세균이 외부stress에 대한 자가저항으로 biofilm형성을 하는 것은 식품 뿐만아니라 식품기기등의 세척, 소독등의 식품안전 확보에 많은 어려움을 주게 된다. 본 연구에서는 glass wool과 mlcrotiter plate assay를 이용하여 주요 식중독 세균인 Salmonella, E. coli, B. cereus, S. aureus를 여러가지 식품보존하에서 상해와 biofilm형성 정도를 비교하였다. 이들 세균은 외부의 stress없는 조건하에서도 상해를 받지 않았고 모두 biofilm이 형성되어 glass wool에 부착되었다. Microtiter plate assay에서의 상해별 biofilm형성은 acid stress에서 10%이내의 상해를 받은 E. coli와 약 40%의 상해를 받은 S. aureus에서 높게 나타났다. $4^{\circ}C$의 cold temperature에서는 30-50% 상해를 나타낸 B. cereus와 E. coli가 높은 biofilm 형성을 보였고 cold starvation에서는 다른 stress에 비해 전체적으로 biofilm형성도가 낮은 값으로 측정되었다. 그리고 6% sodium chlorine solution에서 30-55%의 상해를 입은 Salmonella가 높은 biofilm 형성도를 보였다. 그러나 같은 종의 식중독 세균이라도 외부의 stress 대하여 다양한 정도의 biofilm을 생성하는 것으로 보인다. 따라서 식품으로부터 이들 식중독 세균을 제어하기 위해서는 대상식품의 보존환경에 따른 biofilm 형성특성을 고려해야 할 것으로 사료된다.
세균이 외부stress에 대한 자가저항으로 biofilm형성을 하는 것은 식품 뿐만아니라 식품기기등의 세척, 소독등의 식품안전 확보에 많은 어려움을 주게 된다. 본 연구에서는 glass wool과 mlcrotiter plate assay를 이용하여 주요 식중독 세균인 Salmonella, E. coli, B. cereus, S. aureus를 여러가지 식품보존하에서 상해와 biofilm형성 정도를 비교하였다. 이들 세균은 외부의 stress없는 조건하에서도 상해를 받지 않았고 모두 biofilm이 형성되어 glass wool에 부착되었다. Microtiter plate assay에서의 상해별 biofilm형성은 acid stress에서 10%이내의 상해를 받은 E. coli와 약 40%의 상해를 받은 S. aureus에서 높게 나타났다. $4^{\circ}C$의 cold temperature에서는 30-50% 상해를 나타낸 B. cereus와 E. coli가 높은 biofilm 형성을 보였고 cold starvation에서는 다른 stress에 비해 전체적으로 biofilm형성도가 낮은 값으로 측정되었다. 그리고 6% sodium chlorine solution에서 30-55%의 상해를 입은 Salmonella가 높은 biofilm 형성도를 보였다. 그러나 같은 종의 식중독 세균이라도 외부의 stress 대하여 다양한 정도의 biofilm을 생성하는 것으로 보인다. 따라서 식품으로부터 이들 식중독 세균을 제어하기 위해서는 대상식품의 보존환경에 따른 biofilm 형성특성을 고려해야 할 것으로 사료된다.
Most bacteria form biofilm as self-defence system, making efficient food sanitization, preservation, and instrument washing more difficult. Biofilm formation of Salmonella, E. coli, B. cereus, and S. aureus was observed during 24 hr food preservations by performing microtiter plate and glass wool as...
Most bacteria form biofilm as self-defence system, making efficient food sanitization, preservation, and instrument washing more difficult. Biofilm formation of Salmonella, E. coli, B. cereus, and S. aureus was observed during 24 hr food preservations by performing microtiter plate and glass wool assays. Most cells formed biofilm and attached onto glass wool. When biofilm formation and injury were analyzed on the microtiter plate, 10 and 20% acid-injured E. coli and S. aureus, respectively, 30-50% cold temperature $(4^{\circ}C)-injured$ B. cereus and E. coli, and 30-55% 6% sodium chloride solution-injured Salmonella showed significant biofilm formation. Results indicate biofilm formation level differed within species depending on type of stress.
Most bacteria form biofilm as self-defence system, making efficient food sanitization, preservation, and instrument washing more difficult. Biofilm formation of Salmonella, E. coli, B. cereus, and S. aureus was observed during 24 hr food preservations by performing microtiter plate and glass wool assays. Most cells formed biofilm and attached onto glass wool. When biofilm formation and injury were analyzed on the microtiter plate, 10 and 20% acid-injured E. coli and S. aureus, respectively, 30-50% cold temperature $(4^{\circ}C)-injured$ B. cereus and E. coli, and 30-55% 6% sodium chloride solution-injured Salmonella showed significant biofilm formation. Results indicate biofilm formation level differed within species depending on type of stress.
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문제 정의
따라서 본 연구에서는 그 실제적인 중요성에 비하여 연구가 많이 진행되지 못하고 있는 주요 식중독세균의 biofilm 형성 여부와 식품저장, 유통, 제조과정에서 받을 수 있는 acid, cold starvation, cold temperature, sodium chloride에 의한 stress가 biofilm형성에미치는 영향을 평가하여 그 결과를 보고하고자 한다.
본 연구는 보건복지부 보건의료기술개발사업(과제번히)2-PJ1- PG1-CH08-0002)의 지원으로 이루어졌으며 이에 저자들은 사의를 표하고자 합니다.
그러나 이러한 노력은 의도되었던 바와 같이 효율적으로 이루어지지 않은 것이 사실이다. 이러한 원인중의 하나가 오염된 식품에서 이 세균들은 biofilm을 형성하여 외부의 stress에 대항하기 때문인 것으로 알려지고 있다(2) 따라서 본 연구에서는 식품의 보존으로 많이 활용되고 있는 산, 저온, sodium chloride 등에 따른 식중독 세균의 상해정도와 biofilm형성에 대하여 연구하고자 하였다.
제안 방법
Cold starvation에 의한 영향: 기아상태로 만들어주기 위해 수돗물(tap water), 이온수(deionized water) 또는 식염수(saline), 그리고 phosphate buffered saline을 사용하였다. 대체적으로 normal saline이나 tap water보다는 0.
aureus의 표준균주와 분리균주를 사용하여분석 하였다. Glass wool와 microplate plate에 부작여부로 biofi m 형성을 판단하였고 injuty정도는 각각의 stress후에 NaC배지에서의 생육여부에 따라 판단하였다. 여기서 20% injuiy를 받은 균주를 상해를 받은 것으로 판단했고, 그리고 microplate에 의한 정량적인 분석에서 biofilm은 OD550에서 0.
Sodium chloride stress에 의한 영향: 식품 내에 식품살균보존을 위하여 일반적으로 사용되는 6% sodium choloride로 stress를 준 다음 그것에 따른 injury와 biofilm 형성도를 비교하였다. S.
Stress노출조건에 따라 stress를 준 후 각각의 stress조건에 대한상해 비율을 측정하기 위해 triptone phosphate agar(Difco, Becton, Detroit, Ml, USA)와 TPAS(TPA에 4.5% NaCl을 첨가)에 균주를 도말하여 생균수를 측정하였다. TSA와 TPAS에 상해를 준 균주를 십진 희석법으로 도말하여 두 배지간 균수의 차이를 상해 비율로 나타내었다(15).
Stress상해를 준 것에 대한 대조구로써 상해를 주지 않은 균의 biofilm형성을 microplate 에서 흡광도(OD550)으로 비교해 보았다 (결과 미제시). 보통 스트레스를 주지 않은 균주인 경우에 micro- plate에서는 OD값이 0.
coll O157:H7 932, Sal. typhymurium ATCC 12023, B. cereus KCC'M 40935, S aureus ATCC 12103를 glass wool에 부착되어 있는 세포와 이ass wool에 부착되지 않은 부유세포을 시간대 별로 측정하였다(Fig. 1A, IB). S.
4) 완충액을 넣었다. 다음임 ass wool에 붙어 있던 cell들을 제거하기 위해서 10분 동안 250rpm으로 shaking하여 5mL Tris-HCI을 회수하고 10분 동안 원심분리(12, 000Xg)하여 pellet을 멸균 식염수로 현탁하여 생균 수를 측정하였다 (13).
따라서 pH 5.3의 acidic TSB상에서 4시간 동안 노출하여 stress를 준 다음 TPAS와 TPA배지간 균수의 차이를 이용하여 injury%를 계산하였다(Fig. 2).
많은 어려움을 주게 된다. 본 연구에서는 glass wool과 micro titer plate assay를 이용하여 주요 식중독 세균인 Salmonella, E. coli, B. cereus, S. aureus를 여러가지 식품보존하에서 상해와 biofilm형성 정도를 비교하였다. 이들 세균은 외부의 stress없는 조건하에서도 상해를 받지 않았고 모두 biofilm이 형성되어 glass wool에 부착되었다.
식중독 세균으로는 식품에서 많은 문제가 되고 있는 식중독 유발 세균중 Gram(-) 세균인 Salmonella와 E. coli, 그리고 Gram(+) 세균인 B. cereus^r S. aureus의 표준균주와 분리균주를 사용하여분석 하였다. Glass wool와 microplate plate에 부작여부로 biofi m 형성을 판단하였고 injuty정도는 각각의 stress후에 NaC배지에서의 생육여부에 따라 판단하였다.
Glass wool와 microplate plate에 부작여부로 biofi m 형성을 판단하였고 injuty정도는 각각의 stress후에 NaC배지에서의 생육여부에 따라 판단하였다. 여기서 20% injuiy를 받은 균주를 상해를 받은 것으로 판단했고, 그리고 microplate에 의한 정량적인 분석에서 biofilm은 OD550에서 0.4 이상을 보이는 균주를 biofilm forming strain인 것으로 평가하였다.
외부 스트레스에 대한 biofilm생성정도를 알아보기 전에 이들 세균이 biofilm을 형성하는지를 glass wool로 분석하였다. E.
대상 데이터
932를 사용하였다. 분리균주(wild type)로는 당 연구실에서 분리 동정한 B. cereus B70C, B. cereus B72C, B. cereus B74C, B. cereus B75G와 S. aureus^: S. aureus S6T, S. aureus S14T, Salmonella는 Salmonella S2A, Samonella S6A, Samonella S9A를 사용하였으며 E. coli는 E. coli E1C, E. coll E2C, E. coli E3C를 사용하였다. 모든 배양은 tryptone soya broth (Oxoid, Hampshire, England), tryptone soya agar(Oxoid, Hamp- 아lire, England)에서 37"C로 overnight 배양하여 수행하였다.
표준균주로 Bacillus cereus KCCM 40935, Salmonella typhymurium ATCC 12023, Staphylococcus aureus ATCC 12103, Escherichia coll O157:H7 932를 사용하였다. 분리균주(wild type)로는 당 연구실에서 분리 동정한 B.
성능/효과
1)Injuried strain was defined as more than 20% injury on the Figures.
aiigs가 상대적으로 높은 비율로 biofilm을 형성하고 있었고 injury를 받은 균주 중 약 66%가 biofilm을 형성하였다. E. coh는 injury를 보이는 균주와 biofilm을 형성하는 균주가 서로 달랐으며 B. cereus는 biofilm 잘 형성하지 않는 것으로 나타났다.
coli가 가장 가장 많은 injury와 biofilm을 형성하고 있는 것으로 나타났다. Gram(-)인 Salmonella와 E. coli가 외부의 stress에 대하여 비교적 높은 biofilm 형성능을 보여 주었는데 특히 sodium chloride에 대한 biofilm형성능은 아주 높았다. Gram(+)인 S.
이들 세균은 외부의 stress없는 조건하에서도 상해를 받지 않았고 모두 biofilm이 형성되어 glass wool에 부착되었다. Microtiter plate assay에서의 상해별 biofilm 형성은 acid stress에서 10%이내의 상해를 받은 E. coli와 약 40%의 상해를 받은 S. awezM에서 높게 나타났다. 4°C의 cold temperature 에서는 30-50% 상해를 나타낸 B.
1A, IB). S. aureus가 부착 상태에서 가장 많은 증가추세를 보였지만 부유세포와 glass wool에 부착된 세포의 생장곡선은 균주마다 특별한 차이가 없이 24시간 이후에도 많이 증가하는 것을 알 수 있었다. 사용한 균주 모두 12시간 대까지는 균수가 증가하였는데 planktonic cell은 12시간 이후에는 정지기로 더 이상 증가하지 않은 것으로 나타났다.
S. aweus는 내염성 균이지만 대부분의 균주가 20% 이상의 상해를 받은 것으로 보였고 모두 동시에 biofilm을 형성하는 것으로 나타났다. Bacillus와 E.
5). Salmonella는 injury^ biofilm형성 균주가 서로 다르게 나타났고, E. coliSz 대체적으로 injuiy는 받았지만 biofilm형성은 더 적게 일어나는 것으로 보였다.한 개의 균주만이 injury와 biofilm형성을 동시에 보이고 있었다.
aureus S14T의 몇 균주는 stress에 대한 적응기작이 크게 일어난 것으로 보인다. 따라서 이들 4 식중독 세균중 대부분은 산에 20%이상의 injuty는 받았으나 biofilm은 일부만이 형성하는 것으로 나타났다.
Bacillus의 경우 2시간이 지나면glass wool에 부착하기 시작하여 18시간 정도에는 부착된 균주가 모여 biofilm의 형태로 관찰된다고 한다(16). 따라서 이들 세균들이 glass wool에 부착하는 것으로 볼 때 여기서 연구한 식중독균은 대부분이 일정양의 bioflm은 형성하는 것을 알 수 있었다.
aureus가 부착 상태에서 가장 많은 증가추세를 보였지만 부유세포와 glass wool에 부착된 세포의 생장곡선은 균주마다 특별한 차이가 없이 24시간 이후에도 많이 증가하는 것을 알 수 있었다. 사용한 균주 모두 12시간 대까지는 균수가 증가하였는데 planktonic cell은 12시간 이후에는 정지기로 더 이상 증가하지 않은 것으로 나타났다. 그러나 흥미롭게도 glass wool에 부착된 세포는 12시간 이후에도 계속 증가 추세를 보였다.
후속연구
흥미롭게도 Salmone'la 만 biofilm을 형성하였고 다른 세균은 biofilm을 형성하지 않았다. 이는 현재 식품의 살균제로 가장 많이 사용하고 있는 chlorine compound에 Salmonella의 저항성이 크다는 것을 의미하므로 향후 많은 주의를 기울여야 할 것으로 보인다. Cold starvation 조건에서는 S.
열처리로부터 살아남은 세균이거나, 또는 식품중의 산과 염, 온도등 자연적으로 가해진 stress를 견디어 낸 세균들은 다른 스트레스를 가해도 일부 균주는 cross adaptation특성으로 인하여 식품 속에서 더 독성이 강해지게 된다(3, 4). 특히 현대의 식생활 형태가 가능하면 살균등의 가공이 덜되고 천연상태의 식품을 요구하고 있는 상황에서 식중독을 유발할 수 있는 세균들은 이러한 특성으로 인하여 더 중요하게 연구될 필요가 있다.
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