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문제 정의
- 있다[20]. 특히 IL-10의 경우 세기관지염증을 줄여주는 역할을 한다고 알려져 있었으나[2이 최근 오히려 세기관지염증을 악화시킨다는 연구도 있에1W6] 본 연구에서는 천식 유발에 중요한 역할을 하는 IL-4와 IL-10을 제거한 IL-4 KO 마우스와 IL-10 KO 마우스를 이용하여 천식을 유발할 경우, 대조군과 비교했을 때 호산구의 증가와 폐조직의 변화양상에 미치는 영향을 살펴보았다. IL-4 KO 마우스와 IL-10 KO 마우스를 이용한 천식유발군의 경우 BALB/c 마우스를 이용한천식유발군보다 호산구의 증가 정도가 미약하게 관찰되었고, 폐조직 내 염증세포의 침윤 정도도 감소하였다.
제안 방법
- 이에 본 연구진은 일차로 BALB/C 마우스를 이용하여 항원으로 ovalbumin을 사용하여 천식을 유발하여 폐 내 세포 구성에 미치는 영향을 살펴보았고, 이차적으로 천식 발생에 중요한 역할을 하는 것으로 알려 진 IL-4와 IL-10 knock out (KO) BALB/c 마우스에서 천식을 유발하여 천식인자를 가진 개체에서의 반응과 천식관련인자가 결핍된 개체에서의 반응성의 차이와 IL-4 및 IL-10의 발현양상을 비교분석하였다.
- BALB/c 마우스는 (주)오리엔트바이오에서 생후 7주령 암컷을 구입하였으며, IL-4 KO 마우스와 IL-10 KO마우스는 한국생 명 공학연구원 에 서 분양받아 건국대 학교 수의과대학 동물실험실에서 사육한 후 실험에 사용하였다. 천식을 유발시키기 위해 실험 1일에 20 μg의 ovalbumin (Sigma)을 aluminum hydroxide를 부형제로 하여 PBS에 녹여 복강 내로 투여하여 14일 후 동일한 방법으로 다시 복강 내에 주입하여 재감작을 실시하였다. 실험 28일, 29일 및 30 일에 각기 30 ml PBS에 ovalbumin (1%)을 녹여 ultrasonic nebulizer (Sunrise medical, Pulmo-Aide®, LT compressor)를 사용하여 aerosol 상태로 만들어 하루에 20분씩 3번 감작시켰다(Fig.
- 천식을 유발시키기 위해 실험 1일에 20 μg의 ovalbumin (Sigma)을 aluminum hydroxide를 부형제로 하여 PBS에 녹여 복강 내로 투여하여 14일 후 동일한 방법으로 다시 복강 내에 주입하여 재감작을 실시하였다. 실험 28일, 29일 및 30 일에 각기 30 ml PBS에 ovalbumin (1%)을 녹여 ultrasonic nebulizer (Sunrise medical, Pulmo-Aide®, LT compressor)를 사용하여 aerosol 상태로 만들어 하루에 20분씩 3번 감작시켰다(Fig. 1). 실험 30일째 마지막으로 감작시킨 후 24시간 지나 안락사를 시켰고 실험에 필요한 시료들을 채취하였다.
- , Newark, DE) 염색을 실시하였다. 염색 후 세포구성비율을 현미경을 통하여 조사하였다.
- 파라핀 블록은 5 ㎛의 절편으로 만든 후 56°C incubator에 30분 처리하여 파라핀을 녹인 후 xylene으로 제거한다. 100%, 90%, 80%, 70% 알콜을 단계별로 거쳐 함수과정을 거친 후 조직의 내인성 peroxidase 활성을 제거하기 위해 0.3% H2O2 로 15분간 처리하였다. PBS로 washing 한 후 항체의 비특이성 결합을 억제하기 위해 3% bovine serum albumin (BSA)을 함유한 PBS 를 이용하여 1시간 동안 반응시켰다.
- PBS로 washing 한 후 항체의 비특이성 결합을 억제하기 위해 3% bovine serum albumin (BSA)을 함유한 PBS 를 이용하여 1시간 동안 반응시켰다. 이후 anti-mouse IL-4 (500 jtzg at 1 mg/lml, ENDOGENE®)와 anti-mouse IL-10 (500 μg at 0.5 mg/lml, Biolegend®)를 각각 1: 40으로 희석하여 4Y 에 24시간 처 리하였다. DAKO LSBA 2 kit로 이차 항체와 streptavidin-conjugated peroxidase (DAKO, Carpinteria, CA)을 부착시켰다.
- )를 사용하였다. Slide glass를 완전히 건조한 후 Harris's hematoxylin (Sigma Chemical Co.)으로 대조염색을 실시하였다[32].
- 이런 이유로 본 연구진은 BALB/c 마우스와 IL-4 KO 마우스 및 IL-10 KO 마우스에 복강 내로 ovalbumiri을 감작시킨 후 nebulizer를 이용하여 자발호흡을 통해 재감작하였다. 즉, 사람이 자연스런 상태에서 호흡을 통하여 천식 유발물질을 흡입하는 것처럼 실험동물이 호흡을 통해 ovalbumin 을 흡입할 수 있도록 하였다. 본 연구에서는 소량의 ovalbu- min을 비강내로 흡입시켜 이물성 반응으로 인한 호흡기 자극을 최소화하였고, 세기관지염증과 호산구의 증가를 유발하여 천식을 유발하는데 성공하였다.
- 본연구에서는 BALB/c 마우스와 IL-4 KO 마우스 및 IL-10 KO 마우스를 이용하여 천식을 유발한 후 기관지폐포 세척 술과 폐 조직의 H & E 염색을 통해 호산구의 증가와 침윤 정도를 측정하였고, 면역조직화학염색을 통해 천식관련 인자로 알려진 IL4와 IL-10의 발현을 관찰하였다. BALB/c 마우스를 이용한 천식유발군에서는 BAL 총세포수가 6배 이상 증가하였고, 호산구는 50% 이상 증가하였으며 천식관련 인자로 알려진 IL4 및 IL-10이 세기관지 주위와 폐간질 조직에서 양성으로 발현되어 본 연구에서는 ovalbumin의 자발적인 호흡을 통한 천식 유발에 성공하였음을 확인하였다.
- 본 연구진은 BALB/c 마우스를 이용하여 복강 내로 oval bumin 을 감작한 후, 소량의 ovalbumin의 자발적인 호흡을 통하여 천식을 유발하는데 성공하였다. IL-4 KO 마우스 및 IL-10 KO 마우스를 이용하여 천식을 유발시키고 BALB/c 마우스 천식유발군에서의 결과와 비교한 바, IL-4와 IL-10이 천식과 관련한 세기관지 염증을 악화시킬 수 있음을 확인하였다.
- 다른 앞선 연구자들에 의하여 실험동물을 이용한 다양한 천식모델이 개발되었지만, 천식 유발물질을 비강 내로 흡입시켜 천식을 유발한 연구는 거의 없었다. 이런 이유로 본 연구진은 BALB/c 마우스와 IL-4 KO 마우스 및 IL-10 KO 마우스에 복강 내로 ovalbumiri을 감작시킨 후 nebulizer를 이용하여 자발호흡을 통해 재감작하였다. 즉, 사람이 자연스런 상태에서 호흡을 통하여 천식 유발물질을 흡입하는 것처럼 실험동물이 호흡을 통해 ovalbumin 을 흡입할 수 있도록 하였다.
대상 데이터
- 천식유발은 BALB/c 마우스와 BALB/c IL-4 KO 마우스와 IL-10 KO 마우스를 대상으로 각 실험 군 당 12마리씩 사용하여 유발하였다. BALB/c 마우스는 (주)오리엔트바이오에서 생후 7주령 암컷을 구입하였으며, IL-4 KO 마우스와 IL-10 KO마우스는 한국생 명 공학연구원 에 서 분양받아 건국대 학교 수의과대학 동물실험실에서 사육한 후 실험에 사용하였다.
- 유발하였다. BALB/c 마우스는 (주)오리엔트바이오에서 생후 7주령 암컷을 구입하였으며, IL-4 KO 마우스와 IL-10 KO마우스는 한국생 명 공학연구원 에 서 분양받아 건국대 학교 수의과대학 동물실험실에서 사육한 후 실험에 사용하였다. 천식을 유발시키기 위해 실험 1일에 20 μg의 ovalbumin (Sigma)을 aluminum hydroxide를 부형제로 하여 PBS에 녹여 복강 내로 투여하여 14일 후 동일한 방법으로 다시 복강 내에 주입하여 재감작을 실시하였다.
- 1). 실험 30일째 마지막으로 감작시킨 후 24시간 지나 안락사를 시켰고 실험에 필요한 시료들을 채취하였다.
- DAKO LSBA 2 kit로 이차 항체와 streptavidin-conjugated peroxidase (DAKO, Carpinteria, CA)을 부착시켰다. 발색은 3, 3Z-diaminobenzidine (DAB, Sigma Chemical Co.)를 사용하였다. Slide glass를 완전히 건조한 후 Harris's hematoxylin (Sigma Chemical Co.
데이터처리
- 통계 프로그램인 SPSS (Ver 10.0 for windows)를 사용하여 실험설계에 대한 분산분석은 ANOVA로, 각 처치 군들 간의 비교는 Dunkun test를 실시하여 유의성을 검정하였다. 각자료는 3번 이상의 반복된 실험을 통하여 얻어진 결과를 평균 土 표준오차로 표시하였고, p값이 0.
- 0 for windows)를 사용하여 실험설계에 대한 분산분석은 ANOVA로, 각 처치 군들 간의 비교는 Dunkun test를 실시하여 유의성을 검정하였다. 각자료는 3번 이상의 반복된 실험을 통하여 얻어진 결과를 평균 土 표준오차로 표시하였고, p값이 0.05 이하인 경우 통계적 유의성이 있는 것으로 판정하였다.
이론/모형
- 기관지폐포 세척술은 Kagan [15] 등이 실시한 방법을 따랐으며, 수집된 세포는 1000 rpm에서 10분간 원심 분리를 실시하였다. 기관지 폐포 세척술로 수집된 세포를 원심분리 후, 폐세포들은 Cytospin® 3 cytocentrifuge (Shandon, Pittsburgh, P시을 사용하여 slide glass위에 부착하였다.
성능/효과
- Ovalbumin으로 천식을 유발한 실험군에 있어서는 특히 대조군에서는 발현되지 않았던 호산구의 경우 56.90±11.2% 로 50% 이상 증가하였으며, 림프구의 경우 7.70+1.3%, 호중구의 경우 0.20±0.4%로 증가하여 천식의 특징인 염증세포의 증가와 호산구의 증가가 두드러지게 나타났다.
- 2%가 출현하여 호산구성 천식의 특징이 잘 나타났다(Table 3). 호중구의 출현양상은 대조군를 이용한 천식 유발 군과 비교했을 때 IL-4 KO 마우스와 IL-10 KO 마우스를 이용한 천식유발군에서 각각 3.3±2.8%에서 20.9±10.4%로, 0.1±0.1%에서 13.4±4.7%로 상대적으로 크게 상승하여 통계학적 유의함을 확인할 수 있었다(P<0.01).
- 수 있었다. 천식유발군의 폐포대식세포의 경우, 세포질이 커져 있고, 세포질내 공포가 생기는 등 활성화되어 있는 것을 관찰할 수 있었다 (Fig. 2). 대조군의 폐조직 H&E 염색상에서도 특이점이 없었으나 천식유발군에서는 세기관지 주위와 기도 상피 기저부위에 많은 염증세포들과 섬유소가 밀집해있는 것을 관찰할 수 있었으며 기도 상피가 비후된 모습을 관찰할 수 있었다(Fig.
- 2). 대조군의 폐조직 H&E 염색상에서도 특이점이 없었으나 천식유발군에서는 세기관지 주위와 기도 상피 기저부위에 많은 염증세포들과 섬유소가 밀집해있는 것을 관찰할 수 있었으며 기도 상피가 비후된 모습을 관찰할 수 있었다(Fig. 2). 즉, BALB/c 마우스에 ovalbumin을 복강 내 주입하여 감작시킨 후 비강흡입에 의해 천식을유발시켰을 경우 기관지폐포 세척액과 폐조직의 염색 결과를 대조군과 비교분석한 결과 천식이 성공적으로 유발되었음을 확인할 수 있었다.
- 2). 즉, BALB/c 마우스에 ovalbumin을 복강 내 주입하여 감작시킨 후 비강흡입에 의해 천식을유발시켰을 경우 기관지폐포 세척액과 폐조직의 염색 결과를 대조군과 비교분석한 결과 천식이 성공적으로 유발되었음을 확인할 수 있었다.
- IL-4 KO 마우스를 이용한 천식유발군에서는 전체 세포의 구성비에서 폐포대식세포가 약 60%, 호중구가 약 20%, 호산구가 약 7.2%, 림프구가 약 12%의 비율로 관찰되었다(Table 2). BALB/c 마우스를 이용한 천식유발군의 경우 호산구가 약 56%를 차지한 것에 비해 IL-4 KO 마우스를 이용한 천식유발군의 경우 7.
- 2%, 림프구가 약 12%의 비율로 관찰되었다(Table 2). BALB/c 마우스를 이용한 천식유발군의 경우 호산구가 약 56%를 차지한 것에 비해 IL-4 KO 마우스를 이용한 천식유발군의 경우 7.2%로 현저히 낮게 발현되는 것을 확인할 수 있었다(Table 1).
- IL-10 KO 마우스의 경우 전체 세포의 구성비에서 폐포대식세포가 약 92%, 림프구가 약 7%로 관찰되었고, IL-10 KO 마우스를 이용한 천식 유발군에서는 전체세포의 구성비에서 폐포대식세포가 약 72%, 호중구가 약 13%, 호산구가 약 5.4%, 림프구가 약 8%의 비율로 관찰되었다(Table 3). 즉, IL-10 KO 마우스의 경우 호산구는 전혀 관찰할 수 없었고, 호중구는 매우 낮은 비율로 관찰할 수 있었으나 IL-10 KO 마우스를 이용한 천식유발군에서는 호산구와 호중구가 높은 비율로 출현하였으며, 출현정도는 IL-4 KO 마우스를 이용한천식유발군보다 낮았다.
- 4%, 림프구가 약 8%의 비율로 관찰되었다(Table 3). 즉, IL-10 KO 마우스의 경우 호산구는 전혀 관찰할 수 없었고, 호중구는 매우 낮은 비율로 관찰할 수 있었으나 IL-10 KO 마우스를 이용한 천식유발군에서는 호산구와 호중구가 높은 비율로 출현하였으며, 출현정도는 IL-4 KO 마우스를 이용한천식유발군보다 낮았다.
- IL-4 KO 마우스와 IL-10 KO 마우스의 경우에도 세기관지 상피세포 및 결합조직의 비대나 분화가 없고, 결합조직에서도 염증세포의 출현이 관찰되지 않는 정상적인 소견을 보였다. 그러나 천식유발군의 경우 기관지상피세포의 과다한 비대와 기저세포층의 분화 및 천식증상 특유의 호산구의 출현이 결합조직에서 관찰되었다(Fig.
- 광학현미경적 소견으로는 BALB/c 마우스의 대조군과 형질전환 마우스의 차이를 구분할 수 없었으나, 공통적으로 천식 유발 군의 경우 결합조직에 뚜렷한 호산구의 출현을 관찰할 수 있었다.
- BALB/c 마우스의 경우 대조군에서는 염증세포의 세포질 내에 IL-4가 생성된 것을 확인할 수 없었으나 천식을 유발한 실험군에서는 기도 주위, 기도 기저막부위의 염증세포가 군집해 있는 곳에서 강하게 발현되는 것을 관찰할 수 있었다. 또한 혈관주위와 폐포 주위에 있는 폐포대식세포도 세포질 내에 IL-4가 많이 형성되어 면역조직화학염색에 대해 강하게 반응한 것을 확인할 수 있었다(Fig.
- 있었다. 또한 혈관주위와 폐포 주위에 있는 폐포대식세포도 세포질 내에 IL-4가 많이 형성되어 면역조직화학염색에 대해 강하게 반응한 것을 확인할 수 있었다(Fig. 5).
- IL-10 KO 마우스의 경우 IL-4 KO 마우스와 마찬가지로 IL4에 양성을 띠는 세포를 관찰할 수 없었으나, 천식 유발 군의 경우 IL-4 KO 마우스보다 IL-4에 양성을 띠는 세포를 현미경 검사를 통해 확인할 수 있었다(Fig. 5).
- BALB/c 마우스의 경우 대조군에서는 양성반응을 확인할 수 없었으나, 천식유발군에서는 IL-lOo] IL-4의 경우보다 세기관지 기저막하 및 폐포대식세포에서 아주 강하게 발현되었음을 확인할 수 있었다(Fig. 6).
- IL-4 KO 마우스의 경우에도 대조군에서는 IL-10에 대한 양성반응을 나타내는 세포를 찾아볼 수 없었으나, 천식 유발 군에서는 아주 뚜렷하게 발현됨을 확인할 수 있었다. IL-4 KO 마우스에 천식을 유발시킨 실험군의 경우, IL~4에 양성반응을 보이는 염증세포가 다수 관찰되었다(Fig.
- 천식유발과정에 중요한 하나의 인자로 작용하는 IL-10에대한 면역염색결과, 대조군에서는 염증성 세포의 세포질 내에 IL-10에 대한 양성반응을 확인할 수 없었으나 천식 유발 군에서는 강하게 발현하는 것을 관찰할 수 있었다.
- 즉, 사람이 자연스런 상태에서 호흡을 통하여 천식 유발물질을 흡입하는 것처럼 실험동물이 호흡을 통해 ovalbumin 을 흡입할 수 있도록 하였다. 본 연구에서는 소량의 ovalbu- min을 비강내로 흡입시켜 이물성 반응으로 인한 호흡기 자극을 최소화하였고, 세기관지염증과 호산구의 증가를 유발하여 천식을 유발하는데 성공하였다.
- 본연구에서는 BALB/c 마우스와 IL-4 KO 마우스 및 IL-10 KO 마우스를 이용하여 천식을 유발한 후 기관지폐포 세척 술과 폐 조직의 H & E 염색을 통해 호산구의 증가와 침윤 정도를 측정하였고, 면역조직화학염색을 통해 천식관련 인자로 알려진 IL4와 IL-10의 발현을 관찰하였다. BALB/c 마우스를 이용한 천식유발군에서는 BAL 총세포수가 6배 이상 증가하였고, 호산구는 50% 이상 증가하였으며 천식관련 인자로 알려진 IL4 및 IL-10이 세기관지 주위와 폐간질 조직에서 양성으로 발현되어 본 연구에서는 ovalbumin의 자발적인 호흡을 통한 천식 유발에 성공하였음을 확인하였다.
- 특히 IL-10의 경우 세기관지염증을 줄여주는 역할을 한다고 알려져 있었으나[2이 최근 오히려 세기관지염증을 악화시킨다는 연구도 있에1W6] 본 연구에서는 천식 유발에 중요한 역할을 하는 IL-4와 IL-10을 제거한 IL-4 KO 마우스와 IL-10 KO 마우스를 이용하여 천식을 유발할 경우, 대조군과 비교했을 때 호산구의 증가와 폐조직의 변화양상에 미치는 영향을 살펴보았다. IL-4 KO 마우스와 IL-10 KO 마우스를 이용한 천식유발군의 경우 BALB/c 마우스를 이용한천식유발군보다 호산구의 증가 정도가 미약하게 관찰되었고, 폐조직 내 염증세포의 침윤 정도도 감소하였다. 천식 매개 인자인 IL-4와 IL-10의 면역조직화학염색 결과에서도 양성반응이 거의 나타나지 않았다.
- 천식 매개 인자인 IL-4와 IL-10의 면역조직화학염색 결과에서도 양성반응이 거의 나타나지 않았다. 본 연구 결과, IL-10이 IL4와 같이 천식과 관련하여 세기관지 염증 반응을 증가시키는 역할을 하는 것으로 생각된다.
- 천식을 유발하는데 성공하였다. IL-4 KO 마우스 및 IL-10 KO 마우스를 이용하여 천식을 유발시키고 BALB/c 마우스 천식유발군에서의 결과와 비교한 바, IL-4와 IL-10이 천식과 관련한 세기관지 염증을 악화시킬 수 있음을 확인하였다. 이는 IL-4와 IL-10의 발현을 억제할 경우 천식과 관련한 세기관지 염증을 개선시킬 수 있음을 의미하며, IL-4와 IL-10 에 대한 항체요법이 천식의 치료에 쓰일 가능성을 시사한다.
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