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문제 정의
- 전통된장에서 면역증강 물질을 생산하는 미생물을 분리하여 면역증강 물질의 특성을 확인하였다(22). 따라서 본 연구에서는 면역증강 물질을 생산하는 미생물을 이용하여 면역활성이 강화된 청국장을 제조하여 면역증강의 효능과 기호성 등을 검토하여 보고자한다.
- 전통된장에서 분리한 면역증강 물질을 생산하는 B. licheniformis El을 접종하여 청국장을 발효제조한 결과, 향과 맛에 있어 기호도가 좋지 않아 시판 청국장으로부터 발효 미생물을 분리하여 흔합배양을 통한 면역증강 물질 강화 청국장을 제조하고자 하였다. 시판 청국장을 멸균 생리식염수로 희석하여 선택배지에 도말하고 37℃에서 24시간 동안 배양하여 생육이 우수한 콜로니를 순수 분리하였다.
가설 설정
- subtil is S2. 4)In a column, means followed by the same letter are not significantly different at the 5% level.
- subtilis S2, 4)C was commercial Chungkookjang. 5)In a column, means followed by the same letter are not significantly different at the 5% level.
제안 방법
- 현미경 관찰을 통한 미생물의 형태학적 특성 및 생화학적 특성을 규명하고 이 결과를 토대로 Bergey's manual of determinative bacteri-ologW에 준하여 동정하였다(27). API 50 CHB kit(bioMeri-eux Co, Many FEtoile, France)으로 49개의 탄소원에 대한 이용성을 조사하고 이 결과를 API 50 CHB database V3.0 (http://api-web.biomerieux.com)을 이용하여 동정하였다.
- 1 mCi)를 각각의 well에 첨가하여 6시간 연장 배양하였다. Liquid scintillation counter(1450 Microbeta TriLux, PerkinElmer, Shelton, CT, USA)에 의해 세포내에 흡수된 3H-thymidine^H-TdR)의 양을 count per minute(cpm)으로 나타내어 균체분획 물질들에 의한 림프구의 증식 및 억제 현상을 측정하였다(21). 이때 최대 3H-TdR 조사량의 50%를 나타내는 면역증강 물질의 농도를 1 unit으로 정하였다.
- 단일균주 B. lichenifbrmis El, B. subtilis S2 및 B. licheniformis El과 B. subtilis S2의 혼합균주를 각각 접종하여 발효제조한 청국장과 시판 청국장을 대조구로 사용하여 면역증강 물질을 분리하고 면역활성을 비교하였다. 청국장으로부터 면역증강 물질을 분리하여 마우스 비장 림프구의 3H-thymidine(3H-TdR) 측정방법에 의해 림프구의 증식 및 억제 현상을 측정한 결과, B.
- 마우스(BALB/c)의 비장을 채취한 후 림프구를 유리시켜 RPMI1640(500 mg/mL L-glutin, 5 mg/rnL sodium bicarbonate, 100 units/mL penicillin, 100 mg/mL streptomycin, 10 mmol HEPESbuffer)으로 세척하였다. 분리한 림프구는 10% 우태아 혈청이 함유된 RPMI 1640 배지에 2X10, cells/mL로 부유시켰다.
- 청국장으로부터 우수한 미생물로 선발된 S2 균주는 현미경을 통해 미생물의 형태를 관찰한 결과, 그람양성 간균으로 운동성이 있고 포자를 형성하였다. 생리적 특성은 catalase test, V-P test, starch와 casein hydrolysis 등이 양성이었고 45℃에서 생육하고 호기성인 것으로 보아 Bergey's manual의 Bacillus subtilis의 특징과 유사하였다. 선발미생물의 당이용성 검토를 위해 API 50 CHB kit test를 실시한 후 API 50 CHB database V3.
- licheniformis El을 접종하여 청국장을 발효제조한 결과, 향과 맛에 있어 기호도가 좋지 않아 시판 청국장으로부터 발효 미생물을 분리하여 흔합배양을 통한 면역증강 물질 강화 청국장을 제조하고자 하였다. 시판 청국장을 멸균 생리식염수로 희석하여 선택배지에 도말하고 37℃에서 24시간 동안 배양하여 생육이 우수한 콜로니를 순수 분리하였다. 우수한 분리미생물을 선발하기 위해서 단백질 분해력, 청국장의 이화학적 특성조사와 관능검사를 실시하였다.
- 시판 청국장을 멸균 생리식염수로 희석하여 선택배지에 도말하고 37℃에서 24시간 동안 배양하여 생육이 우수한 콜로니를 순수 분리하였다. 우수한 분리미생물을 선발하기 위해서 단백질 분해력, 청국장의 이화학적 특성조사와 관능검사를 실시하였다. 시판 청국장으로부터 분리한 7종 균주(SI, S2, S3, S4, 501, 502, 503)와 B.
- Liquid scintillation counter(1450 Microbeta TriLux, PerkinElmer, Shelton, CT, USA)에 의해 세포내에 흡수된 3H-thymidine^H-TdR)의 양을 count per minute(cpm)으로 나타내어 균체분획 물질들에 의한 림프구의 증식 및 억제 현상을 측정하였다(21). 이때 최대 3H-TdR 조사량의 50%를 나타내는 면역증강 물질의 농도를 1 unit으로 정하였다.
- 이를 이용하여 면역증강 청국장을 제조하였으나 관능적인 측면에서 기호도가 좋지 않았고 아미노태 질소함량이 식품공전의 규격(280 mg%)에 적합하지 않았다. 이를 보완하기 위해 시판 청국장으로부터 발효미생물을 분리하였다. 단백질 분해효소 활성과 청국장 발효제조시 기호도에서도 가장 우수한 청국장 발효 미생물이 선발되었고 동정한 결과 B.
- 증자한 대두에 단일균주 B. licheniformis El, B. subtilis S2 및 B. licheniformis El과 B. subtilis S2의 혼합균주를 각각 starte로 하여 4(TC에서 48시간 동안 청국장을 발효제조하였다. 그리고 동일한 양의 시판 청국장을 구입하여 이화학적 특성조사를 비교한 결과, 청국장의 생균수는 거의 차이가 없었다.
- 원료 대두를 10C에서 24시간 동안 침지한 후 물빼기를 하여 121℃에서 30분간 증자하였다. 증자한 후 50℃로 냉각시키고 brain heart infusion(Difco Lab., Sparks, MD, USA) 액체배지에서 배양(40℃, 24 hr)한 미생물 배양액을 starter로 대두량의 l%(v/w)를 접종하였다. 발효조건은 401에서 48시간 동안 발효하였고 이때 항온기 내부의 습도는 70%를 유지하였다.
- 혼합 starter로 청국장을 발효하기 위한 미생물은 시판 청국장(서일농원, 경기도 일죽면)으로부터 미생물을 분리하였다. 청국장 1g을 멸균 생리식염수에 1/10씩 연속 희석한 후 선택배지(trjptic soy broth 30 g, agar 15 g, 청국장 마쇄 여과액 0.5 L, 증류수 0.5L)에 100 μL씩 도말하여 37℃에서 24시간 동안 배양한 후에 미생물 집락의 형태에 따라 서로 다른 미생물을 분리하였다. 분리한 미생물은 단백질 분해효소 활성측정과 청국장 제조에 사용하였다.
대상 데이터
- 발효조건은 401에서 48시간 동안 발효하였고 이때 항온기 내부의 습도는 70%를 유지하였다. 대조구로 사용된 시판청국장 (생청국장)은 시장에서 구입하여 실험재료로 사용하였다.
- 본 실험에 사용된 미생물은 전통된장에서 분리한 면역증강 물질을 생산하는 Bacillus licheniformis El을 사용하였다(22). 혼합 starter로 청국장을 발효하기 위한 미생물은 시판 청국장(서일농원, 경기도 일죽면)으로부터 미생물을 분리하였다.
- 5L)에 100 μL씩 도말하여 37℃에서 24시간 동안 배양한 후에 미생물 집락의 형태에 따라 서로 다른 미생물을 분리하였다. 분리한 미생물은 단백질 분해효소 활성측정과 청국장 제조에 사용하였다.
- 원료 대두는 2003년에 수확된 충주산 백태를 구입하여 사용하였고 청국장은 Lee 등(24)의 방법에 따라 제조하였다. 원료 대두를 10C에서 24시간 동안 침지한 후 물빼기를 하여 121℃에서 30분간 증자하였다.
- 혼합 starter로 청국장을 발효하기 위한 미생물은 시판 청국장(서일농원, 경기도 일죽면)으로부터 미생물을 분리하였다. 청국장 1g을 멸균 생리식염수에 1/10씩 연속 희석한 후 선택배지(trjptic soy broth 30 g, agar 15 g, 청국장 마쇄 여과액 0.
데이터처리
- 관능검사 결과의 통계처리는 ANOVA. test를 이용하였고 Duncan's Multiple Range test로 유의성을 검정하였다(26).
- 청국장의 관능검사는 훈련된 8명의 관능요원을 대상으로 외관, 향, 쓴맛, 구수한 맛, 전체적인 기호도의 5개 검사항목에 대하여 5점 평점법(청국장으로서의 특성이 1: 매우 나쁘다, 2: 비교적 나쁘다, 3: 보통이다, 4: 비교적 좋다, 5: 매우 좋다)으로 실시하였으며 관능검사 결과의 통계처리는 ANOVA. test를 이용하였고 Duncan's Multiple Range test로 유의성을 검정하였다(26).
이론/모형
- 분리 미생물의 단백질 분해력 측정은 isolated soy protein(ISP) 을 기질로 하는 Anson 개량법을 사용하여 측정하였다(23). 분리 미생물은 액체배지(1% sucrose, 1% soytone, 0.
- 청국장의 생균수는 청국장 1 g당 colony 생성비율(colony formation unit/g)을 log로 나타내었다. 청국장의 아미노태 질소와 조단백질 함량은 각각 Formol 적정법과 Kjeldahl법으로 측정하였다(25). 면역증강 물질은 청국장에 증류수를 가하고 현탁(180rpm, 15 min)한 후 여과망을 이용하여 여과액을 분리하였다.
- , Detroit, MI, USA)에서 37℃, 24시간 동안 배양한 후 동정에 사용하였다. 현미경 관찰을 통한 미생물의 형태학적 특성 및 생화학적 특성을 규명하고 이 결과를 토대로 Bergey's manual of determinative bacteri-ologW에 준하여 동정하였다(27). API 50 CHB kit(bioMeri-eux Co, Many FEtoile, France)으로 49개의 탄소원에 대한 이용성을 조사하고 이 결과를 API 50 CHB database V3.
성능/효과
- 후 관능평가 결과를 Table 3에 나타내었다. B. licheniformis El 과 B. subtilis S2의 혼합균주를 접종하여 발효한 청국장의 기호도가 B. licheniformis El만 접종하여 발효한 청국장보다 대체로 높았고 특히 40℃의 온도로 청국장을 발효했을 때 가장 기호도가 좋았다. Ko 등(5)은 30, 37, 40, 5(TC의 온도별로 최적 발효온도 조건을 조사한 결과, 40℃에서 발효속도가 이상적으로 빠르게 진행하였고 40℃와 상대습도 90%에서 1일 이상이면 발효가 충분히 완료되었다고 보고하였는데 이는 본 연구와도 유사하였다.
- subtilis S2의 혼합균주를 각각 starte로 하여 4(TC에서 48시간 동안 청국장을 발효제조하였다. 그리고 동일한 양의 시판 청국장을 구입하여 이화학적 특성조사를 비교한 결과, 청국장의 생균수는 거의 차이가 없었다. 아미노태 질소함량은 시판 청국장이 443 mg%로 가장 높았고 B.
- 이를 보완하기 위해 시판 청국장으로부터 발효미생물을 분리하였다. 단백질 분해효소 활성과 청국장 발효제조시 기호도에서도 가장 우수한 청국장 발효 미생물이 선발되었고 동정한 결과 B. subtilis S2로 명명하였다. 청국장 발효에 있어서 최적 발효온도와 최적 발효시간을 조사한 결과 40℃에서 48시간 동안 발효하였을 때의 기호도가 가장 우수하였다.
- 청국장 발효에 있어서 최적 발효온도와 최적 발효시간을 조사한 결과 40℃에서 48시간 동안 발효하였을 때의 기호도가 가장 우수하였다. 단일균주 B. licheniformis El, B. subtilis S2 및 B. licheniformis El과 B. subtilis S2의 혼합균주를 각각 접종하여 발효 제조한 청국장과 시판 청국장을 대조구로 사용하여 청국장의 기호도, 이화학적 특성조사와 면역증강 활성 비교를 조사하였는데, B. licheni-formis El과 B. subtilis S2의 혼합균주를 접종하여 제조한 청국장에서 기호도가 가장 우수하였고 아미노태 질소함량과 조단백질 함량은 359 mg%와 45.6%로 식품공전의 규격에 적합하였다. 청국장으로부터 면역증강 물질을 분리하여 마우스 비장 림프구의 증식 및 억제 현상을 측정한 결과, 20, 480unit으로 림프구의 증식에 있어서도 가장 효과적인 것으로 확인되었다.
- 따라서 단백질 분해력과 청국장의 기호도에서 가장 우수한 S2 균주를 선발하였고, 면역증강 물질을 생산하는 B. licheniformis El과 우수한 청국장 발효능을 가진 S2 균주를 혼합하여 제조하는 것이 효과적일 것으로 평가되었다.
- 또한, 청국장의 관능검사를 통하여 우수한 미생물을 선발하였는데, 종합적으로 색, 향, 맛에 있어서 분리균주 S2를 접종하여 발효제조한 청국장의 기호도가 가장 좋았다. 아미노태 질소 함량이 적은 청국장은 관능검사의 결과에서도 기호도가 낮다는 것을 확인할 수 있었다(Table 1).
- 분리한 발효미생물들을 청국장에 각각 접종하여 발효제조한 후 생균수를 조사한 결과, 분리균주들의 생균수 차이는 거의 없었다. 아미노태 질소는 장류의 품질지표로 사용되고 있으며 우리나라 식품공전의 규격에는 청국장의 아미노태 질소함량을 280 mg% 이상으로 규정하고 있다(28).
- 생리적 특성은 catalase test, V-P test, starch와 casein hydrolysis 등이 양성이었고 45℃에서 생육하고 호기성인 것으로 보아 Bergey's manual의 Bacillus subtilis의 특징과 유사하였다. 선발미생물의 당이용성 검토를 위해 API 50 CHB kit test를 실시한 후 API 50 CHB database V3.0을 이용하여 동정한 결과, B. wbtilis와 98.9%의 유사성을 나타내었고 B. subtilis S2로 명명하였다(Table 2).
- 우수한 분리미생물을 선발하기 위해서 단백질 분해력, 청국장의 이화학적 특성조사와 관능검사를 실시하였다. 시판 청국장으로부터 분리한 7종 균주(SI, S2, S3, S4, 501, 502, 503)와 B. licheniformis El의 단백질 분해효소 활성을 비교한 결과, 분리균주 S2가 15.6unit/mL로 단백질 분해력이 가장 높았다(Fig. 1).
- 청국장의 기호도가 가장 좋았다. 아미노태 질소 함량이 적은 청국장은 관능검사의 결과에서도 기호도가 낮다는 것을 확인할 수 있었다(Table 1). 혼합균주로 청국장을 발효하기 위해 B.
- 그리고 동일한 양의 시판 청국장을 구입하여 이화학적 특성조사를 비교한 결과, 청국장의 생균수는 거의 차이가 없었다. 아미노태 질소함량은 시판 청국장이 443 mg%로 가장 높았고 B. licheniformis El만 접종한 청국장의 경우 식품공전의 규격인 280 mg%에 미치지 못하였지만 B. licheniformis El과 B. subtilis S2의 혼합균주를 접종하여 제조한 청국장은 359 mg%로 식품공전의 규격에 적합하였다. 조단백질 함량은 모든 시험구에서 43.
- 아미노태 질소는 장류의 품질지표로 사용되고 있으며 우리나라 식품공전의 규격에는 청국장의 아미노태 질소함량을 280 mg% 이상으로 규정하고 있다(28). 이와 같이 청국장의 질소성분 변화는 아미노태 질소의 함량을 이용하여 측정하였는데, 분리균주 502를 접종하여 발효제조한 청국장에서 571 mg%으로 가장 높은 함량을 나타내었으나 B. licheniformis EV을 접종하여 제조한 청국장은 220 mg%으로 식품공전의 규격에 적합하지 않았다. 조단백질 함량은 모든 시험구에서 47.
- subtilis S2의 혼합균주를 접종하여 제조한 청국장은 359 mg%로 식품공전의 규격에 적합하였다. 조단백질 함량은 모든 시험구에서 43.548.3%의 범위로 식품공전의 규격(10% 이상)에 적합하였다. 청국장의 관능검사는 대부분의 항목에서 B.
- licheniformis EV을 접종하여 제조한 청국장은 220 mg%으로 식품공전의 규격에 적합하지 않았다. 조단백질 함량은 모든 시험구에서 47.0-48.2%의 범위로 식품공전의 규격(10% 이상)에 적합하였다. Youn 등(4)에 의하면 아미노태 질소함량은 발효미생물의 단백질 분해효소의 활성과 비례한다고 보고하였는데 이는 본 연구와도 유사하였다.
- subtilis S2로 명명하였다. 청국장 발효에 있어서 최적 발효온도와 최적 발효시간을 조사한 결과 40℃에서 48시간 동안 발효하였을 때의 기호도가 가장 우수하였다. 단일균주 B.
- subtilis S2의 혼합균주를 각각 접종하여 발효제조한 청국장과 시판 청국장을 대조구로 사용하여 면역증강 물질을 분리하고 면역활성을 비교하였다. 청국장으로부터 면역증강 물질을 분리하여 마우스 비장 림프구의 3H-thymidine(3H-TdR) 측정방법에 의해 림프구의 증식 및 억제 현상을 측정한 결과, B. licheni-formis El과 B. subtilis S2의 혼합균주로 발효한 청국장에서 20, 480 unit으로 782% 정도의 림프구 증식율을 나타내 가장 효과적이었음을 알 수 있었다(Fig. 2). Kwon 등(18)은 B.
- 6%로 식품공전의 규격에 적합하였다. 청국장으로부터 면역증강 물질을 분리하여 마우스 비장 림프구의 증식 및 억제 현상을 측정한 결과, 20, 480unit으로 림프구의 증식에 있어서도 가장 효과적인 것으로 확인되었다.
- 청국장으로부터 우수한 미생물로 선발된 S2 균주는 현미경을 통해 미생물의 형태를 관찰한 결과, 그람양성 간균으로 운동성이 있고 포자를 형성하였다. 생리적 특성은 catalase test, V-P test, starch와 casein hydrolysis 등이 양성이었고 45℃에서 생육하고 호기성인 것으로 보아 Bergey's manual의 Bacillus subtilis의 특징과 유사하였다.
- 3%의 범위로 식품공전의 규격(10% 이상)에 적합하였다. 청국장의 관능검사는 대부분의 항목에서 B. licheniformis El과 B. subtilis S2의 혼합균주로 발효제조한 청국장의 기호도가 각각의 단일균주로 발효한 청국장 및 시판청국장보다 가장 좋은 것으로 평가되었다(Table 4).
- 청국장의 발효온도를 40℃로 설정하고 단일균주 B. licheniformis El과 B. licheniformis El과 B. subtilis S2의 혼합균주를 접종한 청국장을 36시간, 4&시간, 60시간 조건으로 발효제조하여 관능검사한 결과, B. licheniformis El만 접종하여 발효한 청국장보다 B. licheniformis El과 B. subtilis S2의 혼합균주를 접종하여 발효한 청국장의 기호도가 좋았고 발효시간이 적을수록 청국장의 쓴맛은 감소되었으나, 48시간동안 발효하였을때 대부분의 항목에서의 기호도가 가장 좋은 것으로 평가되어 B. licheniformis El과 B. subtilis S2의 혼합균주를 사용하여 40℃에서 48시간 동안 청국장을 발효제조하는 공정이 관능적인 측면에서 효과적일 것으로 평가되었다. Choi 등(3)도 청국장의 발효가 과다하게 진행하였을 때 기호도가 떨어지는 것으로 보고하였으며, 이는 암모니아 취의 생성 때문인 것으로 추측하였다.
- 아미노태 질소 함량이 적은 청국장은 관능검사의 결과에서도 기호도가 낮다는 것을 확인할 수 있었다(Table 1). 혼합균주로 청국장을 발효하기 위해 B. lichenifbrmis El과의 길항성 유무를 확인한바 분리균주 502는 B. lichenifbrmis El 의 생육을 억제함으로 나타났다(Data not shown).
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