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문제 정의
- 이론을.바탕으로 PGE의 전구물질이 다량 함유되어 있다고 알려진 달맞이꽃 종자유 (EPO)가 성기능에 어떠한 영향을 미치는가를 밝히기 위하여 계획되었다. 실험대상 동물은 ICR계 수컷 마우스를 사용하였으며, 공시한 세포는 HUVEC과 마우스로부터 직접 적출한 음경해면조직의 평활근 세포를 사용하였다.
- 본 실험은 prostalandin의 전구물질인 y-linolenic acid가 다량 함유되어 있다고 알려져 있는 달맞이꽃 종자유를 제조하여 수컷 마우스에 투여하고 마우스의 체중변화, 고환 무게의 증가, 교미의 빈도와 성공도를 측정함과 아울러 발기에 밀접히 관여하는 testosterone, 13, 14) PGE, 15>16) cGMP, 17>18) 그리고 nitric oxide(NO)m2°)의 농도를 측정하여 달맞이꽃 종자유가 성기능에 미치는 영향을 평가하여 그 결과를 보고하고자 한다.
- 본 연구는 PGE가 발기에 관여한다는 이론을.바탕으로 PGE의 전구물질이 다량 함유되어 있다고 알려진 달맞이꽃 종자유 (EPO)가 성기능에 어떠한 영향을 미치는가를 밝히기 위하여 계획되었다.
- 4). 이와 같은 EPO에 의한 활성 testosterone 의 증가는 이들이 발기를 촉진시킬 뿐만 아니라 libido도 크게 향상시킬 수 있는 가능성을 제시한다. 따라서 이를 확인하고자 이들을 14일간 투여한 마우스의 교미횟수와정충양성율 그리고 고환의 무게를 측정하였던 바(Table I), 교미회수는 혈중 활성 testosterone의 농도와 비례하여 EPO 투여군에서 현저히 높은 빈도를 보였고, 정충 양성율(Table II)은 대조에 비하여 시료 투여군에서 유의하게증가되었으나 고환의 무게는 대조군에 비해 유의한 차이가 없었다.
제안 방법
- 실험대상 동물은 ICR계 수컷 마우스를 사용하였으며, 공시한 세포는 HUVEC과 마우스로부터 직접 적출한 음경해면조직의 평활근 세포를 사용하였다. EPO의 투여는 경구삽관에 의하여 1일 1회 14일간 투여하였다. 성기능 증강효과의 평가는 고환의 무게, 교미횟수, 혼숙시킨 암마우스 질외부의 정충양성율, 혈중 활성 testosterone 의 농도, 음경 평활근의 PGE 농도, 혈중 cGMP의 농도 그리고 혈관내피세포의 NO생산능 등을 측정하여 실시하였다.
- HUVEC2I NO 생산에 미치는 영향 - HUWEC를 iono- mycin으로 자극함과 동시에 EPO를 첨가하여 48시간 배양한 후 배양상층을 얻어 상층액내의 NO 농도를 측정하였다. 그 결과 Fig.
- 교미 능력을 평가하기 위해서는 수컷마우스에 식염수 또는 EPO를 각각 14일간 투여한 후 마지막 투여 30분에 수컷 암컷의 비율을 12로 하여 한 cage에 넣고 적색 전등이 켜있는 암실에 안치한 다음 3시간동안 관찰하여 교미횟수를 기록하였다. 정충 양성율의 판정은 먼저 암 마우스에 estradiolbenzoate (5 μg/mouse, Sigma Chemical Co.
- Louis, MO)을mating 5시간 전에 피하주사하여 발정을 유도하였다. 그 후 matinge 이들 암 마우스에 처리 14일된 위 각군 수컷 마우스를 마지막 처리 30분에 5:1의 비율로 넣어 오후 6시에 암실에 안치한 다음 익일 6시에 각 암 마우스의 질 분비물을 도말하여 현미경으로 관찰한 다음 정충이 검출될 경우 양성으로 판정하였다.
- 이어 Pinna 등의 방법 41)에 따라 해면체를 두장의 slide glass로 압착하여 조직을 마쇄 시킨 다음, 유리로 된 작은 병에 분주하여 5% CO2, 37℃에 가볍게 진탕하면서 20분간 방치하였다. 그 후, 배지 상층을 얻어 각 상층액 내의 PGE 1의 농도를 prostaglandin screening EIA kit (Cayman Chemical Co., Ann Arbor, MI)를 사용하여 회사에서 지시한 방법으로 측정하였다.
- 마우스 체중과 고환(testis)의 무게 측정 - 체중이 같은 마우스를 매일 같은 시간에 식염수 또는 EPO를 투여하고, 투여 1주, 2주 그리고 4주에 각 마우스의 체중을 측정하였으며, 고환의 무게는 2주간 투여한 마우스를 경추 탈골 하여 희생시킨 후 Aml 등의 방법을 참조하여 고환을 적출하고 그 무게를 계측하였다.
- 모든 마우스는 pellet 사료와 수돗물을 공급하고 실내온도 22±1℃, 습도 55±5%, 명암주기 12시간의 일정한 환경에서 가능한 한 스트레스를 받지 않도록 사육하였다. 모든 실험은 생리식염수를 투여한 대조군과 EPOS- 투여한 군으로 나누고, EPO의 투여는 수컷 마우스를 대상으로 0.5 mouse씩 1일 1회 일정한 시각에(오후 6시) 경구삽관투여(oral intubation) 하였다.
- EPO의 투여는 경구삽관에 의하여 1일 1회 14일간 투여하였다. 성기능 증강효과의 평가는 고환의 무게, 교미횟수, 혼숙시킨 암마우스 질외부의 정충양성율, 혈중 활성 testosterone 의 농도, 음경 평활근의 PGE 농도, 혈중 cGMP의 농도 그리고 혈관내피세포의 NO생산능 등을 측정하여 실시하였다. EPO의 투여결과 다음과 같은 성적을 얻었다.
- 음경해면조직의 PGE의 농도변화 - 대조군 및 EPO를 14일간 투여한 마우스로부터 음경을 적출하여 압착 분쇄한 다음, 이들 세포로부터 유리된 PGE의 농도를 측정하였다. 그 결과 Fig.
- 그 후 상층만을 취하여 vaccum centrifugation (speed vac)하여 완전히 건조시킨 다음, 인산완충액으로 원래의 량(200 μl)으로 재 부유시켰다. 이와 같이 비특이단백을 제거한 각 혈청내의 cGMP의 농도는 cycllic GMP enzyme immunoassay kit (Cayman Chemical Co., Ann Arbor, MI)를 이용하여 지시한 방법대로 측정하고 이를 표준시료의 농도별 흡광도에 대비하여 가검물 내의 cGMP량을 계산하였다.
- 교미 능력을 평가하기 위해서는 수컷마우스에 식염수 또는 EPO를 각각 14일간 투여한 후 마지막 투여 30분에 수컷 암컷의 비율을 12로 하여 한 cage에 넣고 적색 전등이 켜있는 암실에 안치한 다음 3시간동안 관찰하여 교미횟수를 기록하였다. 정충 양성율의 판정은 먼저 암 마우스에 estradiolbenzoate (5 μg/mouse, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)를 mating 48시간 전에 피하로 주사한 다음 progesterone (0.5 |ig/mouse, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)을mating 5시간 전에 피하주사하여 발정을 유도하였다. 그 후 matinge 이들 암 마우스에 처리 14일된 위 각군 수컷 마우스를 마지막 처리 30분에 5:1의 비율로 넣어 오후 6시에 암실에 안치한 다음 익일 6시에 각 암 마우스의 질 분비물을 도말하여 현미경으로 관찰한 다음 정충이 검출될 경우 양성으로 판정하였다.
- 혈중 testosterone농도의 변화 - 대조군 및 EPO를 14일간 투여한 마우스로부터 채혈하여 혈청 내 free testosterone 의 농도를 측정하였다. 그 결과 혈중 testosterone의 농도는 대조군에 비하여 EPO 투여군에서 유의하게 증가 되었다(Fig.
- 혈청내 free testosterone의 농도 측정 - 식염수 또는 EPO를 투여 후 14일에 안와후정맥으로부터 채혈하여 혈청을 분리한 후 혈청 내 free testosterone의 농도를 free testosterone ELISA kit (KMI Diagnostics, Inc., Suite PMimeapolis, MN)를 사용하여 회사에서 지시한 방법으로 측정하였다.
대상 데이터
- 시료 - 달맞이꽃 (Oenothera biennis, evening-primrose) 종자 2 kg을 채취한 후, 이를 압착하여 약 200 m/의 달맞이꽃 종자유(이하 EPO라 함)를 얻어 냉장고에 보관하며 사용하였다. In vitro 실험에서는 EPO를 DMSO에 용해하여 RPMI 1640으로 희석한 다음 여과하여 사용하였다.
- 바탕으로 PGE의 전구물질이 다량 함유되어 있다고 알려진 달맞이꽃 종자유 (EPO)가 성기능에 어떠한 영향을 미치는가를 밝히기 위하여 계획되었다. 실험대상 동물은 ICR계 수컷 마우스를 사용하였으며, 공시한 세포는 HUVEC과 마우스로부터 직접 적출한 음경해면조직의 평활근 세포를 사용하였다. EPO의 투여는 경구삽관에 의하여 1일 1회 14일간 투여하였다.
- 실험동물과 시료의 투여 - 이유 후부터 자웅을 격리시켜사육한 생후 7-8주된 ICR 마우스를 실험에 공시하였다. 모든 마우스는 pellet 사료와 수돗물을 공급하고 실내온도 22±1℃, 습도 55±5%, 명암주기 12시간의 일정한 환경에서 가능한 한 스트레스를 받지 않도록 사육하였다.
이론/모형
- Nitric Oxide(NO)의 생산능 측정 - NO 생산능 측정에 사용한 세포는 Keiichi 등의 방법23)을 참조하여 계대중인 사람 제대동맥세포(mJVEC)를 계대 3회에 Hanks balanced salts solution (HBSS, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)으로 3회 세척하고, 세포를 lx 106 cells/의 농도로 우태아혈청이 10% 함유된 RPMI 1640에 부유시켜 collagen-coated 24 well plates에 분주하여 37℃에 30분간 부치시켰다. 그 후 여기에 1의 ionomycin (Sigma Chemical Co.
- Cell were treated with EPO(50 μl/ml) and were stimulated with ionomycin (1 µm/ml) at time of culture initiation, and were incubated for 48 hrs. Nitrite m the culture supernatant was measured by Griess method. Each column represents the mean±S.
- PGE의 농도측정 - 각 군 마우스를 투여 14일에 경추 탈골하여 희생시킨 후 Hedlund 등의 방법을 참조하였다. 간기하면 하부치골부 (lower pubic bone)에 부착되어 있는 음경해면체 (crura corpus cavemosum)를 신속히 적출하여 2 m/의 냉 Krebs액 (NaCl, 133 mM; KC1, 4.
- Sexual behavior의 평가 - 마우스의 sexual behavior는 Zheung 등끄)이 실시한 방법에 준하여 수컷 마우스의 교미 능력과 암 마우스 질 외부의 정충 양^율로 평가하였다. 교미 능력을 평가하기 위해서는 수컷마우스에 식염수 또는 EPO를 각각 14일간 투여한 후 마지막 투여 30분에 수컷 암컷의 비율을 12로 하여 한 cage에 넣고 적색 전등이 켜있는 암실에 안치한 다음 3시간동안 관찰하여 교미횟수를 기록하였다.
- Louis, MO)로 자극하고 EPO (50 ul/mZ)를 첨가하여 48시간 37℃, 5% C0 조건하에서 배양한 다음 상층액을 얻었다. 상층액 내의 NO의 측정은 Granger 등의 방법에 따라 nitrite 를 NO 생성지표로 하여 측정하였다.
- 7 mM)에 넣었다. 이어 Pinna 등의 방법 41)에 따라 해면체를 두장의 slide glass로 압착하여 조직을 마쇄 시킨 다음, 유리로 된 작은 병에 분주하여 5% CO2, 37℃에 가볍게 진탕하면서 20분간 방치하였다. 그 후, 배지 상층을 얻어 각 상층액 내의 PGE 1의 농도를 prostaglandin screening EIA kit (Cayman Chemical Co.
성능/효과
- 1. 체중은 다소 증가 되었으나, 고환의 무게에는 유의한 차이가 없었다.
- 2. 교미횟수 및 정충양성율 모두 현저히 증가되었으며, 특히 정충양성율은 대조군에 비해 약 2배 정도의 증가율을 보였다.
- 3. 혈중 활성 testosterone의 농도는 약 2.3배 증가되었다.
- 그 결과 발기부전(erectile dysfiinction, ED), 사정 불량, 성욕(libido)과 오르가즘의 소실 등의 증상이 나타나며, 그중 ED가 가장 심각한 문제로 대두되고 있다. 2)18-70세의남성을 대상으로 한 역학조사들에 의하면 미국인의 52%, 3) 프랑스인의 39%, 4) 영국인의 17-19%5)가 ED 양성이었으며, 그 양성율은 매년 증가 추세에 있고 입원을 요하는 환자 또한 매년 3만명 이상이 된다고 한다. 과거에는 ED가 생명과는 무관하여 질병으로 간주시 되지 않았을 뿐만 아니라 오히려 금기시 되어 ED에 대한 토론이나 연구 및 치료 등이 양성화되지 않았으나, 최근에는 사회생활에서 오는 스트레스의 증가로 젊은층에서 ED 환자가 늘고, 심리적인 요인보다는 기질적인 인자가 주로 관여한다는 사실이 인지되면서 사회적 문제로 대두되고 있다.
- 4. 음경평활근의 PGE 생산능은 유의하게 증가되었다.
- 5. 혈중 cGMP 농도가 증가되었다.
- 6. HUVEC에서의 NO 생산능은 유의한 차이를 보이지 않았다
- EPO가 교접능력(intramissiorO에 미치는 영향 - EPC를 14일간 투여한 수컷 마우스 1마리와 성숙한 암 마우스 2마리씩을 암실에 놓은 후 3시간동안 수컷 마우스의 교미 횟수를 조사하였던 바, 대조군(15.2±2.1)에 비해 EPO 투여군 (41.3±3.6)에서 현저히 증가되었다. 한편 이들 수컷 마우스를 estradiol benzoate와 progesterones.
- EPO의 투여에 의한 체중 및 고환 무게의 변화 - EPO 를 투여한 마우스의 체중은 식염수만을 투여한 대조군에 비하여 증가되었으며, 그 증가의 정도는 투여기간이 경과함에따라 현저하였다. 고환의 무게는 EPO 투여군에서 대조군에 비해 다소 증가된 경향을 보였으나 유의한 차이는 없었다(Table I).
- 후 배양상층을 얻어 상층액내의 NO 농도를 측정하였다. 그 결과 Fig. 4에서와 같이 EPO 처리군에서의 NQ의 농도는 ionomycin 만으로 자극한 대조와 유의한 차이를 보이지 않았다.
- ') 성 기능은 나이가 들어감에 따라 점차 감소할 뿐만 아니라 고혈압, 당뇨, 척추손상 등 기질적 (organic) 문제와 스트레스와 같은 심리적인(psychogenic) 문제 등에 의하여 영향을 받는다. 그 결과 발기부전(erectile dysfiinction, ED), 사정 불량, 성욕(libido)과 오르가즘의 소실 등의 증상이 나타나며, 그중 ED가 가장 심각한 문제로 대두되고 있다. 2)18-70세의남성을 대상으로 한 역학조사들에 의하면 미국인의 52%, 3) 프랑스인의 39%, 4) 영국인의 17-19%5)가 ED 양성이었으며, 그 양성율은 매년 증가 추세에 있고 입원을 요하는 환자 또한 매년 3만명 이상이 된다고 한다.
- 농도를 측정하였다. 그 결과 혈중 testosterone의 농도는 대조군에 비하여 EPO 투여군에서 유의하게 증가 되었다(Fig. 1).
- 이와 같은 EPO에 의한 활성 testosterone 의 증가는 이들이 발기를 촉진시킬 뿐만 아니라 libido도 크게 향상시킬 수 있는 가능성을 제시한다. 따라서 이를 확인하고자 이들을 14일간 투여한 마우스의 교미횟수와정충양성율 그리고 고환의 무게를 측정하였던 바(Table I), 교미회수는 혈중 활성 testosterone의 농도와 비례하여 EPO 투여군에서 현저히 높은 빈도를 보였고, 정충 양성율(Table II)은 대조에 비하여 시료 투여군에서 유의하게증가되었으나 고환의 무게는 대조군에 비해 유의한 차이가 없었다.
- PGE1의 발기작용은 penile adrenergic nerves로부터 noradrenaline의 분비를 억제시키고, 음경조직의 cAMP의 생성을 촉진시킴에의하여 일어난다. 본 실험에서 EPO를 14일간 투여한 마우스의 음경해면체 평활근의 PGE1 합성능은 현저히 증가되었다(Fig. 3). 이와 같은 결과는 전술한 바와 같이 EPO 내에 다량의 PG전구물질이 함유되어 있기 때문이었으리라고 생각되어 사람에서도 EPO의 상용은 성기능을 항진시킬 것으로 사료되지만 이를 확신하기 위해서는 EPO가 각종 PG의 생산 그리고 각 PG에 대한 음경조직 내 특이수용체 발현 정도 등 보다 많은 실험이 요망된다.
- 이러한 환자에게는 testosterone을 투약하는데 투약을 받은 환자는 일반적으로 정신적인 성욕은 증가되나 외부자극에 의한 발기반응은 영향을 받지 않는다. 본 실험에서 EPO를투여하면 대조에 비하여 활성 testosterone의 농도 2배정도증가되었다(Fig. 4). 이와 같은 EPO에 의한 활성 testosterone 의 증가는 이들이 발기를 촉진시킬 뿐만 아니라 libido도 크게 향상시킬 수 있는 가능성을 제시한다.
- 본 실험에서 HUVEC을 ionomycin으로 자극함과 동시에 EPO를 처리하였던 바(Fig. 1), EPO는 NO생산에 유의한 영향을 미치지 못하였으나, EPO를 14일간 처리한 수컷 마우스의 혈청 내 cGMP 생산능은 대조군에 비해 현저히 증가하였다(Fig. 2). EPO군에서의 cGMP의 증가는 EPO가 NO 생산에 유의한 영향을 미치지 못한 연구결과(Fig.
- 이상의 결과는 EPO는 NO, cGME PGE 및 활성 testosterone 생산 등 여러 경로를 통하여 수컷 마우스의 성 기능을 증강시킴을 제시한다.
- 한편 이들 수컷 마우스를 estradiol benzoate와 progesterones. 전처리한 암 마우스와 1:5의 비율로 넣고 12시간 암실에 놓은 후 암 마우스의 질 외부를 도말하여 정충유무를 검경하였던 바(Table II), 정충 양성 율 또한 EPO 투여군에서 대조군에 비하여 현저히 증가되었다.
후속연구
- 3). 이와 같은 결과는 전술한 바와 같이 EPO 내에 다량의 PG전구물질이 함유되어 있기 때문이었으리라고 생각되어 사람에서도 EPO의 상용은 성기능을 항진시킬 것으로 사료되지만 이를 확신하기 위해서는 EPO가 각종 PG의 생산 그리고 각 PG에 대한 음경조직 내 특이수용체 발현 정도 등 보다 많은 실험이 요망된다.
- 이와 같은 실험들은 EPO가 모두 음경조직에서의 NO, cGMP, PGE 그리고 활성 testosterone 등의 생성 및 분비에 관여하여 결과적으로 성기능을 증강시킴을 실험적으로 입증할 수 있는 결과라고 사료되며, EPOS 성기능을 항진시키는 건강보조식품으로 개발할 수 있는 가능성을 제시한다.
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