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문제 정의
- 특히, 여러 오갈피 중에서 항산화활성을 가지는 eleutheroside B가 가시오갈피(4 se#)와 섬오갈피(4 #vam#)에 존재하는 것이 보고 된 바 있다. 따라서 본 연구는 섬오갈피의 뿌리와 줄기 '추출물의 산화적 스트레스에 대한 보호효과에 대해 살펴보고자 하였다.
제안 방법
- HDFs의 Oxidative Stress 유도 후 세포 생존율 및 형태학적 관찰 -각종 환경스트레스를 받으면 생체내의 산소는 유해한 O2~, H2O2, 'OH 등으로 변환되는데 이러한 스트레스 하에서 사람의 정상 피부 세포에 대한 섬오갈피 추출물의 효능을 관찰해 보고자 세포 생존율과 형태학적 관찰을 하였다(Fig. 3). 그 결과 HDFs의 세포 생존율은 H2O2 단독 처리군에 비해 hk>2 처리 후 섬오갈피 줄기 추출물(0.
- Human Diploid Fibroblasts (HDFs)의 세포 생존율 - 96-well plate에 HDFs를 1.5 x 1(/개/well씩 접종하여 24시간 배양한 후, 섬오갈피 추출액의 최종 농도가 각각 0.01, 0.1, Img/mZ 되도록 가하여 DMEM/F12 배지에서 72시간 배 양하였다. MTT 용액 50 µ/(5 mg/mZ)씩 첨 가하고 4시 간 후 원심 분리 하여 상등액을 제거 하고 DMSO 50 µ씩 첨가한 후 570nm에서 ELISA reader로 흡광도를 측정하였다.
- 1, Img/mZ 되도록 가하여 DMEM/F12 배지에서 72시간 배 양하였다. MTT 용액 50 µ/(5 mg/mZ)씩 첨 가하고 4시 간 후 원심 분리 하여 상등액을 제거 하고 DMSO 50 µ씩 첨가한 후 570nm에서 ELISA reader로 흡광도를 측정하였다.세포생존율(%)은 다음과 같은 식으로 계산하여 나타내었다.
- 섬오갈피 추출 -섬오갈피의 줄기와 뿌리를 완전히 건조한 후 건조중량(각 10 g)에 대하여 추출용매 80% MeOH을 10배 부피량 가한다음 실온에서 7일간 3회 반복 냉침 추출하였다. 각각의 추출액은 감압 농축한 후 동결 건조하여 얻어진 추출물(줄기 0.
- 진행됨은 이미 보고 되었다. 섬오갈피의 줄기와 뿌리 추출물에 대한 항산화능의 정도를 DPPH에 대한전자공여 능(electron donating ability, EDA %)으로 측정하여 대조군의 흡광도(control O.D)를 50% 감소시키는데 필요한 시료의 양(IC50)을 측정하였다. 섬오갈피의 줄기 및 뿌리 추출물의 DPPH 소거능력에 대한 IC%은 각각 58.
- lmgmZ)을 함유하는 DMEM/F12 배지에서 48시간 배양하였다. 세포 생존율의 분석은 앞선 실험과동일하였으며 이미지 분석은 Leica Qwin Image Processing & Analysis System으로 세포 형태를 관찰하였다.
- Voltex mixei로 10초간 진탕 후 37℃에서 30분 동안 반응시킨 후 spectrophotometer를 이용하여 520nm에서 흡광도를 측정하였다. 양성 대조물로는 L- ascorbic acid를 조제하여 측정하였다.'"
- 5 X lb개/«11씩 접종하여 24시간 배양하여 안정화하였다. 여기에 1 mM HR를 2시간 처리하여 산화적 스트레스 조건을 유도하였다. 그 후 혈청이 포함되지 않으면서 섬오갈피 추출액(O.
- 인체 피부 일차 세포의 분리 및 배양 -포피조직의 표피와 진피를 분리 후, 진피에서 섬유아세포를 분리하여 형태를 확인하였다. 확인된 섬유아세포(Human diploid fibroblasts, HDFs)를 DMEM/F12(3:1) 배지에 10% FBS, 1% penicillinstreptomycine- 가하여 25 cm2 조직 배양 flask 내에서 배양기 내부 공기 5% CO2 농도로 37℃에서 3-5일간 안정화하였다.
- 인체 피부 일차 자극 실험 -섬오갈피 줄기와 뿌리 추출물의 인체 피부 일차 자극 실험을 수행하였다. 일반적으로인 체 첩포시험은 피부 일차자극을 평가하는 방법으로 통상 홍반, 부종, 수포 등의 유발 정도를 평가한다.
- 1%) 각각을 20 #을 적하 시킨 후 시험부위인 우측 상완 내측에 첩포 검사를 실시하였다. 첩포는 24시간 폐첩포한 후 첩포를 제거하여 펜으로 시험부위를 표시하여 30분, 24시간, 48시간 후에 각 시험 부위의 피부반응을 관찰하여 국제 접촉 피부염 연구회 (International Contact Dermatitis Research Group; ICDRG>의 규정에 따라 판정하였다.
- 일반적으로인 체 첩포시험은 피부 일차자극을 평가하는 방법으로 통상 홍반, 부종, 수포 등의 유발 정도를 평가한다. 피부 일차 자극 정도는 Mean score의 수치에 따라 크게 5개의 grade [0-0.75(Grade I, no irritation), 0.76-1.50(Grade Ⅱ, slight irritation), 1.51-2.50(Grade Ⅲ, moderate irritation), 2.51- 5.00(Grade IV, strong irritation), 5.00-(Grade V, severeirritation)]로 나누어 평가하였다. 인체 피부 일차 자극 시험을 수행한 결과를 Table I에서 보듯이 섬오갈피의 뿌리 추출물에서 피험자 2명에게서 의양성이 보였으나, 24시간 후자극을 관찰할 수 없었다.
- 건강한 20-30대 여성 20명을 대상으로 CTFA 가이드라인(The Cosmetic Toiletry and Fragrance Association, Safety Testing Guideline)에 따라 실시하였다. 핀 챔버 (Finn Chamber)에 준비된 섬오갈피 추출물(0.01, 0.1%) 각각을 20 #을 적하 시킨 후 시험부위인 우측 상완 내측에 첩포 검사를 실시하였다. 첩포는 24시간 폐첩포한 후 첩포를 제거하여 펜으로 시험부위를 표시하여 30분, 24시간, 48시간 후에 각 시험 부위의 피부반응을 관찰하여 국제 접촉 피부염 연구회 (International Contact Dermatitis Research Group; ICDRG>의 규정에 따라 판정하였다.
대상 데이터
- 건강한 20-30대 여성 20명을 대상으로 CTFA 가이드라인(The Cosmetic Toiletry and Fragrance Association, Safety Testing Guideline)에 따라 실시하였다. 핀 챔버 (Finn Chamber)에 준비된 섬오갈피 추출물(0.
- 9 µg/mQ]었다. 대조군으로 사용된 L-ascorbic acid 는 IC50이 17.6|ig/m/으로 이들 추출물들은 대조군에 비해 radical 소거능력이 낮았다. 하지만, 섬오갈피 추출물의 free radical 소거능력은 뿌리보다 줄기에서 보다 효과적임을 알 수 있었다.
- 시약-DPPH, SOD, MTT, DMSO 등은 Sigma사의 제품을, SOD assay kite Dojindo사(일본) 제품을, 기타 용매는 덕산과학의 제품을 사용하였고, 세포 배양 시 사용된 DMEM,F12 nutrient mixture, keratinocyte SFM, FBS, antibiotics,Dispase는 Gibco사의 제품을 사용하였다. 기타 세포배양에 필요한 기구는 Falcon사의 제품을 사용하였다.
- 실험재료-섬오갈피(4 koreanum Nakai)는 제주도 탐라야채마을 영농조합법 인에서 구입하여 사용하였으며, 사람 정상 섬유아세포는 경기도 부천시 중동 비뇨기과의 원에서 환자의 동의 하에 포경 수술시 폐기되는 포피 조직을 적출 직후 4℃ DMEM 배지에 보관된 상태로 3시간 이내에 공급받아 세포를 분리하여 사용하였다.
데이터처리
- Data 분석 -실험은 3회 이상 실시하여 그 평균값을 기초로 mean ± S.E로 표시하였으며, Student's /-test를 시행하여 p<0.05인 경우 유의성이 있는 것으로 판단하였다.
- koreanum extract on the oxidative stress. Results were expressed as the average of triplicate samples with S.D. #pvO.05, ##p<0.01 and ###p<0.001 compared with the control group by Student's r-test. a: Non-treated, b: Only treated H2O2, c and d: After H2O2 treated, A.
- koreanum extracts. Results were expressed as the average of triplicate samples with S.D. *p<0.05, **p<0.01 and ***p<0.001 compared with the control group by Student's t-test.
이론/모형
- Super Oxide Dismutase (SOD) 활성 측정 -시료를 각 농도별로 조제한 다음 Dojindc사의 SOD assay kit-WST를 이용하여 Dojindo사에서 제공하는 사용법에 따라 측정하였다. 반응 후 s* pectrophotometer 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 제품을 사용하였고, 세포 배양 시 사용된 DMEM,F12 nutrient mixture, keratinocyte SFM, FBS, antibiotics,Dispase는 Gibco사의 제품을 사용하였다. 기타 세포배양에 필요한 기구는 Falcon사의 제품을 사용하였다.
성능/효과
- koreanume 비롯하여 10종 3품종이 있다.'2)이들 중 섬오갈피는 해발 500m 아래의 제주도 전역에 분포하고 있고, 실생 또는 삽목 번식이 쉬운 식물이다. 우리나라에서는 Acanthopanax 속 식물의 근피와 수피를 오갈피라고 하여 한약재로 사용되어 왔다.
- 인체 피부 일차 자극 시험을 수행한 결과를 Table I에서 보듯이 섬오갈피의 뿌리 추출물에서 피험자 2명에게서 의양성이 보였으나, 24시간 후자극을 관찰할 수 없었다. ICDRG의 판정 기준에 따라 피부 자극 유발 가능성의 평가를 계산식으로부터 계산한 결과 줄기 및 뿌리 추출물 각각 0.01%와 0.1%에서 피부 일차 자극 정도가 모두 Grade [으로 줄기 및 뿌리 추출물 모두 피부에 자극이 없을 것으로 판단된다. 또한, 세포 생존율 결과 비교에서 뿌리 추출물에서 보다 낮은 세포 독성을 나타내었던 줄기 추출물의 경우 인체 첩포 시험의 결과도 마찬가지로 보다 낮은 평균값을 나타내었다.
- SOD 활성저해는 뿌리에서 보다는 줄기에서 높았으며, 특히 줄기 추출물에서 매우 우수한 활성을 나타내었다. SOD 는 상업적으로 매우 중요한 효소로서 화장품의 첨가제로 사용되고 있으며 류머티즘, 관절염 등 각종 퇴행성 질병 치료제로 개발되고 있다.
- 3). 그 결과 HDFs의 세포 생존율은 H2O2 단독 처리군에 비해 hk>2 처리 후 섬오갈피 줄기 추출물(0.1 mg/ml) 처리군에서 24% 정도 증가하였음을 알 수 있었다. 뿌리 추출물의 경우 줄기 추출물(0.
- 또한, 정상 피부에서 유래된 HDFs의 세포 생존율과 인간 피부 일차 자극 실험을 통해 섬오갈피 추출물의 피부에 대한 안전성을 확인하였다. 더 나아가 정상 피부 섬유아세포에서 섬오갈피의 추출물이 산화적 스트레스에 대하여 세포 보호 효과가 있음을 확인하였다. 따라서 이를 이용한 성분 및 기전 규명 등을 통해 더 많은 연구가 뒷받침된다면 새로운 향장 소재로서의 개발이 가능할 것으로 사료된다.
- 1%에서 피부 일차 자극 정도가 모두 Grade [으로 줄기 및 뿌리 추출물 모두 피부에 자극이 없을 것으로 판단된다. 또한, 세포 생존율 결과 비교에서 뿌리 추출물에서 보다 낮은 세포 독성을 나타내었던 줄기 추출물의 경우 인체 첩포 시험의 결과도 마찬가지로 보다 낮은 평균값을 나타내었다.
- 하에서 우수한 항산화 활성을 나타내었다. 또한, 정상 피부에서 유래된 HDFs의 세포 생존율과 인간 피부 일차 자극 실험을 통해 섬오갈피 추출물의 피부에 대한 안전성을 확인하였다. 더 나아가 정상 피부 섬유아세포에서 섬오갈피의 추출물이 산화적 스트레스에 대하여 세포 보호 효과가 있음을 확인하였다.
- 이는 가시오갈피에서도 부위별 및 추출방법에 따라 유효성분의 차이가 있으며, free radical 소거능력은 물추출물보다 알콜 추출물이 뿌리보다는 줄기가 효과적임을 보고한 결과17)와도 유사한 결과이다. 섬오갈피를 부위별로 냉침으로 메탄올 추출한 수율은 줄기 (5.9%)보다 뿌리(17.1%) 에서 획득률이 높았다.
- 15#1)는 생체에 매우 유해한 superoxide anion radical과 반응하여 과산화수소(HQ?)를 생성하는 효소로 산소를 소비하는 모든 생물 종에 존재하여 생체 내에서 활성산소 장해에 대한 방어 작용을 하는 대표적인 활성산소 저해제이다. 섬오갈피의 줄기와 뿌리 추출물을 사용하여 SOD 활성을 측정해본 결과 농도 의존적으로 나타났으며 줄기 추출물에서 17.52 µg/m/, 뿌리 추출물에서 146.54 #/mZ의 IC50 값을 각각 나타내었다 (Fig. 1).
- 2에 나타내었다. 섬오갈피줄기 추출물의 0.01mg/m/, O.lmg/mZ에서 105.8±3.6%와 73.55 ±3.3%의 세포 생존율을, 뿌리 추출물 0.01mg/m/에서 76.86±2.47%의 세포 생존율을 나타내어, 줄기의 추출물이 뿌리 추출물에 비하여 세포독성이 약함을 알 수 있었다.
- 6|ig/m/으로 이들 추출물들은 대조군에 비해 radical 소거능력이 낮았다. 하지만, 섬오갈피 추출물의 free radical 소거능력은 뿌리보다 줄기에서 보다 효과적임을 알 수 있었다. 이는 가시오갈피에서도 부위별 및 추출방법에 따라 유효성분의 차이가 있으며, free radical 소거능력은 물추출물보다 알콜 추출물이 뿌리보다는 줄기가 효과적임을 보고한 결과17)와도 유사한 결과이다.
- 진피를 분리 후, 진피에서 섬유아세포를 분리하여 형태를 확인하였다. 확인된 섬유아세포(Human diploid fibroblasts, HDFs)를 DMEM/F12(3:1) 배지에 10% FBS, 1% penicillinstreptomycine- 가하여 25 cm2 조직 배양 flask 내에서 배양기 내부 공기 5% CO2 농도로 37℃에서 3-5일간 안정화하였다. 안정화 후 tiypsin-EDTA 용액을 처리하여 계대 배양하였으며, 초기 계대세포(passage 3)를 사용하였다.
후속연구
- 더 나아가 정상 피부 섬유아세포에서 섬오갈피의 추출물이 산화적 스트레스에 대하여 세포 보호 효과가 있음을 확인하였다. 따라서 이를 이용한 성분 및 기전 규명 등을 통해 더 많은 연구가 뒷받침된다면 새로운 향장 소재로서의 개발이 가능할 것으로 사료된다.
- 또한 각종 약용 식물 스크리닝 및 형질전환 식물체의 육종을 통해 내성 증가 시키는 연구 등 SOD 관련 연구가 활발히 진행되고 있다. 이로써 볼 때 섬오갈피 줄기 주줄물의 SOD 활성에 대한 in vitro 결과에 대한 연구가 기대된다.
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