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문제 정의
- 그러나 외부에서 옥신을 처리하면 안으로 굽어지는 반응이 나타나는데, 그 반응 정도는 옥신 농도에 따라 변화하였다. 본 연구에서는 옥신에 의하여 자엽초 박편이 안으로 굽어지는 현상을 옥신과 함께 작용하는 물질들을 선별하기 위한 실험에 이용하였다. 옥수수 자엽초의 메탄올 추출물로부터, 옥신에 의해 안으로 굽어지는 자엽초 박편의 반응을 촉진하는 활성을 발견하였다.
- 예를 들어 선량 반응곡선이 좌측(저농도 즉)으로 이동하면 수용체의 친화도가 증가한 것이며, 좌우 이동 없이 곡선이 위로 이동하는 것은 수용체 이후 단계의 작용이 촉진되어 작용이 증폭되는 것이다[27]. 옥수수의 메탄올 추출물이 어떠한 방식으로 옥신작용에 영향을 미치는지 확인하고자 옥신의 선량반응곡선에 대한 추출물의 효과를 조사하였다(Fig. 5). 옥수수 자엽초의 메탄올 추출물은 옥신의 선량반응곡선을 좌우로 이동시키지 않았으며, 옥신이 존재하지 않을 때에는 아무런 촉진효과가 없었고, 고농도(10 liM IAA)의 옥신이 존재할 때 현저한 옥신반응 촉진효과가 나타났다.
제안 방법
- 본 연구에서는 옥신에 의하여 자엽초 박편이 안으로 굽어지는 현상을 옥신과 함께 작용하는 물질들을 선별하기 위한 실험에 이용하였다. 옥수수 자엽초의 메탄올 추출물로부터, 옥신에 의해 안으로 굽어지는 자엽초 박편의 반응을 촉진하는 활성을 발견하였다. 이러한 촉진 활성은 에너지원과 관련된 현상은 아니었다.
- 5)에 띄워 실험 목적에 필요한 시간만큼 25℃ 조건하에서 진탕배양 하였다(30 cycles/min). 배양 후 조직이 굽어진 각도를 측정하였으며, 밖으로 굽어지는 각도를 (+), 안으로 굽어지는 각도를 (-)로 표시하여 방향성을 구분하였다.
- 5일된 옥수수 자엽초와 중배축 사이의 마디를 잘라 자엽초와 내부의 잎을 포함하는 부위를 그대로 100% 메탄올에 담가 24시간 동안 4℃에서 추출하거나, 조직을 액체질소 존재하에 분쇄하여 100% 메탄올로 추출하였다. 이렇게 얻은 시료를 13, 000 rpm에서 30분간 원심분리하여 (Sorvall, GSA rotor) 입자 성분을 제거한 다음, 정제 과정에 재료로 사용하였다.
- 용리된 시료는 N2 가스 흐름하에 농축하였으며, 시료의 양이 많을 때에는 다시 일회용 C18 컬럼에 흡착한 후 100% acetonitrile로 용리하여 N? 가스흐름으로 농축하였다. HPLC 분석을 위하여는 동일한 Nucleosil RP-C18 분석용 컬럼을 사용하였으며 유속은 동일하게 0.8 ml/min으로 조절하였다. 메탄올 농도는 50분간 40%에서 95%까지 직선적으로 높여가며 시료를 용리하였고, 용액의 pH를 낮추기 위해 0.
- 3% acetic acid를 사용하였다. 메탄올에 의해 용리되어 나오는 물질은 photodiode array de- tector로 측정하였다.
- 옥수수 자엽초 박편을 완충용액에 배양하면 밖으로 굽어지는 반면, IAA (indole-3-acetic acid)를 처리하면 이에 반응하여 자엽초 박편이 안쪽으로 굽어지는 현상을 확인하였다 (Fig. 2). 이 반응은 IAA 처리 후 약 24시간까지 진행되었으며, 24시간 이후에는 새로운 IAA 용액을 가해주어도 더 이상의 반응이 진행되지 않았다.
- 옥수수에 옥신에 의한 자엽초 박편의 굽어짐 반응을 촉진하는 물질이 존재하는지 확인하기 위해 메탄올로 옥수수 자엽초를 추출하여 옥신 존재 하에 자엽초 박편에 처리하였다. 그 결과 옥수수 추출물에 의한 옥신반응 촉진 효과를 발견하였다(Fig.
- 또한 옥수수 자엽초 박편의 옥신반응을 촉진하는 물질은 옥수수 뿐 아니라 호박 하배축의 메탄올 추출물에도 포함되어 있으므로(Park, unpublished) 옥신 반응촉진물질이 단자엽 식물과 쌍자엽 식물을 포함하는 식물군에 널리 존재할 것이라 생각되었다. 옥수수에서 얻은 메탄올 추출물의 농도를 ml 당 추출물이 유래한 조직의 fresh weight로 표시하여 0%에서부터 5%까지 높여가며 옥신에 의한 옥수수 자엽초 박편의 굽어짐 반응에 대한 영향을 조사했는데, 이때 추출물의 촉진효과는 약 2.5% g.f.w/ml) 이상에서 포화되었다 (Fig. 4). 시간별로 추출물의 옥신반응 촉진효과를 조사했을 때에는 추출물 처리 후 4시간 정도에 이미 촉진 효과가 관찰되었다.
- C18컬럼으로부터의 용리조건을 찾기 위하여 메탄올 농도를 30%부터 100%까지 10%씩 단계적으로 올려가며 1.5 ml의 용액으로 용리하고 이들 분획의 활성을 조사하였다. 그 결과 옥신에 의한 굽어짐 반응을 촉진하는 물질은 50% 메탄올에 의해 용리되는 것과 80% 이상의 메탄올에 의해 용리되는 2 가지가 있음을 확인하고(Fig.
- CEF-2 분획에 들어있는 활성 물질을 순수 분리하기 위해 부분 정제된 시료인 CEF-2를 Nucleosil RP-Cw컬럼에 유입하여 흡착하고 산성 조건에서(0.3% acetic acid) 50분간 메탄올 농도를 40%에서부터 95%까지 직선적으로 높여가며 용리하였다(Fig. 7). 이때 각 분획을 매 1분 간격으로 받아 옥수수자엽초 박편의 옥신에 의한 굽어짐 반응을 촉진하는 활성을 조사한 결과, 36분 이후에 용리되는 분획물이 활성을 지니고 있는 것으로 확인되었다(Fig.
- 5)으로 평형시켜 준비하였다. 준비된 시료에 1 M Tris 용액을 첨가하여 pH를 9.5 로 조절한 후 G8 컬럼에 유속 5 ml/min로 유입하여 흡착시키고 여러 농도의 메탄올 용액으로 용출 시험한 뒤 50%, 80% 용리 조건을 확립하였다. 용리된 시료는 N2 가스 흐름하에 농축하였으며, 시료의 양이 많을 때에는 다시 일회용 C18 컬럼에 흡착한 후 100% acetonitrile로 용리하여 N? 가스흐름으로 농축하였다.
대상 데이터
- 일회용 Cis 컬럼 (Waters, No 051910)을 컬럼 부피의 3-5배에 해당하는 100% 메탄올로 세척한 후 다시 5배 부피에 해당하는 20 mM Tris 완충용액 (pH 9.5)으로 평형시켜 준비하였다. 준비된 시료에 1 M Tris 용액을 첨가하여 pH를 9.
- 6), 이들을 각각 Curvature- Enhancing Factor-1 (CEF-1)과 Curvature-Enhancing Factor- 2 (CEF-2)라 명명하였다. 또 Nucleosil RP-Qs 분석용 HPLC 컬럼에서도 50분간 25%에서 95%까지 메탄올 농도를 직선적으로 증가시키며 용리했을 경우에도 일회용 C18컬럼을 사용했을 때와 동일하게 50% 메탄올과 80% 이상의 메탄올에 의해 용리되는 2개의 분획에서 활성이 나타났으므로(data not shown), 이후 모든 분리단계에서 CEF-1과 CEF-2를 부분 정제된 활성 물질로 사용하였다. CEF-1과 CEF-2가 시간별로 자엽초 박편의 굽어짐 반응에 미치는 영향을 조사하였는데, CEF-1 과 CEF-2의 작용 시간은 차이가 없었다(data not shown).
성능/효과
- 불리는 생장 억제 물질이 존재한다[6-8]. 이 물질은 그 생장억제 효과가 알려지기 이전에 이미 식물에서 준비한 막 vesicle에 옥신이 특이적으로 결합하는 것을 방해하는 물질, 이른바 supernatant factor로 분리되었으몌9], 구조와 활성을 비교, 조사한 결과 이 물질이 옥신작용을 억제하는데에 6 번 탄소에 붙어있는 측쇄가 중요한 기능을 하는 것으로 알려졌다.0].
- 관하여는 자세히 알려진 바가 없었다. 본 연구에서는 옥수수 자엽초에 옥신의 작용을 촉진하는 물질들이 존재한다는 것을 확인하였으며, 화학 구조 분석에 필요한 정제 조건을 확립하였다.
- 처리하였다. 그 결과 옥수수 추출물에 의한 옥신반응 촉진 효과를 발견하였다(Fig.)3). 이러한 효과가 추출물이 옥신의 분해를 억제하여 결과적으로 배양액 내의 옥신 함량을 높여줌으로써 촉진효과를 나타내었는지 확인하고자, 옥수수 자엽초의 추출물에 의하여 옥신반응이 촉진된 처리구의 배양용액을 채취하여 그에 포함된 옥신 함량을 측정하였지만 옥수수 추출물 처리구에서 옥신 함량이 증가했다는 증거는 찾을 수 없었다 (data not shown).
- 이러한 효과가 추출물이 옥신의 분해를 억제하여 결과적으로 배양액 내의 옥신 함량을 높여줌으로써 촉진효과를 나타내었는지 확인하고자, 옥수수 자엽초의 추출물에 의하여 옥신반응이 촉진된 처리구의 배양용액을 채취하여 그에 포함된 옥신 함량을 측정하였지만 옥수수 추출물 처리구에서 옥신 함량이 증가했다는 증거는 찾을 수 없었다 (data not shown). 또한 옥수수 자엽초 박편의 옥신반응을 촉진하는 물질은 옥수수 뿐 아니라 호박 하배축의 메탄올 추출물에도 포함되어 있으므로(Park, unpublished) 옥신 반응촉진물질이 단자엽 식물과 쌍자엽 식물을 포함하는 식물군에 널리 존재할 것이라 생각되었다. 옥수수에서 얻은 메탄올 추출물의 농도를 ml 당 추출물이 유래한 조직의 fresh weight로 표시하여 0%에서부터 5%까지 높여가며 옥신에 의한 옥수수 자엽초 박편의 굽어짐 반응에 대한 영향을 조사했는데, 이때 추출물의 촉진효과는 약 2.
- 5). 옥수수 자엽초의 메탄올 추출물은 옥신의 선량반응곡선을 좌우로 이동시키지 않았으며, 옥신이 존재하지 않을 때에는 아무런 촉진효과가 없었고, 고농도(10 liM IAA)의 옥신이 존재할 때 현저한 옥신반응 촉진효과가 나타났다. 따라서 옥수수 추출물은 조직의 옥신 감지에 대한 감수성을 증가시키는 것이 아니라 동일한 감수성을 유지한채 반응의 정도를 강화하는 것으로 판단되었다.
- 옥수수 자엽초의 메탄올 추출물은 옥신의 선량반응곡선을 좌우로 이동시키지 않았으며, 옥신이 존재하지 않을 때에는 아무런 촉진효과가 없었고, 고농도(10 liM IAA)의 옥신이 존재할 때 현저한 옥신반응 촉진효과가 나타났다. 따라서 옥수수 추출물은 조직의 옥신 감지에 대한 감수성을 증가시키는 것이 아니라 동일한 감수성을 유지한채 반응의 정도를 강화하는 것으로 판단되었다.
- 옥신반응 촉진 물질을 부분 정제하는 조건을 찾기 위해 pH 5, pH 7, pH 10, pH 11에서 일회용 C18컬럼을 평형시켜시료를 흡착하고 100% 메탄올로 용리한 결과, 모든 pH에서 활성물질이 G8컬럼에 흡착되는 것을 발견하였다(data not shown). 따라서 활성 물질은 pH 의 변화에 의하여 이온화되지 않는 물질일 것으로 추정되었다.
- 5 ml의 용액으로 용리하고 이들 분획의 활성을 조사하였다. 그 결과 옥신에 의한 굽어짐 반응을 촉진하는 물질은 50% 메탄올에 의해 용리되는 것과 80% 이상의 메탄올에 의해 용리되는 2 가지가 있음을 확인하고(Fig. 6), 이들을 각각 Curvature- Enhancing Factor-1 (CEF-1)과 Curvature-Enhancing Factor- 2 (CEF-2)라 명명하였다. 또 Nucleosil RP-Qs 분석용 HPLC 컬럼에서도 50분간 25%에서 95%까지 메탄올 농도를 직선적으로 증가시키며 용리했을 경우에도 일회용 C18컬럼을 사용했을 때와 동일하게 50% 메탄올과 80% 이상의 메탄올에 의해 용리되는 2개의 분획에서 활성이 나타났으므로(data not shown), 이후 모든 분리단계에서 CEF-1과 CEF-2를 부분 정제된 활성 물질로 사용하였다.
- 7). 이때 각 분획을 매 1분 간격으로 받아 옥수수자엽초 박편의 옥신에 의한 굽어짐 반응을 촉진하는 활성을 조사한 결과, 36분 이후에 용리되는 분획물이 활성을 지니고 있는 것으로 확인되었다(Fig. 8). 용리양상을 분석하여 280 nm에서의 흡광도를 시간에 따라 표시하였을 때 활성을 나타내는 피크는 다른 물질들에 비하여 매우 작아서 이 활성 물질의 농도는 매우 낮음을 알 수 있었다.
- 8). 용리양상을 분석하여 280 nm에서의 흡광도를 시간에 따라 표시하였을 때 활성을 나타내는 피크는 다른 물질들에 비하여 매우 작아서 이 활성 물질의 농도는 매우 낮음을 알 수 있었다.
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