 과도한 혈관형성은 관절염, 암의 성장 및 전이의 원인이 되기도 한다.8)이러한 신생 혈관형성은 생체 내에서 혈관형성의 억제제인 thrombospondin-1, angiostatin, endostatin등과 활성화제인 VEGF(vascular endotherial growth factor), bFGF(basic fibroblast growth fector), EGF(epidermal growth factor) 등의 균형에 의해 조절되고 있다.
제안 방법
이식 후 24시간부터 각 군을 6마리로 배정하였다. 대조군은 생리식염수 0.2 n"을, 실험군은 일정농도의 약물을 생리식염수에 현탁시킨 용액 0.2 m/을 마우스에 매일 1회 복강 주사하였다. 약물투여는 대조군의 tumor volume이 약 2 cm’가 될 때까지 투叫하였으며 (14 일), tumor 크기를 측정한 다음 아래의 계산식으로 tumor 면적을 구하여 inhibition ratio of tumor volume을 측정하였다.
1% 젤라틴이 코딩된 96 well plate에 well 당 세포수가 软 密이 되도록 분주하였다. 24시간 배양시킨 후 5% heat-inactivated FBS, lOng/mZ VEGF와 5 units/m/ heparin0] 첨가된 M199 배지로 물질을 농도별로 희석하여 100涉씩 첨가하여 48시간 동안 배양시켰다. lmZ XTT (1 mg/血 in PBS) stock solution과 10 以 PMS(1.
Pechman condensation 방법으로 쿠마린환인 4-chloromethyl 또는 4-bromo~methyl-6, 7-dimethoxycoumarin(3, 5)을 힙성하였으며, 이에 유기산을 도입하여 목적하는 쿠마린 유도체 13종을 합성하였다(Scheme 1, 2). 즉, 과량의 황산 존재 하에서 3, 4- dimethoxyphenol(2)과 ethyl 4-chloroacetoacetate> 반응시켜 98%의 높은 수율로 4<hloromethyl-6, 7-dimethoxycoumarin(3) 를 합성한 후 이에 다양한 구조를 지닌 유기산들을 도입하여 목적하는 4-senecioyloxymethyl-6, 7-dimethoxycoumarin(l)2]- 이들의 유도체(4&4)를 합성하였다.
24시간 배양시킨 후 5% heat-inactivated FBS, lOng/mZ VEGF와 5 units/m/ heparin0] 첨가된 M199 배지로 물질을 농도별로 희석하여 100涉씩 첨가하여 48시간 동안 배양시켰다. lmZ XTT (1 mg/血 in PBS) stock solution과 10 以 PMS(1.53 mg/m/ in PBS)< 혼합 후 50 也를 각 well당 첨가하여 배양한 뒤 microplate reader 450nm에서 흡광도를 측정 후 대조군과 비교하여 세포의 증식율을 계산하였다.
황산적가 완료 후 수중빙욕장치를 제거하고 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 냉수 200 m2 를 가한 뒤 디클로로메탄으로 3회 추출한 후 무수망초로 탈수하였다. 여과한 뒤 여액을 감압농축하였으며 얻은 잔사를 메탄올로 재결정하여 황색 고체 4.
따라서 세포독성이 없는 200 uM 이하의 농도에서 쿠마린 유도체들의 HUVECs 세포 증식 억제효과를 측정하였다.
즉, 과량의 황산 존재 하에서 3, 4- dimethoxyphenol(2)과 ethyl 4-chloroacetoacetate> 반응시켜 98%의 높은 수율로 4<hloromethyl-6, 7-dimethoxycoumarin(3) 를 합성한 후 이에 다양한 구조를 지닌 유기산들을 도입하여 목적하는 4-senecioyloxymethyl-6, 7-dimethoxycoumarin(l)2]- 이들의 유도체(4&4)를 합성하였다. 또한 ethyl acetoacetate# 브롬화 하여 얻은 ethyl Gbnxnoacetoacetate24)를 3, 4-dimethoxyphenol (2)와 반응시켜 4-bromomethyl-6, 7-dimethoxycoumarin(5» 합성한 후 이에 다양한 구조를 지닌 유기산들을 도입하여 목적하는 쿠마린 유도체毎&c)를 합성하였다.
또한 in vitro 실험에서 혈관내피세포의 증식억제 효과가 가장 강한 4f와 4g를 선정하여 in vivo 항암실험을 측정하였다. 실험결과 4f와 4g는 각각 26, 22%의 항암효과를 나타내었으며 , 이는 기존의 항암제인 탁솔(41.
77 mol)을 10분에 걸처 천천히 적가한 후 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 반응용액에 증류수를 가한 뒤 디클로로메탄으로 3회 추출하여 얻은 유기층을 무수망초로 탈수한 뒤 여과하였다. 여액을 감압 농축하여 액상의 ethyl 4-bromoacetoacetate(13.
부작용이 적은 항암제를 개발하고자 신생 혈관형성을 억제하는 인도문주란에서 분리된 4-senecioyloxymethyl-6, 7-dimethoxy- coumarin(l)을 선도물질로 하여 여러가지 유도체들을 합성한 후 그들의 활성을 검토하였다. 합성화합물 13종에 대한 혈관내피세포의 증식억제 효과 실험에서 쿠마린 환의 4번 위치에 non-cyclic 치환체를 지닌 4e, 4f, 4g, 4i와 같은 4종의 물질이 강한 활성을 나타내었다.
2 m/을 마우스에 매일 1회 복강 주사하였다. 약물투여는 대조군의 tumor volume이 약 2 cm’가 될 때까지 투叫하였으며 (14 일), tumor 크기를 측정한 다음 아래의 계산식으로 tumor 면적을 구하여 inhibition ratio of tumor volume을 측정하였다.
반응용액을 실온까지 냉각시키고 증류수를 넣은 뒤 디클로로메탄으로 2회 추출하였다. 유기층을 모아 무수망초로 탈수하고 여과하하여 얻은 여액을 감압 농축하여 얻은 잔사를 실리카겔 컬럼 분리를 통해 물질 1 및 4(a-i» 얻었다.
1, 2). 즉, 과량의 황산 존재 하에서 3, 4- dimethoxyphenol(2)과 ethyl 4-chloroacetoacetate> 반응시켜 98%의 높은 수율로 4<hloromethyl-6, 7-dimethoxycoumarin(3) 를 합성한 후 이에 다양한 구조를 지닌 유기산들을 도입하여 목적하는 4-senecioyloxymethyl-6, 7-dimethoxycoumarin(l)2]- 이들의 유도체(4&4)를 합성하였다. 또한 ethyl acetoacetate# 브롬화 하여 얻은 ethyl Gbnxnoacetoacetate24)를 3, 4-dimethoxyphenol (2)와 반응시켜 4-bromomethyl-6, 7-dimethoxycoumarin(5» 합성한 후 이에 다양한 구조를 지닌 유기산들을 도입하여 목적하는 쿠마린 유도체毎&c)를 합성하였다.
즉, 사람의 제대로부터 분리한 혈관내피 세포를 0.1% 젤라틴이 코팅된 96 well plate에 HUVECs 0.1% 젤라틴이 코딩된 96 well plate에 well 당 세포수가 软 密이 되도록 분주하였다. 24시간 배양시킨 후 5% heat-inactivated FBS, lOng/mZ VEGF와 5 units/m/ heparin0] 첨가된 M199 배지로 물질을 농도별로 희석하여 100涉씩 첨가하여 48시간 동안 배양시켰다.
유도체들을 합성하고자 하였다. 즉, 쿠마린 환의 6번과 7번 위치에는 선도물질의 구조와 같이 메톡시 기로 고정시키고 4번 위치에 senecioyl 기 대신에 여러가지 alkyl 기 또는 thiophenyl, pyridinyl, furanyl 및 phenyl 기와 같은 cyclic 형태의 치환기가 도입된 유도체들을 합성하였다. 따라서 본 논문은 쿠마린 유도체의 합성방법과 유도체들의 신생 혈관억제효과 및 in vivo 항암효과에 대해서 기술하고자 한다.
대상 데이터
분석기기 로는 iH・NMR(400MHz) & 13C-NMR(400 MHz) spectwmeter(JNM-AL 400, JEOL Ltd., Japan), Melting pointer (Yamako, MD-S3, Japan), MS(PE SCIX API 2000 MS/MS, Canada)를 사용하였다. 각종 시약들은 Aldrich Chemical Co.
각종 시약들은 Aldrich Chemical Co. 의제품을 사용하였으며 기타 용매는 1급 이상의 시약을 정제하지 않고 사용하였다. 합성한 물질들의 정제를 위하여 Silica gel (Merck, 230—400 mesh)을 사용하였다.
의제품을 사용하였으며 기타 용매는 1급 이상의 시약을 정제하지 않고 사용하였다. 합성한 물질들의 정제를 위하여 Silica gel (Merck, 230—400 mesh)을 사용하였다.
혈관 내피 세포인 human umbilical vein endothelial cells (HUVECs)은 삼성 산부인과에서 공급받아 Jaffe 방법加)으로 primary culture한 것을 0.1% 젤라틴이 코팅된 플레이트에서 3n以m/ bFGE 5 unit/mZ heparin, 20% FBS(fetal bobine serum)가 첨가된 M199 배지에서 5% CO2, 37℃ 조건으로 배양하였다.
이론/모형
Proliferation assay는 XTT 방법을 이용하여 실시하였다. 즉, 사람의 제대로부터 분리한 혈관내피 세포를 0.
사람의 제대로부터 분리한 혈관내피 세포(HUVECs)에 대한 세포독성 XTT 방법用)을 이용하여 측정하였다. 즉, 혈관내피 세포를 0.
성능/효과
T)최근에 인도문주란(C沥仍财泌"所)에서 분리된 쿠마린 계열의 물질인 4-senecioyloxymethyl-6, 7-dimethoxycoumarin°] 사람의 제대로부터 분리한 혈관내피 세포(HUVEC)의 혈관형성을 억제한다는 연구 보고가 있다.6)신생 혈관형성은 기존의 혈관으로부터 새로운 혈관이 형성되는 일련의 과정으로 정상 상태에서 상처 치유, 생식 , 배아 발생 및 항체발달 등에 중요한 영향을 끼친다. 7)반면에 과도한 혈관형성은 관절염, 암의 성장 및 전이의 원인이 되기도 한다.
흥미로운 사실은 물질 1과 이중결합에 결합되어 있는 메틸의 위치만 다른 구조 이성질체인 물질 4户卜 합성된 유도체들 중 가장 강한 혈관내피세포의 증식을 억제한다는 것이다. 물질 농도 의존적으로 혈관내피세포의 증식을 억제하였으며 , 특히 25 uM 농도에서 bVEGF를 처리하지 않은 수준까지 혈관내피세포의 증식을 강하게 억제하였다. 반면에 cyclic 형태의 물질인 phenyl, thiophenyl, pyridinyl 및 fui血nyl와 같은 치환체가 도입된 물질 4a, 6b, 4b, 4c 및 4d는 혈관내피세포의 증식을 억제하지 않았다.
측정하였다. 실험결과 4f와 4g는 각각 26, 22%의 항암효과를 나타내었으며 , 이는 기존의 항암제인 탁솔(41.1%)에 비해 다소 약한 항암효과를 보이지만 체중 감소와 같은 부작용은 나타나지 않았다 (Table II).
또한 물질 4f, 4g는 in vivo 항암실험에서도 체중감소와 같은 부작용을 나타내지 않고 각각 26 및 22%의 항암효과를 나타내었다. 이상의 결과로부터 쿠마린 유도체가 신생 혈관형성을 억제함으로써 항암효과를 나타낸다는 것을 확인하였다. 향후 Matrigel assay 및 CAM assay와 같은 in vivo 신생혈관 억제실험과 보다 구체적인작용메카니즘 연구 및 다양한 유도체들을 합성할 필요가 있다고 판단된다.
활성을 검토하였다. 합성화합물 13종에 대한 혈관내피세포의 증식억제 효과 실험에서 쿠마린 환의 4번 위치에 non-cyclic 치환체를 지닌 4e, 4f, 4g, 4i와 같은 4종의 물질이 강한 활성을 나타내었다. 특히 4f, 4g는 농도의존적으로 혈관내피세포의 증식을 억제하였으며 25uM 농도에서 bVEGF를 처리하지 않은 수준까지 혈관내피세포의 증식을 강하게 억제하였다.
후속연구
반면에 cyclic 형태의 물질인 phenyl, thiophenyl, pyridinyl 및 fui血nyl와 같은 치환체가 도입된 물질 4a, 6b, 4b, 4c 및 4d는 혈관내피세포의 증식을 억제하지 않았다. 이러한 결과는 혈관내피세포의 증식을 억제하기 위해서는 쿠마린 환의 4번 위치에 cyclic 형태 보다는 non-cyclic 형태의 치환체가 도입되어야 함을 의미하며 향후 추가적인 연구가 필요하리라 판단된다. 한편, non-cyclic 형태의 유도체 중 쿠마린환의 4 번 위치에 carbonyl 기의 |3-탄소 및 个탄소에 이중결합이 도입된 4h와 4i는 혈관내피세포의 증식 억제효과가 나타나지 않거나 미약하였다.
이상의 결과로부터 쿠마린 유도체가 신생 혈관형성을 억제함으로써 항암효과를 나타낸다는 것을 확인하였다. 향후 Matrigel assay 및 CAM assay와 같은 in vivo 신생혈관 억제실험과 보다 구체적인작용메카니즘 연구 및 다양한 유도체들을 합성할 필요가 있다고 판단된다.
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