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문제 정의
- , 2001). 따라서 보다 안전하면서 강한 항산화력을 갖고 있는 비늘버섯을 선별하고자 이들 비늘버섯에 대한 각 추출물들의 SOD 유사활성과 항산화 활성을 조사하였다 (Table 1).
제안 방법
- 비늘버섯에 함유되어 있는 몇 가지 심혈관 질환과 노화 예방 관련 생리 기능성 물질을 탐색하여 고부가가치의 건강 제품을 개발하고자 먼저 전국 각지에서 수집하고, 농업과학기술원, 인천대학 버섯 종균 은행 등으로부터 분양받은 비늘버섯 균주들을 인공 재배하여 63 균주의 자실체를 생산하였다. 이들 자실체들의 물과 메탄올 추출물을 각각 제조한 후 각종 생리 기능성을 조사 한 결과, 혈전 용해 활성은 /! adiposa PAD-030 균주의 메탄올 추출물이 11.
- , 2004) 하였고 배지와 배양조건이 검은비늘버섯의 균사 생장에 미치는 영양을 검토 하였다(이 등, 2005). 본 연구에서는 농업과학기술원과 인천대학 버섯종균은행 및 전국 각지에서 수집된 116균주의 비늘버섯 속균 중 인공배양을 통하여얻어진 63균주 자실체를 물과 메탄올로 추출하여 ß- hydroxy-ß-methylglutaryl(HMG)-CoA reductase 저해활성과 혈전용해 활성 등의 심혈관 질환 관련 생리기능성과 노화관련 생리기능성으로 항산화 활성, superoxide dismutase (SOD) 유사활성, tyrosinase 저해 활성 등을 측정하여 우수 버섯을 선정한 다음, 우수 기능성물질의 추출 최적 조건을 검토 하였다.
- 즉, 각각의 비늘버섯 자실체 분말에 증류수 (1 : 40)를 가한 후 30℃에서 200 ipm으로 12시간 동안 진탕한 후 이 추출액을 15, 000Xg로 10분간 원심 분리하여 상등액을 얻고 Whatman No. 2로 여과한 다음 동결 건조하여 물 추출 시료로 하였다. 또한 분말시료에 70%의 메탄올을 1:20의 비율로 첨가하여 30℃에서 200rpm으로 12시간 동안 진탕한 후 15, 000Xg로 10분간 원심 분리하여 상등액을 얻고 이를 Whatman No.
- 2로 여과한 다음 동결 건조하여 물 추출 시료로 하였다. 또한 분말시료에 70%의 메탄올을 1:20의 비율로 첨가하여 30℃에서 200rpm으로 12시간 동안 진탕한 후 15, 000Xg로 10분간 원심 분리하여 상등액을 얻고 이를 Whatman No. 2로 여과 한 후 rotary evaporator로 유기용매를 제거한 다음 동결 건조하여 메탄올 추출 시료로 하였다. 이와 같이 추출한 시료를 HMG-CoA reductase 저해활성 측정에는 100 ㎍을 사용하였고 여타의 생리 기능성 측정에는 1 mg을 사용하였다.
- 혈전용해 활성은 Fayek and El-Sayed(1980)의 방법을 일부 변형시켜 먼저 0.6% fibrin 용액 3 ㎖에 시료 농축액 500㎕를 첨가하여 40℃에서 10분간 반응시킨 후 0.4 M TCA 용액 를 첨가하여 반응을 정지시키고 여과하였다. 이 여과액 중의 tyrosine량을 1 N folin 시약으로 발색시켜서 정량하였으며 이때 효소 1 unit는 농축 시료액 1 ㎕ 가 1분 동안 tyrosine 1 ㎍을 생산하는 활성으로 하였다.
- 4 M TCA 용액 를 첨가하여 반응을 정지시키고 여과하였다. 이 여과액 중의 tyrosine량을 1 N folin 시약으로 발색시켜서 정량하였으며 이때 효소 1 unit는 농축 시료액 1 ㎕ 가 1분 동안 tyrosine 1 ㎍을 생산하는 활성으로 하였다.
- , 1998). 이와 동시에 HMG-CoA 대신 증류수를 가한 것을 대조구로 반응시킨 후 흡광도의 변화를 비교하여 활성을 계산하였다.
- 방법으로 측정하였다(Blois, 1998). 즉, 농축 시료액 0.2 ㎖에 DPPH 용액 (DPPH 12.5 mg을 EtOH 100 ml 에 용해) 0.8 ㎖를 가한 후 10분간 반응시키고 525 nm에서 흡광도를 측정하여 시료 무첨가 대조구의 값과 비교하여 활성을 계산하였다.
- 2로 조정한 후 TCB를 사용하여 50 ㎖로 조정하여 시료액으로 사용하였다. 시료액 950 ㎖에 50 ㎖ 24 mM pyrogallol을 첨가하여 420nm에서 초기 2분간의 흡광도 증가율을 측정하여 시료액 무첨가 대조구와 비교하여 활성을 계산하였다.
- 0) 215 "에 농축 시료액 100, ", elastase 10^(1 U)와 기질인 azocasein 75 ㎖를 첨가하여 37℃에서 60분간 반응시켰다. 여기에 15% TCA 용액 600 "를 첨가하여 반응을 정지시킨 다음 여과하여 440nm에서 흡광도를 측정하여 시료 무첨가 대조구의 값과 비교하여 활성을 계산하였다 (Cho, 1999).
- Tyrosinase 저해활성은 농축 시료액 500 ㎖에 5 mM L- DOPA 0.2 ml, 0.1 M sodium phosphate 완충용액 (pH 6.0) 를 혼합한 후 tyrosinase 11 U을 첨가하여 35℃에서 2분간 반응시킨 다음 475nm에서 흡광도를 측정하여 시료액무첨가 대조구의 값과 비교하여 활성을 계산하였다(Sun and Cho, 1992).
- 법으로 각각 정량하였다. 또한 ß-glucan의 함량은 AOAC 분석 방법에 따라 실시하였고, 아미노산 조성은 상법에 따라 전처리 하고 Water Acc Q - Fluor™ 시약을 사용하여 유도체화 한 후 역상 HPLC로 분리한 다음 형광 검출기로 정 량하였다.
대상 데이터
- 농업과학기술원으로부터 31균주, 인천대학 버섯 종균은행에서 8균주, 일본 후쿠오카 임업 시험장에서 1 균주의 비늘버섯 자실체를 분양 받고 국내에서 23균주의 비늘버섯 자실체들을 수집하여 이들의 인공재배를 통하여 생산된 63주의 자실체들을 시료로 사용하였다.
- Louis, Mo, USA)제품을 사용하였다. 또한 fibrin, folin 시약, 1, 1 -diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), azocasein, DOPA, pyrogallol 등은 Sigma사(St. Louis, Mo, USA)제품을 사용하였고 그 밖에 각종 시약은 분석용 특급을 사용하였다.
- HMG-CoA reductase는 Purdue대학으로부터 분양받은 pKFT7-21 plasmid를 E. colt BL21(DE3)에 형질전환 시킨 후 배양하여 사용하였으며, elastase는 돼지로부터 생산된 Sigma사(St. Louis, Mo, USA)제품을 사용하였다. 또한 fibrin, folin 시약, 1, 1 -diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), azocasein, DOPA, pyrogallol 등은 Sigma사(St.
이론/모형
- 항산화 활성은 DPPH에 대한 환원력(전자공여능)을 이용하는 방법으로 측정하였다(Blois, 1998). 즉, 농축 시료액 0.
- SOD-유사활성은 Marklund and Marklund(1974)의 방법을 이용하여 먼저 농축 시료액 20 ㎖에 55 mM Tris- cacodylic acid 완충용액 (TCB, pH 8.2)를 가하여 균질화하고 원심분리하여 얻은 상등액을 pH 8.2로 조정한 후 TCB를 사용하여 50 ㎖로 조정하여 시료액으로 사용하였다. 시료액 950 ㎖에 50 ㎖ 24 mM pyrogallol을 첨가하여 420nm에서 초기 2분간의 흡광도 증가율을 측정하여 시료액 무첨가 대조구와 비교하여 활성을 계산하였다.
- 시료버섯의 단백질 함량은 AOAC법(Anonymous, 1990) 에 따라 Kjeldahl법으로 정량하였고 무기질은 회화 후 원자 흡광 분광분석기와 ICP로 분석하였으며 비타민 B|, B2 및 Niacin 함량은 Thiochrome 법, AOAC 방법 및 Koning reaction 법으로 각각 정량하였다. 또한 ß-glucan의 함량은 AOAC 분석 방법에 따라 실시하였고, 아미노산 조성은 상법에 따라 전처리 하고 Water Acc Q - Fluor™ 시약을 사용하여 유도체화 한 후 역상 HPLC로 분리한 다음 형광 검출기로 정 량하였다.
성능/효과
- 항산화 활성과 tyrosinase 저해활성은 각각 Pholiota sp. PSP-015 균주의 물 추출물과 P. nameko PNA-024의 메탄올 추출물이 각각 72.7%, 69.5%로 우수하였다. 그러나 SOD 유사활성과 elastase 저해활성은 대부분의 비늘버섯 추출물에서 미약하거나 없었다.
- 수집 및 분양 받아 본 연구에 공시한 비늘버섯 중 인공재배를 통하여 생산된 63 균주의 자실체에 대한 물과 메탄올 추출물들의 생리 기능성을 조사 한 결과 혈전용해 활성은 P. adiposa PAD-030 균주의 메탄올 추출물이 11.5 U로 제일 높은 활성을 보였고 R adiposa PAD-021 균주와 P. malicola PMA-001 균주의 메탄올 추출물 등에서 활성을 나타내었으나 종간 또는 종내 균주간에 큰 차이 없이 대체로 미약하거나 활성을 보이지 않았다(Table 1). 이 결과들은 잎새버섯이나 차가버섯 등의 혈전용해 활성(박 등, 2003)보다 높은 결과 이었고 버섯의 혈전용해 활성에 관한 연구로 김 등(2005)은 종이꽃낙엽버섯이 plasmin 0.
- 각종 비늘버섯 추출물들의 콜레스테롤 합성 경로에서 제일 중요한 반응 조절 효소인 HMG-CoA reductase에 대한 저해활성을 조사한 결과 P. adiposa PAD-022 균주의 메탄올 추출물이 76.8%로 가장 높은 활성을 보였고 P. adiposa PAD-035 균주와 P. nameko PNA-010 균주의 메탄올 추출물도 50% 이상의 비교적 높은 활성을 보였다. 또한, P.
- nameko PNA-010 균주의 메탄올 추출물도 50% 이상의 비교적 높은 활성을 보였다. 또한, P. adiposa에서는 PAD-006, 007과 014와 021 균주들이 30% 이상의 활성을 보였고 P. nameko에서는 PNA- 019의 메탄올 추출물에서 46.2%의 비교적 높은 활성을 보였으나 여타의 종에서는 없거나 20% 미만의 낮은 활성을 보여 본 생리 기능성 물질의 생성에 종간의 뚜렷한 특이성을 보였다. 이들 중, HMG-CoA reductase 저해 활성이 우수한 P.
- 항산화 활성은 Pholita sp. PSP-015 균주와 P. squarrosa PSQ-005, P. squarrosoides PSP-001 의 물 추출물에서 각각 72.7%, 71.1%, 71.8%의 비교적 높은 활성을 보였고 P. flammans PFL-001 균주의 메탄올 추출물에서도 70.8%의 높은 활성을 보였으며 종간에 큰 차이 없이 대부분의 비늘버섯 추출물에서 활성을 보였다. 따라서 대부분의 식물에 함유 되어 있으면서 항산화 활성을 나타내는 것으로 알려진 알칼로이드나 사포닌 계통의 물질(현 등, 2003)들이 비늘버섯에도 함유되어 있는 것으로 추정되어 현재 이들을 분리 , 정제 중에 있다.
- 1%를 보였고 Pholiota sp. PSP-010의 물 추출물에서 21.8%의 활성을 보였을 뿐 대체로 모든 비늘버섯의 추출물에서 elastase 저해활성이 없거나 10% 미만으로 낮았다.
- 4%로 비교적 높은 활성을 보였고, Pholiota sp. PSP- 001와 PSP-010 균주의 물 추출물에서도 63.9%와 60.9% 의 비교적 높은 활성을 보였다. 대체로 P.
- 9% 의 비교적 높은 활성을 보였다. 대체로 P. adiposa 균주들의 추출물들이 나머지 균주들의 추출물 보다 높은 활성을 보였고 메탄올 추출물 보다는 물 추출물에서 활성이 대부분 높았다.
- 이상의 실험결과들을 종합하여 볼 때 비늘버섯 추출물 전체 시료 중 /5 adiposa PAD-022 균주의 메탄올 추출물의 HMG-CoA reductase 저해 활성 이 76.8%로 가장 높아서 최종적으로 우수 비늘버섯 시료로 선발 하였다.
- 시료버섯의 영양성분을 분석한 결과 Table 2, 3과 같이조단백질 함량은 23.0%이었고 무기질에서는 K를 가장 많이(3197mg/lQ0g) 함유하고 있었으며, 비타민 B2는 2.64 mg/100 g, /Aglucan은 0.37土 0.04%를 함유 하고 있었다. 또한 아미노산에서는 아르기닌(420.
- 한편 최종 선발된 P. adiposa PAD-022 균주로부터 HMG- CoA reductase 저해물질의 최적 추출조건을 조사한 결과 Fig. 1과 같이 메탄올을 용매로 하여 30℃에서 12시간 추출하였을 때 가장 높은 HMG-CoA reductase 저해활성을 보였다.
- 생산하였다. 이들 자실체들의 물과 메탄올 추출물을 각각 제조한 후 각종 생리 기능성을 조사 한 결과, 혈전 용해 활성은 /! adiposa PAD-030 균주의 메탄올 추출물이 11.5 U, HMG-CoA reductase 저해활성은 50mM adiposa PAD-022 균주의 메탄올 추출물이 76.8%로 가장 높았다. 항산화 활성과 tyrosinase 저해활성은 각각 Pholiota sp.
후속연구
- 한편, 검은비늘버섯 adiposa)은 Strophariaceae 과에 속하는 버섯의 일종으로, 종간에 형태적으로 아주 유사하여 분류가 어렵고 특히 유용한 기능성 물질을 다량 함유하고 있는 것으로 알려지고 있으나 설사, 구토 등의 증상을 일으키는 독버섯인 땅비늘버섯(Pholita terrestris) 과 형태적으로 아주 유사하여 비전문가가 야생균주를 채취하여 이용하는 것은 대단히 위험하므로 이러한 비늘버섯의 정확한 분류와 재배기술의 개발 및 보급은 새로운 버섯의 다양한 종의 개발과 이용 측면에서 매우 중요한 과제라고 할 수 있다.
- 김 , 1998) 중의 혈전용해 효소의 정제 및 특성 연구, 최 등(1999)의 혈전용해능을 갖는 버섯류의 탐색, 김 등(1998)의 치악산버섯 추출물로부터 피부린 분해 활성의 검색 등이 있다. 이상의 연구보고들을종합하여 볼 때 비늘버섯을 포함하는 많은 버섯들이 혈전용해 물질을 갖고 있으며 따라서 새로운 기능성 식품의 중요한 재료로 버섯이 이용될 수 있을 것으로 사료된다.
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