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문제 정의
- ", ')한약재로 사용되는 다양한 약재의 용매 추출물을 이용하여 혈관 이완 효과를 탐색한 결과 선학초의 부탄올 추출물이 혈관 이완 효과가 뛰어남을 확인하였다. 그러므로 본 연구에서는 선학초 부탄올 추출물의 혈관 이완 효과에 대한 기전을 규명하고자 한다.
- 이 연구에서는 선학초가 자율 신경계의 수용체를 경유하여 혈관을 이완시키는지 여부를 알아보기 위하여 먼저 콜린성 수용체 중에서 무스카린성 수용체를 선택적으로 차단하는 atropinet- 전 처리 한 후 혈관 이완 정도을 측정하였다. 그 결과, 선학초에 의한 혈관 이완 효과는 atropine 을 전 처리 한 군과 전 처리하지 않은 군 사이에 아무런 차이가 없었다.
제안 방법
- K+ 통로 차단 효과 - K+ 통로 차단이 선학초 부탄올 추출물의 혈관 이완효과에 영향을 주는지를 측정하기 위하여 AIB감수성 K+ 통로 억제제인 lxlK M glibenclamide와 비 선택적 K+ 통로 억제제인 1X 10-5 M TEA> 각각 전 처리한 결과 선학초 무탄올 추출물의 혈관 이완효과에 영향을 주지 않았다 (Fig. 4B).
- cGMP 생성 효과 - 선학초 부탄올 추출물이 혈관 조직에서 cGMP의 생성에 영향을 미치는 지를 관찰하기 위하여 선학초 부탄올 추출물을 흉부대동맥에 직접 투여한 후 흉부대동맥에서 .cGMP 생성량을.
- 가용성 구아닐산 고리화효소 억제 효과 - 선학초 부탄올추출물의 혈관 이완 효과가 cGMP와 관련이 있는지를 알아보기 위하여 가용성 구아닐산 고리화효소 억제제인 IxlO% M의 (NXQ를 전처리 한 후 혈관 이완 효과를 측정하였다. 그 결과 선학초 부탄올 추출물의 혈관 이완 효과가 완전히 억제되었다 (Fig.
- , San Diego, CA, USA)와 ”5[가 결합된 cGMP (10, 000 cpm per 100 μl, specific activity 2200 Ci/mM, Dupont-New England Nuclear, Wilmington, DE, USA)를 함께 넣은 후 4℃에서 24시간 반응시켰다. 결합형과 비 결합형은 charcoal을 이용하여 분리하였으며 y-counter를 이용하여 방사능을 측정하였다.
- 이용하여 측정하였다. 먼저 lx IO% M 의 phenylephrine 으로 수축시키고 iQ분후 1x10% m의 ACh으로 이완 반응을 시켜 혈관 내피 세포의 안정성을 측정한 후 Krebs 용액으로 3회 세척하고 실험을 수행하였다. 여러가지 차단제들에 의한 선학초 부탄올 추출물의 혈관 이완 효과 변화 측정은 먼저 약물을 20분간 전처리하고 phenylephrine으로 수축시켰고 이어서 선학초 부탄올 추출물에 의한 이완반응을 농도 의존적으로 관찰하였다.
- 혈관 조직은 바로 액체 질소에 넣어 반응을 정지시킨 후 -76℃에 보관한 후 cGMP 농도를 측정하였다. 무게 (wet weight)를 측정한 혈관 조직을 6% trichloroacetic acid 존재하에서 균질화 시킨 후 13, 000g에서 15분간 원심 분리하여 얻은 침전물은20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4)에 녹여 Bradford 법'으로단백량을 정량하였고, 상층액을 물이 포화된 diethylether 를 이용하여 4회 추출하였고 추출액은 Speed-vac 농축기를 이용하여 농축하고 cGMP 측정은 방사면역 분석법을 이용하여 분석하였다. 간단히 설명하면, 시료와 표준물질을 50 mM sodium acetate 완충용액 (pH 4.
- 사육하였고 실험 당일 날 단두한 후 흉부 대동맥을 분리하였다. 분리된 흉부 대동맥을 118 mM NaCl, 4.7 mM KC1, 1.1 mM MgSO4, KH2PO4, 1.5 mM CaCl2, 25 mM NaHCO3, lOmM glucose가 들어 있는 차가운 Krebs 용액 (pH 7.4)에넣고 연결 조직과 지방을 제거한 후 약 3 mm의 길이의 절편으로 만들었다.
- TO-109)는원광대학교 생명자원과학대학 식물자 원표 본집에 보관하였다. 선학초 1 kg을 건조시킨 후 분쇄기를 이용하여 분말로 하였으며 3리터의 methanol (MeOH)로 1주일간 추출한 후회전식 감압농축기를 사용하였고 농축하였다. 이를 다시 물에 녹인 후 hexane, ethylacetate, butanol, 물을 용매로 이용하여 차례로 분획하여 추출하였으며, 탐색 결과 혈관 이완효과가 가장 뛰어난 butanol층 추출물 (BAP, 4.
- 먼저 lx IO% M 의 phenylephrine 으로 수축시키고 iQ분후 1x10% m의 ACh으로 이완 반응을 시켜 혈관 내피 세포의 안정성을 측정한 후 Krebs 용액으로 3회 세척하고 실험을 수행하였다. 여러가지 차단제들에 의한 선학초 부탄올 추출물의 혈관 이완 효과 변화 측정은 먼저 약물을 20분간 전처리하고 phenylephrine으로 수축시켰고 이어서 선학초 부탄올 추출물에 의한 이완반응을 농도 의존적으로 관찰하였다. 혈관 내피세포 비의존형 실험을 수행할 때에는 혈관 내피 세포를 작은 면봉으로 제거한 후phenyle- phrine 수축과 ACh 이완 반응으로 혈관 내피 세포의 제거를 확인 후 실험을 수행하였다.
- 여러가지 차단제들에 의한 선학초 부탄올 추출물의 혈관 이완 효과 변화 측정은 먼저 약물을 20분간 전처리하고 phenylephrine으로 수축시켰고 이어서 선학초 부탄올 추출물에 의한 이완반응을 농도 의존적으로 관찰하였다. 혈관 내피세포 비의존형 실험을 수행할 때에는 혈관 내피 세포를 작은 면봉으로 제거한 후phenyle- phrine 수축과 ACh 이완 반응으로 혈관 내피 세포의 제거를 확인 후 실험을 수행하였다.
- 혈관 장력의 측정 - 백서로부터 분리한 흉부 대동맥 절편에 95% O2-5% CO2 기체로 포화시킨 37°C의 Krebs 용액에서 고정시킨 후 isometric tension을 force-displacement trans ducer (Grass FT 03, Grass Instrument, MA, USA)가 장착된 생리 기록계 (Grass Model 7E, Grass Instrument, MA, USA) 를 이용하여 측정하였다. 먼저 lx IO% M 의 phenylephrine 으로 수축시키고 iQ분후 1x10% m의 ACh으로 이완 반응을 시켜 혈관 내피 세포의 안정성을 측정한 후 Krebs 용액으로 3회 세척하고 실험을 수행하였다.
- 1* x10 M의 phenylephrines- 넣어 10분간 더 평형을 시킨 후 농도별로 선학초 부탄올 추출물 (3x10: ixlO-4, 3x Kb g/ml)와 함께 3분간 반응을 시켰다. 혈관 조직은 바로 액체 질소에 넣어 반응을 정지시킨 후 -76℃에 보관한 후 cGMP 농도를 측정하였다. 무게 (wet weight)를 측정한 혈관 조직을 6% trichloroacetic acid 존재하에서 균질화 시킨 후 13, 000g에서 15분간 원심 분리하여 얻은 침전물은20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.
대상 데이터
- 백서 흉부 대동맥의 분리 - 실험 동물은 체중이 약 250- 300 g인 웅성 Sprague-Dawley 백서를 샘타코 (오산, 한국) 를 물과 고형 사료를 충분히 공급하면서 23℃ 항온 장치에서 사육하였고 실험 당일 날 단두한 후 흉부 대동맥을 분리하였다. 분리된 흉부 대동맥을 118 mM NaCl, 4.
- 시약 - 이 연구에 사용된 ACh, phenylephrine HC1, N°- nitroarginine methyl ester (L-NAME), IBMX, 1H-[1, 2, 4]- oxadiazole-[4, 3-a]-quinoxalin-l-one (ODQ), indomethacin, glibenclamide, tetraethylammonium (TEA), verapamil, atropine, propranolol 등은 Sigma Chemical Co. (St. Louis,MO, USA)으로부터 구입하여 사용하였다.
- 추출물의 제조 - 선학초 (Agrimonia pilosa Ledeb)는 2002년 3월 전북 익산의 원광대학교 식물원에서 채취하였으며 공동 저자인 , 원광대학교 생명자원과학대학 권태오 교수가확증하였다. 확증 시료 (voucher specimen No.
데이터처리
- 통계 처리 - 실험 결과의 유의성은 실험 결과를 Students t-test나 one-way ANOVA test를 통하여 P가 0.05 이하인 경우 유의한 차이로 판정하였다.
성능/효과
- 주요 성분으로는 전초에는 agrimonin, agrimonolide, tonnentic acid, ellagic acid 둥이 함유되어 있고, 잎과 줄기에는 luteolin-7-glucoside7)- 함유되어 있다.", ')한약재로 사용되는 다양한 약재의 용매 추출물을 이용하여 혈관 이완 효과를 탐색한 결과 선학초의 부탄올 추출물이 혈관 이완 효과가 뛰어남을 확인하였다. 그러므로 본 연구에서는 선학초 부탄올 추출물의 혈관 이완 효과에 대한 기전을 규명하고자 한다.
- Ca2+ 통로 차단 효과 - Ca2+통로 차단이 선학초 부탄올추출물에 의한 혈관 이완효과에 미치는 영향을 측정하기 위하여 L-형 Ca” 통로 차단제 인 1* x10 M의 verapamil을 전처리한 후 선학초 부탄올 추출물에 의한 이완정도를 측정한 결과 낮은 농도에서는 전처리하지 않은 군과 차이가 없었지만 3* x10 g/mi 이상의 농도에서는 이완효과가 유의하게 억제되었다 (Fig. 4A).
- Cyclooxygenase 차단 효과 - 혈관 이완 효과가 있는 prostacyclin이 선학초 부탄올 추출물의 혈관이완 효과에 영향을 미치는 지를 관찰하기 위하여 비 선택적 cyclooxygenase 억제제인 IxlO-5 M의 imdomethacin 전 처리 하에서 선학초부탄올 추출물의 혈관 이완효과를 측정한 결과, indomethacin 전 처리 않은 군과 유의한 차이가 없었다 (Fig. 3A).
- 측정하였다. 그 결과 선학초 부탄올 추출물의 혈관 이완 효과가 완전히 억제되었다 (Fig. 2).
- 이 연구에서는 선학초가 자율 신경계의 수용체를 경유하여 혈관을 이완시키는지 여부를 알아보기 위하여 먼저 콜린성 수용체 중에서 무스카린성 수용체를 선택적으로 차단하는 atropinet- 전 처리 한 후 혈관 이완 정도을 측정하였다. 그 결과, 선학초에 의한 혈관 이완 효과는 atropine 을 전 처리 한 군과 전 처리하지 않은 군 사이에 아무런 차이가 없었다. 다음으로 수용체를 선택적으로 차단하는 항아드레날린성 약물인 propranolol을 전 처리한 결과 마찬가지로 전 처리하지 않은 군과 비교하여 차이가 없었다.
- 산화질소계가 선학초에 의한 혈관 이완 효과에 관여한다면 산화질소에 의하여 활성화 되는 가용성 구아닐산 고리화효소 또한 선학초에 의한 혈관 이완 효과에 관여할 것으로 사료되어 가용성 구아닐산 고리화 효소 억제제인 ODQ 전처리한 후 혈관 이완 효과를 측정한 결과, 선학초에 의한 혈관 이완 효과가 억제되었다. 따라서 이 연구 결과 선학초에 의한 혈관 이완 효과는 NO/ cGMP 계를 경유하여 일어나는 것을 시사한다. 선학초에 의한 혈관 평활근의 이완 효과가 NO/cGMP 계를 경유하여 일어난다면, 선학초를 반응시키면 혈관 평활근에서 cGMP의생성을 변화시킬 것으로 사료되어, 혈관 평활근과 선학초를 반응시킨 결과 혈관의 cGMP의 생성량이 증가하였다.
- 이 결과는 선학초에 의한 혈관 이완효과는 혈관 내피세포 (endothelium) 의존적임을 시사한다. 따라서 혈관 내피세포 유래 혈관 이완 인자의 본체인 산화질소가 선학초에 의한 혈관 이완 효과에 관여하는지를 알아보기 위하여 비 특이적 산화질소 합성효소 억제제인 L-NAME를전 처리 한 후 이완효과를 측정한 결과, 선학초에 의한 혈관 이완 효과가 억제되었다.
- 여 없어졌다. 또한 선학초의 이완 효과는 prostacyclin 생성 차단이나 ATP감수성 K+ 통로차단, TEA-sensitive 비선택성 K+ 통로차단, 그리고 무스카린성 수용체 차단 및 항아드레날린성 약물 등에 의해서는 영향을 받지 않았지만, Ca2+통로의 차단 등에 의해서는 부분적으로 억제되었다. 이와 같은 결과로 볼 때, 선학초의 혈관 평활근 이완 기전은 NO/cGMP 경로를 활성화시켜 이완시키는 것으로 사료되 고이 과정에서 L-형 Ca^ 통로가 부분적으로 관련되어 있을 것으로 사료된다.
- 본 연구에서도 선학초 부탄올 추출물이 NO/cGMP 계를 통한 혈관 내피세포 의존적인 이완효과를 가지고 있음을 나타내며 이 과정에서 L-형 Ca^이 부분적으로 관여할 것으로 사료된다.
- 산화질소 합성 효소 억제 효과 - 선학초 부탄올 추출물의 혈관 이완효과가 산화 질소계와 관련이 있는지를 알아보기 위하여 비 특이적인 산화질소 억제제인 IxlO'5 M의 L-NAM任를 전 처리하고 선학초 부탄올 추출물의 혈관 이완 효과를 측정한 결과, 혈관 이완 효과가 완전히 억제되었다 (Fig. 2).
- ⑹ 이러한 산화질소는 세포질의 가용성 '구아닐산 고리화 효소를 활성화 시켜 cGMP의 생성을 증가시켜 신호 전달체계를 통해 혈관 평활근을 이완시킨다본 연구에서 L-NAM 伍 의전 처리에 의해 선학초의 이완효과가 억제되는 것으로 보아 선학초에 의한 혈관 이완 효과는 산화질소계를 경유하여 일어나는 것*사으료로 된다. 산화질소계가 선학초에 의한 혈관 이완 효과에 관여한다면 산화질소에 의하여 활성화 되는 가용성 구아닐산 고리화효소 또한 선학초에 의한 혈관 이완 효과에 관여할 것으로 사료되어 가용성 구아닐산 고리화 효소 억제제인 ODQ 전처리한 후 혈관 이완 효과를 측정한 결과, 선학초에 의한 혈관 이완 효과가 억제되었다. 따라서 이 연구 결과 선학초에 의한 혈관 이완 효과는 NO/ cGMP 계를 경유하여 일어나는 것을 시사한다.
- 03% 이완효과를 관찰할 수 있었다. 선학초 부탄올 추출물의 혈관 이완 효과가 혈관 내피세포, 의존적인지를 밝히기 위하여 혈관 내피세포를 제거한 후 혈관 이완효과를 측정한 결과 거의 완벽하게 혈관 이완 효과가 억제되었다 (Fig.1).
- 세포내 C* 농도가 증가하면 calmodulin 과 결합하여 myosine light chain (MLC)의 인산화를 촉진시켜 평활근을 수축시킨다. 선학초의 혈관 이완 효과가 C* a 통로와 연관이 있는지 알아보기 위하여 차단제인 verapamil 을 전 처리 한 후 혈관 이완 효과를 측정한 결과, 높은 농도에서 부분적으로 혈관 이완 효과를 차단하였다. 이와 같은 결과로 볼 때, 선학초에 의한 혈관 이완 효과에서 Ca2+ 통로가 어느 정도 중요한 역할을 하고 있는 것으로 사료된다.
- Prostacyclin은 arachidonic acid로부터 cyclooxygenase에 의하여 생성되고, 이때 생성된 prostacyclin은 혈관 이완 작용을 갖는다. 선학초의 혈관 이완 효과가 prostacyclin의 생성과:관련이 있는지를 알아보기 위하여 cyclooxygenase 억제제인 indomethacin을 전 처리하고 선학초의 이완 효과를 측정한 결과 indomethacin을 전처리하지 않은 군과 비교하여 차이가 없었다. 이와 같은 결과로 볼 때 prostacyclin계는 선학초의 혈관 이완 작용과는 무관한 것으로 사료된다.
- K* 통로에 대한 억제제로는 Kg을 차단하는 TEA와 sulfonylurea계 약물인 glibenclamide로 후자는 혈관 평활근에서 Kca 통로에는 영향을 미치지 않고 만을 차단한다. 선학초의 혈관 이완효과가 Kg 또는 Katp를 경유하여 일어나는지 알아보기 위하여 Kca 차단제인 TEA와 Katp 차단제인 glibenclamide를 전처리한 후 혈관 이완효과를 측정한 결과, TEA와 glibenclamide- 전 처리하지 않은 대조군과 비교하여 이완 정도가 차이가 없었다. 이러한 결과로 볼 때 선학초에 혈관 이완효과는 K+ 통로와는 무관한 것으로 사료된다.
- 위하여 비선택성 &.아드레날린성 길항제인 propra- nolol, 항 무스카린성 약물인 atropine을 1x10% M로 각각전 처리한 후 선학초 부탄올 추출물의 혈관 이완효과를 측정한 결과, 약물을 주지 않은 군과 비교하여 선학초 부탄올추출물의 혈관 이완효과가 차이가 없었다 (Fig. 3B).
- 측정 한 결과 선학초에 의한 혈관 이완효과가 관찰되지 않았다. 이 결과는 선학초에 의한 혈관 이완효과는 혈관 내피세포 (endothelium) 의존적임을 시사한다. 따라서 혈관 내피세포 유래 혈관 이완 인자의 본체인 산화질소가 선학초에 의한 혈관 이완 효과에 관여하는지를 알아보기 위하여 비 특이적 산화질소 합성효소 억제제인 L-NAME를전 처리 한 후 이완효과를 측정한 결과, 선학초에 의한 혈관 이완 효과가 억제되었다.
- 선학초에 의한 혈관 평활근의 이완 효과가 NO/cGMP 계를 경유하여 일어난다면, 선학초를 반응시키면 혈관 평활근에서 cGMP의생성을 변화시킬 것으로 사료되어, 혈관 평활근과 선학초를 반응시킨 결과 혈관의 cGMP의 생성량이 증가하였다. 이러한 결과로 볼 때, 선학초는 혈관 내피세포에서 산화질소의 합성을 증가시키고 가용성 구아닐산 고리화효소를 활성화시켜 cGMP의 생성을 증가시켜 혈관을 이완시키는 것으로 사료된다.''
- 선학초 1 kg을 건조시킨 후 분쇄기를 이용하여 분말로 하였으며 3리터의 methanol (MeOH)로 1주일간 추출한 후회전식 감압농축기를 사용하였고 농축하였다. 이를 다시 물에 녹인 후 hexane, ethylacetate, butanol, 물을 용매로 이용하여 차례로 분획하여 추출하였으며, 탐색 결과 혈관 이완효과가 가장 뛰어난 butanol층 추출물 (BAP, 4.1 g)은 25% dimethylsulfoxide (DMSO)에 녹여서 사용하였고 0.25%의 DMSO가 혈관이완에 영향을 미치지 안음을 확인하였다.
- 또한 선학초의 이완 효과는 prostacyclin 생성 차단이나 ATP감수성 K+ 통로차단, TEA-sensitive 비선택성 K+ 통로차단, 그리고 무스카린성 수용체 차단 및 항아드레날린성 약물 등에 의해서는 영향을 받지 않았지만, Ca2+통로의 차단 등에 의해서는 부분적으로 억제되었다. 이와 같은 결과로 볼 때, 선학초의 혈관 평활근 이완 기전은 NO/cGMP 경로를 활성화시켜 이완시키는 것으로 사료되 고이 과정에서 L-형 Ca^ 통로가 부분적으로 관련되어 있을 것으로 사료된다.
- cGMP 생성량을.측정한 결과, 선학초 부탄올 추출물을 투여하지 않은 군에 비해 선학초 부탄올추출물을 투여한 군이 선학초 부탄올 추출물 농도 의존적으로 cGMP의 생성량을 층가시킴을 관찰할 수 있었다(Fig- 5).
- 혈관내피 의존성 이완효과 - Phenylephrine (IxlO-6 M)으로 수축한 후 선학초 부탄올 추출물의 농도 의존적인 혈관 이완효과를 측정한 결과, 농도 의존적으로 이완하였으며IxlO-4 g/ml의 선학초 부탄올 추출물 농도에서는 95.8± 1.03% 이완효과를 관찰할 수 있었다. 선학초 부탄올 추출물의 혈관 이완 효과가 혈관 내피세포, 의존적인지를 밝히기 위하여 혈관 내피세포를 제거한 후 혈관 이완효과를 측정한 결과 거의 완벽하게 혈관 이완 효과가 억제되었다 (Fig.
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