문제 정의

• 녹용은 대표적인 補陽藥이므로 補劑의 기본방제인 四君 子湯『8)과 조합한 방제(가칭 鹿茸四君子湯)를 선정하여 녹용 단미 엑스제제를 사군자탕에 첨가하였을 때(녹용 別煎) 와사군자탕에 녹용을 가하여 동시에 탕전하였을 때 두 검체 사이의 pH, 추출률, 지표성분의 함량, TLC 및 HPLC chro­ matogram 비교, in Vivo에서 항산화작용과 항염증작용, in vivo에서 유영시간 등 항피로작용을 지표로 평가한바 약간의 지견을 얻어 그 결과를 보고하고자 한다.
• 따라서 유용성이 높은 한약의 단미엑스제제를 개발하여 임상에 효율적으로 적용하여 치료효과의 향상은 물론 유용성을 높이기 위한 연구의 일환으로 비교적 고가이면서 다양한 약리작용을 지닌 녹용을 선정하였다.
• 생리활성 평가로 in vitro에서 항산화활성과 항염증 활성을 지표로 하여 검토하였다. 그 결과 DPPH 소거능과 xanthine oxidase 저해활성 및 지질과산화 생성 억제 활성 등 항산화 활성들을 비교하였을 때 두 검체는 유사한 활성이 인정되었고, 지질과산화 생성 억제활성은 Sample-II가 Sample-I에 비하여 나은 결과를 보임으로써 별도로 녹용을 탕전한 후다른 방제에 가미하여도 약리활성의 변화는 없는 것으로 사료된다.
• 따라서 단일 한약의 추출물을 혼합하여 사용하는 경우와 혼합하여 추출하여 얻은 경우에 탕제의 화학적 및 활성의 차이가 있을 수 있으므로 이를 비교분석할 필요가 요청되고 있다. 이런 목적으로 한방의료에서 가장 중요한 약재인 녹용을 선정하여 다음과 같은 실험을 행하고자 하였다.

제안 방법

• DMABe?-dimethylaminobenzaldehyde) 시약을 사용한 Kim 등⑸의 방법에 준하여 측정하였고, Tiypsin 저해 활성은 Anson'아과 Tsutomu 등의 방법 17)에 준하였다, 적혈구막 안정화 작용은 Dai 등⑴의 방법을 약간 변형하여 측정하였다.
• 25);">은 저하되고 과도한 운동으로 인한 에너지소모로 대사산물이 증가하여 혈청 lactic dehydrogenase(LDH) 효소활성도와 lactic acid, creatinine, free fatty acid의 함량이 증가하는 것으로 알려져 있다.27) 즉, 검체를 4일간 경구투여하고 생쥐의 체중에 1% 부하시킨 다음 3시간 동안 강제유영을 시켜 혈청 중의 creatinine 함량 및 lactic dehydrogenase 효소활성도를 측정하여 피로 산물 생성정도를 검토하였다.
• 있다. 8)따라서 in vitro에서 Sample-I과 Sample-II의 약리학적 활성 비교 방법의 하나로서 항피로효과를 평가하고자 중량 부하에 의한 생쥐의 유영시간 연장 및 강제유영을 통한 혈액학적 지표에 미치는 효과를 비교하였다. 생쥐의 유영시간 연장효과는 두 검체 모두 유의한 연장효과가 인정되었고, 두 검체 사이에는 유사한 효과를 나타내었다.
• Ginsenoside Rb1및 glycyrrhizin 함량 - 녹용의 합제와 별전의 여부가 전출과정에서 타 구성약물의 성분변화에 영향을 주는지 여부를 관찰하고자 HPLC chromatogram과 감초의 지표물질인 glycyrrhizin과 인삼의 지표물질인 ginse­-noside R* 함량을 각각 정량하여 그 결과를 Fig. 2, Fig. 3 및 Table II에 제시하였다.
• In vitro에서의 활성 비교 - 녹용과 다른 한약물의 합제와 별전 추출방법의 차이가 약리활성에 미치는 영향이 있는지 여부를 관찰하기 하고자 in 에서 DPPH 소거활성, xanthine oxidase 저해활성, 지질과산화물 형성 저해작용, hyaluronidase 저해활성, trypsin 저해활성 및 적혈구막 안정화 작용을 비교 검토하여 Table HI에 제시하였다. 그 결과 Table IH에 나타낸 바와 같이 Sample-I과 Sample-II 사이에 DPPH 소거활성은 유사한 효과를 보였고, xanthine oxidase 저해활성은 Sample-I이 다소 양호한 저해활성을 나타내었다.
• 검액 Sample-I 및 Sample-II l.Og/kg과 2.0g/kg을 각각 경구투여하여 비교관찰하였다.
• 검액 Sample-I 및 Sample-II l.Og/kg과 2.0ggkg을 각각 경구투여 하여 비 교관찰하였다.
• TLC pattern 분석 - 녹용과 사군자탕의 합제와 별전 여부가 성분변화에 미치는 영향여부를 비교하기 위하여 TLC 를 행하여 TLC chromatogram의 pattern을 분석관찰하였다. Sample-1 과 Sample-11, 사군자탕, 녹용 단미 및 녹용 표준품의 TLC chromatogram을 Fig.
• 따로 ginsenoside Rb( 표준품을 정밀하게 달아 메탄올을 넣어 5 mg/ml5] 농도로 하여 표준액으로 하였다. 검액 및 표준액 20㎕씩을 가지고 다음 조건으로 HPLC 법에 따라 시험하여 표준액의 검량선으로부터 ginsenoside Rb, 량을 산출하였다. HPLC 조건은 다음과 같다.
• 검줄기 : Waters Photodiode™ Array Detector 996(측정 파장 203 nm), 칼럼 : Nucleosil Clg column(4.0 x 250 mm), 칼럼온도 : 40℃, 유속 : 1.5ml/min, 이동상은 A용액(15% 아세토니트릴)과 B용액(80% 아세토니트릴)을 이용하여 A 100%에서 시작하여 20분 후 90%가 되도록 기울기를 준 후 50분에는 70%가 되도록 B 용액을 gradient 하였다.
• 그리고, prolonged exercise model을 택하여 근육피로모델을 이용흐*여 항피로효과를 검토하였다. 실험동물을 강제유영시키는 경우 혈액 읺ucose level 유의한 차이는 인정되지 않았다. 그리고, 천연물의 성분 화학적 정성시험에 일반적으로 이용되고 있는 TLC pattern 분석법을 이용하여 녹용 표준품을 대조로 하여 chromatogram 을 비교한 바 Sample-I과 Sample-II 두 검체 사이에서 유사한 TLC chromatogram을 보였다. 그리고, Sample-Ⅰ과 Sample-Ⅱ 모두 녹용 표준품의 특징적 인 반점을 확인할 수 있었다.
• 그리고, 항염증활성의 지표로 hyaluronidase 및 trypsin 저해 활성을 이용하였다.*26)그 결과 두 검체 Sample-Ⅰ과 Sample-Ⅱ 유사한 저해활성이 인정되었고, 다소 Sample-Ⅱ 가 다소 양호한 결과를 보였다.
• 녹용 제제의 유용성을 평가하기 위한 기초적 연구로서 四 君子湯에 鹿茸을 가미한 鹿茸四君子湯의 조제시 구성 약물을 합하여 추출한 鹿茸四君子湯(Sample-I)과 四君子湯 및 녹용을 각각 별전한 후 합한 鹿茸四君子湯(Sample-II)을 각각 검체로 하여 물리화학적 및 생물활성을 지표로 하여 평가한 결론은 다음과 같다.
• 또한 사군자탕(백복령 , 백출, 감초, 인삼 각각 20 g 총 80 g) 및 녹용 20 g을 각각 round bottom flask에 옮기고 녹용 사군자탕 합제의 조제와 동일한 조작으로 추출하여 pH를 측정하고, 동결건조하여 사군자탕 및 녹용 건조엑스를 각각 얻었다. 녹용사군탕 별전(Sample-II)은 사군자탕 건조엑스 분말에 녹용 건조엑스분말을 합하여 균일하게 한 것으로 하였다.
• 5)을 전개용매로 하여 약 10 cm 전개한 다음 박층판을 건조시켰다. 발색은 자외선 254 nm 및 아니스알데히드-황산 시액을 분무한 후 105℃에서 15분간 가열하여 각각 표준액과 비교 관찰하였다
• 수영실험은 4일간 시료를 투여한 후, 생쥐의 체중을 달고 체중의 1%에 해당하는 납줄을 목에 달고 마지막 시료의 경구투여 1시간이 지난 시점에서 강제유영을 시켰다. 유영을 종료시킨 후 즉시 심장채혈하여 혈청을 분리한 뒤, creatinine 함량은 Jafi법, 20) LDH 활성은 UV-Rate법"을 이용하여 측정용 kit(Asan Pharm.
• 즉, 25×40×17cm 의 투명한 플라스틱 용기에 증류수를 14 cm까지 채우고 18℃ 항온조에 넣어 일정한 온도를 유지하면서 동일시간에 6개의 수영조에서 6마리 생쥐의 수영시간을 동시에 측정하였다. 수영실험은 체중을 칭량하고 체중의 8%에 해당하는 무게의 납줄을 목의 배면부위에 고정한 다음 유영시간을 측정하였다. 수영시간은 생쥐의 코가 수면 아래로 잠길 정도의 수영이 5초간 진행되어 가라앉게 될 때까지로 하였다.
• 시료의 조제 및 pH의 측정 - 녹용사군자탕 합제의 조제는 四君子湯 즉 백복령 , 백출, 감초, 인삼과 녹용을 각각 20 g 동량을 round bottom flask에 옮기고 증류수 1 L를 가하여 2시간 동안 환류추출하고 온시에 여과하여 pH를 측정하고 감압농축한 다음 동결건조하였다(이하 Sample-I).
• 이에 補陽藥으로 널리 이용되고 있는 녹용을 단 미 엑스제제로 하여 치료상 유용성을 확보하고자 하는 연구의 일환으로 補氣藥의 기본방제인 四君子湯에 녹용을 가하여 한꺼번에 전출한 검체 (Sample-I)와 사군자탕을 전출하여 얻은 엑스에 녹용을 별전하여 얻은 엑스를 조합한 검체 (Sample-II) 사이의 물리화학적 parameter의 차이는 물론 in vzTrc계에서 항산화 및 항염증활성, in vM계에서 항피로효과를 지표로 하여 실험한 결과를 비교고찰하면 다음과 같다.
• 전탕액의 pH 및 추출률 - 사군자탕에 녹용을 가한 녹용 사군자탕(Sample-I)과 사군자탕과 녹용을 각각 주줄한 다음 합한 녹용사군자탕(Sample-II, 별전)의 pH 및 물 추출률을 검토하여 그 결과를 Table I에 제시하였다. 그 결과 pH는 Sample-I에서는 5.
• profile도 유사하였다. 주줄방법에 따라 유효성분 또는 지표성분의 영향을 줄 수 있으므로 인삼 중 ginsenoside Rb1 및 감초 중 glycyrrhizin의 함량을 지표로 하여 평가하였다. 그 결과 ginsenoside Rbj 함량은 각각 Sample-I 0.
• 중량부하 생쥐의 유영실험의 혈액학적 지표에 대한 효과 - 생쥐 체중의 1%에 상응하는 납줄을 목에 달고 3시간 동안 강제 유영시켜 피로를 유발시킨 뒤 혈중의 creatinine 함량 및 lactic dehydrogenase(LDH) 효소활성도에 미치는 검액의 효괴를 Table V게 제시하였다. 우선 혈청 중 creatinine 함량은 정상군이나 중량부하 생쥐의 대조군에서 별다른 차이가 인정되지 않았으며 , 검액 Sample-I 및 Sample-II 처치 군에서도 별다른 변화를 나타내지 않았다.
• 중량부하 흰쥐의 유영실험의 혈액학적 지표에 미치는 작용 - 전술한 방법과 동일하게 플라스틱 용기에 증류수를 채우고 20℃ 항온조에 넣어 온도를 유지하면서 6개의 수영조에서 6마리의 생쥐를 동일하게 3시간씩 수영을 시켰다. 수영실험은 4일간 시료를 투여한 후, 생쥐의 체중을 달고 체중의 1%에 해당하는 납줄을 목에 달고 마지막 시료의 경구투여 1시간이 지난 시점에서 강제유영을 시켰다.
• T 등9)의 방법을 개량하여 실시하였다. 즉, 25×40×17cm 의 투명한 플라스틱 용기에 증류수를 14 cm까지 채우고 18℃ 항온조에 넣어 일정한 온도를 유지하면서 동일시간에 6개의 수영조에서 6마리 생쥐의 수영시간을 동시에 측정하였다. 수영실험은 체중을 칭량하고 체중의 8%에 해당하는 무게의 납줄을 목의 배면부위에 고정한 다음 유영시간을 측정하였다.

• 이용되고 있다.&4)녹용은 매년 급속한 재생과정을 거치며 세포층이 대체되어 낡은 조직이 떨어지고 새로운 조직으로 대체되며, 그 급속한 성장과정은 testosterone같은 호르몬의 작용에 의해 조절되고' 조직 전체적으로 성장과정에서 중요한 역 할을 하는 epidermal growth factor receptor (EGFR)이 고르게 분포되어 있는 것으로 알려졌다.6)또한, 본초학적으로 녹용은 壯元陽, 補氣血, 益精髓, 强筋骨 등의 효능이 있어 신경증의 치료, 원기의 회복, 보혈작용, 신장기능의 강화 및 수명의 연장 등의 목적으로 다른 약재와 조합하여 이용되고 있다.
• In vivo 계에서 중량부하된 생쥐의 유영시간 연장과 강제유영 생쥐의 혈액학적 지표에 미치는 효과는 각 검액 공히 유의한 생쥐의 유영시간연장효과 및 혈청 중 LDH 효소 활성 상승억제효과가 인정되었으며, Sample-I와 Sample-II 두 검체 사이의 효과는 유사한 것으로 나타났다.
• 하여 검토하였다. 그 결과 DPPH 소거능과 xanthine oxidase 저해활성 및 지질과산화 생성 억제 활성 등 항산화 활성들을 비교하였을 때 두 검체는 유사한 활성이 인정되었고, 지질과산화 생성 억제활성은 Sample-II가 Sample-I에 비하여 나은 결과를 보임으로써 별도로 녹용을 탕전한 후다른 방제에 가미하여도 약리활성의 변화는 없는 것으로 사료된다.
• 비교 검토하여 Table HI에 제시하였다. 그 결과 Table IH에 나타낸 바와 같이 Sample-I과 Sample-II 사이에 DPPH 소거활성은 유사한 효과를 보였고, xanthine oxidase 저해활성은 Sample-I이 다소 양호한 저해활성을 나타내었다. 반면에 지질과산화 형성저해, hyaluronidase 저해활성, trypsin 저해활성 및 적혈구막 안정화 작용은 Sample-II에서 비 교직 더 양호한 활성을 보였다.
• 주줄방법에 따라 유효성분 또는 지표성분의 영향을 줄 수 있으므로 인삼 중 ginsenoside Rb1 및 감초 중 glycyrrhizin의 함량을 지표로 하여 평가하였다. 그 결과 ginsenoside Rbj 함량은 각각 Sample-I 0.44%, Sample-Ⅱ 0.51 %이었고, glycynhizin 함량은 Sample-I 1.57%, Sample-Ⅱ 1.85%를 나타내어 두 지표성분의 함량은 Sample-Ⅱ가 다소 높았지만 통계적으로 유의있는 변화는 인정되지 않았다.
• 그 결과를 Table I에 제시하였다. 그 결과 pH는 Sample-I에서는 5.53이고, Sample-II에서는 5.3X로 0.15의 차이를 보였으며 사군자탕의 pH는 5.19이었다. 그리고, 물 추출률은 Sample-I 23.
• 그 결과 표준품 glycyrrhizin과 Sample-I 및 Sample-II 각각 chromatogram에서 glycyrrhizin의 peak가 Rt 1L 9분에서 확인할 수 있었고, 두 검체의 chromatogram profile은 유사하였다(Fig. 2). 그리고, 표준품 ginsenoside Rb]의 peak가 Rt 51.
• 그 결과 혈청 중 creatinine 함량은 정상군에 비하여 생리식염수만을 투여하고 강제유영시킨 대조군에서는 별다른 변화를 관찰할 수 없었고, 검체 처치군에서도 별다른 영향을 미치지 않았다. 혈청 중 LDH 효소활성도는 정상군에 비하여 대조군은 유의하게 상승되었고, 검체 Sample-I 및 Sampl-II 처치군에서는 유의하게 상승억제효과가 인정되었고, 두 검체 사이에는 유의한 차이가 인정되지 않았다.
• *26)그 결과 두 검체 Sample-Ⅰ과 Sample-Ⅱ 유사한 저해활성이 인정되었고, 다소 Sample-Ⅱ 가 다소 양호한 결과를 보였다. 그리고, 녹용의 특징적인 임상효과인 보혈작용과 가장 밀접한 관련이 있을 것으로 생각되는 적혈구 막 안정화작용 실험의 결과에서도 Sample-Ⅱ 처치군이 다소 나은 결과가 인정되었다.
• 3). 그리고, 지표 성분 함량은 인삼 유래 ginsenoside Rb1 함량은 Sample-II이 높게 검출되었고 감초에서 유래한 glycyrrhizin 함량도 Sample-II가 다소 높게 검출되었으나, 두 검체 사이의 함량 차이는 보이지 않았다.
• 따라서, 녹용사군자탕에서 사군자탕 4종의 구성약물에 녹용 1 종의 약물을 가미하여 추출하거나, 사군자탕과 녹용을 각각 별도로 추출하여 합한 경우 추출액의 pH, 추출률 TLC 및 HPLC chromatogram과 지표성분의 함량에 크게 영향을 미치지는 않는 것으로 사료된다.
• 25);">은 추출액 중의 pH, 물 추출률, TLC 및 HPLC chromatogram의 profile 등각 parameter가 유사하였다. 또한 인삼의 지표성분 ginseno­ side Rb| 및 감초의 지표성분 glycyrrhizin의 함량은 두 검체에서 유사한 결과를 보이나 Sample-II에서 약간 높았다.
• 또한, 감초 중 glycyrrhizin 표준품 및 인삼 중 ginsenoside Rb]의 표준품을 이용한 HPLC chromatogram 비교에서 두 검체 공히 각 표준품의 peak를 확인할 수 있었으며, chromatogram의 profile도 유사하였다. 주줄방법에 따라 유효성분 또는 지표성분의 영향을 줄 수 있으므로 인삼 중 ginsenoside Rb1 및 감초 중 glycyrrhizin의 함량을 지표로 하여 평가하였다.
• 그 결과 Table IH에 나타낸 바와 같이 Sample-I과 Sample-II 사이에 DPPH 소거활성은 유사한 효과를 보였고, xanthine oxidase 저해활성은 Sample-I이 다소 양호한 저해활성을 나타내었다. 반면에 지질과산화 형성저해, hyaluronidase 저해활성, trypsin 저해활성 및 적혈구막 안정화 작용은 Sample-II에서 비 교직 더 양호한 활성을 보였다.
• 8)따라서 in vitro에서 Sample-I과 Sample-II의 약리학적 활성 비교 방법의 하나로서 항피로효과를 평가하고자 중량 부하에 의한 생쥐의 유영시간 연장 및 강제유영을 통한 혈액학적 지표에 미치는 효과를 비교하였다. 생쥐의 유영시간 연장효과는 두 검체 모두 유의한 연장효과가 인정되었고, 두 검체 사이에는 유사한 효과를 나타내었다.
• 효괴를 Table V게 제시하였다. 우선 혈청 중 creatinine 함량은 정상군이나 중량부하 생쥐의 대조군에서 별다른 차이가 인정되지 않았으며 , 검액 Sample-I 및 Sample-II 처치 군에서도 별다른 변화를 나타내지 않았다.
• 전탕액 중의 pH 변화를 검토한 바 Sample-I과 Sample-Ⅱ 은 유사한 pH를 나타내었고, 추출률 역시 두 검체 사이에는 유의한 차이는 인정되지 않았다. 그리고, 천연물의 성분 화학적 정성시험에 일반적으로 이용되고 있는 TLC pattern 분석법을 이용하여 녹용 표준품을 대조로 하여 chromatogram 을 비교한 바 Sample-I과 Sample-II 두 검체 사이에서 유사한 TLC chromatogram을 보였다.
• 않았다. 혈청 중 LDH 효소활성도는 정상군에 비하여 대조군은 유의하게 상승되었고, 검체 Sample-I 및 Sampl-II 처치군에서는 유의하게 상승억제효과가 인정되었고, 두 검체 사이에는 유의한 차이가 인정되지 않았다.

후속연구

• 이러한 실험결과를 종합하면 사군자탕에 녹용을 가미하여 동시에 전출하거나, 또는 녹용을 별도로 추출하여 사군자탕에 혼합흐}여도 두 검체 사이에 유의한 물리화학적 parameter 의 변화와 약리활성의 변화를 관찰할 수 없어 녹용 엑스제제로 조제하여 임상에 적용함에 있어 다양성 및 유연성의 향상에 기여할 수 있을 것으로 기대된다.