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문제 정의
- 본 연구에서는 기존 연구개발되어진 항산화제 및 항균제 보다 효과적이고 안전하며 우수한 활성을 발현하는 기능성 식품을 천연물로부터 개발하기 위한 연구의 일환으로 한국에 자생하며 한방약으로 사용되는 약용식물인 암대극을 극성에 따라 용매 추출하여 항산화능 및 항균 활성을 조사하였다.
- 한방약으로 사용되어 왔던 약용식물인 임대극을 본 연구에서는 ethanol 및 극성에 따라 용매분획주줄하여 항산화능에 대한 생리 활성을 검정하였다. 각각의 추출물에 대한 항산화 활성 결과는 Table 2에 나타내었다.
가설 설정
- 1)No inhibity zone was formed.
- 1)Diameter. 2)No inhibity zone was formed.
제안 방법
- B. cercus, L. monocytogenes 그리고 E coll 의 생육 저해 곡선측정은 각 추출물 시료를 액체 배지에 100, 250, 500 및 1000 ppm 농도로 처리하여 O.D 값이 0.4가 될 때까지 키운 세균 배양액 0.1 mL를 신선한 배지 lOmL에 접종하여 shaking incubator (120rpm)를 이용하여 최적 온도에서 배양하면서 미생물 생육 저해는 rnicroplate reader(Bio-TEK Instrumenis Inc., USA)를 통해 650nm에서 12시간 간격으로 72 시간 동안 측정하였다.
- 대조군으로는 ascorbic acid, butylated hydroxy anisole(BHA), trolox를 사용하였다. DPPH radical 소거 활성은 DPPH의 흡광도가 50% 감소할 때 나타나는 시료의 농도(IC50)로 표시하였으며, 각 시료는 3회 반복하여 실험을 실시하여 평균값을 구하였다.
- 동일한 방법으로 dichloromethane, ethylacetate, butanol 그리고 water 층을 분획하여 각각의 분획물을 얻었으며, 모든 과정은 3회 반복 실시하였다. 각 분획물은 해당 용매로 용해시켜 0.2 μm membrane filter (Advantec MPS Inc., USA)로 제균하여 4℃에 보관하면서 본 연구에 사용하였다.
- 즉 80% ethanol 추출물에 10배의 증류수와 "-hexane을 첨가하여 분획한 후감압 농축하여 얻었다. 동일한 방법으로 dichloromethane, ethylacetate, butanol 그리고 water 층을 분획하여 각각의 분획물을 얻었으며, 모든 과정은 3회 반복 실시하였다. 각 분획물은 해당 용매로 용해시켜 0.
- 2mW] 시료를 농도별로 첨가하고 25℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후 반응액과 동일한 양의 Griess시약 [2.5% (v/v) phosphoric acid, 1% (w/v) sulfanilamide, 0.1% (w/v) naphylethylenediamine]을 첨가하였다. 실온에서 10분 동안 반응시킨 후 540nm에서 흡광도를 측정하여 잔존하는 아질산염(nitrite)의 양으로 nitric oxide 소거 활성을 산출하였다.
- 즉, 각 균주 1백금이를 취하여 10mL 의 broth에 접종하고 최적 온도에서 18시간 동안 배양하였다. 배양한 세균을 Spetrophotometer(Ultrospec 2100 pro, Amersham Biosciences, USA)를 사용하여 650nm에서 optical density(O.D)값를 0.4(11/ CFU/mL)로 흡광도를 조절하고 pour-plate method에따라 배지가 분주된 배양접시에 균일하게 섞은 후 실온에서 굳혔다. 이 배지 위에 멸균된 paper disc를 시료수에 맞게 올리고 밀착시킨 후각각의 시료를 1000 ppm으로 흡수시켰다.
- 1% (w/v) naphylethylenediamine]을 첨가하였다. 실온에서 10분 동안 반응시킨 후 540nm에서 흡광도를 측정하여 잔존하는 아질산염(nitrite)의 양으로 nitric oxide 소거 활성을 산출하였다. Nitric oxide 소거 활성은 흡광도가 50% 감소할 때 나타나는 시료의 농도(IJ50)로 표시하였다.
- 암대극 추출물이 paper disc method에 의해 우수한 항균활성을 갖고 있음을 확인된 바, 이에 식품 유해 미생물에서의 생육을 저해시키는 최소저해농도(minimum inhibitory concentrction)을 즉정 비교해 보았다. Table 5에서 보듯이 본 실험에 사용된 모든 균주를 대상으로 80% ethanol 추출물, etliylacetate 그리고 butanol 분획 물은 100 ppm 농도에서부터 높은 생육 저해 효과를 나타냈으며, water 분획물은 250 ppm, dichloromethane 분획물은 500 ppm 농도에서부터 최소 생육 저해 효과를 나타냈다.
- 암대극(E. joikini)과 동일 속 식물인 대극(E. pekinensis)에는 flavonol glyco-side의 galloyl 유도체들인 가수분해성tannin과 붉은 대극(E. ebrac- teolata)인 경우에는 flavonol glycoside의 galloyl 유도체들과 isoquercetin, kaempferol, quercetin, astragalin, afeelin, rutin 등과 같은 페놀성 화합물이 다수 포함되어 있다는 보고(27, 28)가 있어 여기서는 tannic acid 표준 곡선을 이용하여 암대극 시료의 총 폴리페놀 함량을 측정하였다(Fig. 2). 그 결과 80% ethanol 추출물에서의 총 폴리페놀 함량은 162.
- 이러한 식품 강화 물질을 발굴하고자 해안가에 자생히며 유독성 식물로 알려진 암대극(E. jolkini)의 전초를 대상으로 ethanol 추출 및 용매분획하여 총 폴리페놀 함량을 분석하고 그에 따른 항산화 활성 및 식품 유해 미생물에 대한 항균 활성을 비교 측정하였다. 그 결과 암대극(E.
- 자연적으로 nitric oxide를 생성하는 물질인 sodium nitroprusside (SNP)를 사용하여 시료의 nitric oxide 소거 활성을 검색하였다 (23, 24). 10mM SNP 용액 0.
- 다음과 같이 측정하였다. 즉 well plate에 각 추출물 시료를 0, 100, 250, 500 및 1000 ppm 농도로 처리하여, 여기에 O.D 값이 0.4가 될 때까지 키운 세균 배양액을 10C배 희석 하여 접종 시켜 24시간 배양한 후, 세균배양액의 증식 정도를 microplate read;:r(Bio-TEK Instrumenis Inc., USA)로 650nm에서 측정하였다.
- 대조 구는 80% ethanol을 실험군과 동일한 빙-법으로 점적하였다. 최적 온도에서 24시간 배양한 후 disc 주변에 생성뇐 생육저해환(clear zone, mm)의 크기를 측정하여 항균 활성을 비교 분석하였다.
- 11 μg/mL로 가장 우수한 항산화 활성을 보여 주었다. 항균 활성은 paper disc method, 미생물생장곡선 그리고 최대 억제농도(MIC)을 측 정 비교히였다. Paper disc method에서는 조 추출물인 80% ethanol 및 ethylacetate와 butanol 분획물에서 농도가 증가할수록 항균력을 나타내는 inhibition zone 크기도 같이 증가 하였으며, 특히 ethylacetate 분획물에서 가장 높은 힝균력을 보여주었다.
대상 데이터
- 4 mM DPPH(Sigma Chemical Co, USA)용액을 동량 첨가하여 실온에서 10분간 방치한 후 517nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는 ascorbic acid, butylated hydroxy anisole(BHA), trolox를 사용하였다. DPPH radical 소거 활성은 DPPH의 흡광도가 50% 감소할 때 나타나는 시료의 농도(IC50)로 표시하였으며, 각 시료는 3회 반복하여 실험을 실시하여 평균값을 구하였다.
- 균주 종류와 배지 조성은 Table 1과 같다. 배지는 trypticsoybean agar(TSA), tryptic soybean broth(TSB), brain heart infu- sion(BHI)는 Difbo(USA)사의 제품을 사용하였다.
- 임대극 건조 분말(253 g)을 80% ethanol로 추출한 후 여과하여 얻어진 추출액를 감압농축하여 조 추출물 66.63 g을 얻었다. 그리고 ethanol 주 줄물 중 15 g을 증류수 1 L에 현탁시킨 후에 n- hexane(l L x 3), dichloromethane(l L x 3), ethylacetate(l L x 3) 그리고 butanol(l L x 3) 등으로 순차적으로 분획히-여 /7-hexane 층에서 2.
- 제주도 해안가 일대에 자생하고 있는 암대극(Euphorbia jolkini Boiss) 전초를 2006년 4월에 채집하여 대한식물도감(19)을 참고하여 동정하였으며, 동정된 암대극을 증류수로 2-3회 수세한 뒤 물기를 제거한 후 7일간 음건.분쇄하여 추출용 시료로 사용하였다.
- 주줄은 80% ethanol(EtOH) 및 분획용 ”-hexane, dichloromethane (CH2C12), ethylacetate(EtOAc) 그리고 butanol(BuOH)을 사용하였으며, Fig. 1에 나타난 바와 같이 순차적으로 용매 추출하였다. 즉 80% ethanol 추출물에 10배의 증류수와 "-hexane을 첨가하여 분획한 후감압 농축하여 얻었다.
- 항균 활성 검색은 식중독을 일으키는 Gram(+) 세균 4종과 Gram(-) 세균 5종으로 종 9종의 균수를 사용하였으며, 본 연구에 사용한 균주 종류와 배지 조성은 Table 1과 같다. 배지는 trypticsoybean agar(TSA), tryptic soybean broth(TSB), brain heart infu- sion(BHI)는 Difbo(USA)사의 제품을 사용하였다.
이론/모형
- Xanthine/xanthine oxidase에 의한 uric acid 생성은 290nm에서증가된 흡광도값에 의해 산출하였고, superoxide의 양은 nitroblue tetrazolium(NBT) 환원 방법에 의해 측정하였다 (22). 반응액은 각 시료의 여러 농도와 0.
- 각 균주의 최소저해 농도(MIC)은 broth microdilution 빙, 법(25)에 따라 다음과 같이 측정하였다. 즉 well plate에 각 추출물 시료를 0, 100, 250, 500 및 1000 ppm 농도로 처리하여, 여기에 O.
- 암대극 주출물을 paper disc method로 식품유해 미생물을 적용시켜 항균활성을 측정하였다. Gram(+) 세균에서는 Table 3에서 보듯이 80% ethanol 추출물, ethylacetate, butanol 및 water 분획물에서 처리 농도가 증가할수록 항균 활성을 나타내는 inhibition zone 크기도 비례적으로 증가하였으며, 특히 ethyiacetate 분획물인 경우 S.
- 암대극의 항균력을 검색하기 위해 본 연구에서는 paper disc method(15)을 사용하였다. 즉, 각 균주 1백금이를 취하여 10mL 의 broth에 접종하고 최적 온도에서 18시간 동안 배양하였다.
- 총 폴리페놀 화합물의 함량은 Folin-Denis 방법(20)에 따라 측정하였다. 즉, 암대극 추출물 시료를 I mg/mL로 녹인 다음 0.
성능/효과
- cereus., L. monocvtogenes 그리고 E. coli등 3종의 균주에 대해 미생물 증식과 관련하여 생육 특성에 미치는 영향을 측정해보았다, 그 결과, B. cereus 균주는 모든 추출물에 대해 처리 농도가 증가할수록 현저한 생육저해효과를 나타났는데, 특히 ethylacetate 분획물인 경우 저농도에서도 균의 증식이 빠른 속도로 증가하다가 6시간이후 급격히 성장이 저해됨으로써 효율적인 항균 활성을 보여주었다(Fig. 3). L.
- 3). L. monocytoge- nes 균주에서는 암대극 주줄물 중 ethylacetate와 butanol 분획물에서 처리 농도가 증가할수록 균의 증식이 감소되었으나, n-hexane 과 dichloromethane 분획물에서는 500 ppm 이상의 고농도 처리 시에도 그다지 현저한 차이를 볼 수 없었다 (Fig. 4). 그러나 E.
- 항균 활성은 paper disc method, 미생물생장곡선 그리고 최대 억제농도(MIC)을 측 정 비교히였다. Paper disc method에서는 조 추출물인 80% ethanol 및 ethylacetate와 butanol 분획물에서 농도가 증가할수록 항균력을 나타내는 inhibition zone 크기도 같이 증가 하였으며, 특히 ethylacetate 분획물에서 가장 높은 힝균력을 보여주었다. 최대억제 농도는 모든 균주에서 80% ethanol 추출물 및 ethylacetate와 butanol 분획물에서 100 ppm 농도로 처리 시 최소 생육 저해 효과를 보였으며, 또한 암대극 추출물이 식품 유해 미생물인 B.
- 비교해 보았다. Table 5에서 보듯이 본 실험에 사용된 모든 균주를 대상으로 80% ethanol 추출물, etliylacetate 그리고 butanol 분획 물은 100 ppm 농도에서부터 높은 생육 저해 효과를 나타냈으며, water 분획물은 250 ppm, dichloromethane 분획물은 500 ppm 농도에서부터 최소 생육 저해 효과를 나타냈다. 반면 rz-hexane 분획물은 고농도에서도 생육저해효과를 보이지 않았다.
- 2). 그 결과 80% ethanol 추출물에서의 총 폴리페놀 함량은 162.08 mjeg± 0.445, ”-hexane 분획물에서 12.64 mg/g± 0.049, dichloromethane 분획물에서 48.1 meg± 0.143, ethylacetatc 분획물에서 544.08 mg/g± 1.452, butanol 분획물에서 176.42 mg/g± 0.483, 그리고 water분획 물에서 30.00 mg/g ±0.095로 나타났으며 그 중 가장 높은 폴리페놀 함량을 나타낸 것은 ethylacetate 분획물로 조 추출물에 비해 3.4배가량 증가하는 경향을 보였다. 이와 같은 결과로 유추해보면 암대극 또한 다른대극속 식물과 마찬가지로 페놀성 화합물을 다수 함유하고 있음을 의미한다.
- jolkini)의 전초를 대상으로 ethanol 추출 및 용매분획하여 총 폴리페놀 함량을 분석하고 그에 따른 항산화 활성 및 식품 유해 미생물에 대한 항균 활성을 비교 측정하였다. 그 결과 암대극(E. jolkini)은 다른 대극 속 식물과 마찬가지로 페놀성 화합물을 다수 함유하고 있음을 확인할 수 있었으며, 총 폴리페놀 함량이 높게 나타난 ethylacetate 증에서 DPPH radical 소거활성, xanthine oxidase 저해활성, superoxide 소거활성 및 nitric oxide 소거 활성의 IC50 값이 각각 8.38 μg/mL, 'mL, 466.01 ng/ mL, 11.39 |.ig/mL, 332.
- 4). 그러나 E. col 균주에서는 ethylacetate 분획물에서뿐만 아니라 butanol 분획물에서도 현저한 생육저해 효과를 보여주므로써 선반직으로 B. cereus 의 결과와 유사한 생육 저해 효과를 나타냈다 (Fig. 5).
- 본 연구를 통해 암대극은 산소유리기의 자유기를 소거할 수 있는 우수한 생리활성물질을 다수 함유하고 있음을 확인할 수 있었으며 또한 총폴리페놀 함량이 가장 높은 ethylacetate 분획물에서 항산화 효괴-가 가장 높게 나타남으로써 암대극에서의 항산화 능을 나타내는 주된 물질은 페놀성 화합물임을 간접적으로 확인할 수 있었다. 특히 분획 레벨에서의 활성이 대조구 성분 못지않게 우수하게 나타난 것은 앞으로 암대극을 이용한 천연항산화제루서 개발 가능성이 높다고 사료된다.
- 전자공여능 측정에 시용된 DPPH의 free radical 소거 활성은 ethylacetate와 butanol 분획물에서 다른 용매 분획 물에 비해 대단히 높은 radical 소거 활성을 나타냈으며, xanthine oxidase 저해활성은 ethylacetate 분획물에서, superoxide radical 소거 활성과 nitric oxide 소거 활성은 ethylacetate와 butanol 분획물에서가 높게 나타났다. 전반적으로 가장 우수한 항산화 활성을 보인 추출물은 ethylacetate 분획물로 각각의 DPPH의 free radical 소거 활성, xanthine oxidase 저해활성, superoxide 소거 활성 및 nitric oxide 소거 활성의 IC50 값은 8.38 pig/mL, 466.01 fig/mL, 11.39 μg/mL, 332.11 gg/mL 이 었다. 총 폴리페놀 함량이 가장 높게 나타난 ethylacetate 분획물에서 전자공여능이 가장 높게 나타난 것으로 보아 페놀성 화합물과 전자공여능과는 서로 밀접한 관계가 있음을 확인할 수 있었고, 특히 ethylacetate 분획물은 대조군으로 사용된 합성항산화제인 BHA(22.
- 각각의 추출물에 대한 항산화 활성 결과는 Table 2에 나타내었다. 전자공여능 측정에 시용된 DPPH의 free radical 소거 활성은 ethylacetate와 butanol 분획물에서 다른 용매 분획 물에 비해 대단히 높은 radical 소거 활성을 나타냈으며, xanthine oxidase 저해활성은 ethylacetate 분획물에서, superoxide radical 소거 활성과 nitric oxide 소거 활성은 ethylacetate와 butanol 분획물에서가 높게 나타났다. 전반적으로 가장 우수한 항산화 활성을 보인 추출물은 ethylacetate 분획물로 각각의 DPPH의 free radical 소거 활성, xanthine oxidase 저해활성, superoxide 소거 활성 및 nitric oxide 소거 활성의 IC50 값은 8.
- 11 gg/mL 이 었다. 총 폴리페놀 함량이 가장 높게 나타난 ethylacetate 분획물에서 전자공여능이 가장 높게 나타난 것으로 보아 페놀성 화합물과 전자공여능과는 서로 밀접한 관계가 있음을 확인할 수 있었고, 특히 ethylacetate 분획물은 대조군으로 사용된 합성항산화제인 BHA(22.70ng/mL)나 trolox(8.62 μg/mL)보다 전자공여능이 높게 나타났다. 그리고 xanthine/xanthine oxidase system에 의한 superoxide 소거활성 또한 대조군으로 사용된 allopurinol(22.
- Paper disc method에서는 조 추출물인 80% ethanol 및 ethylacetate와 butanol 분획물에서 농도가 증가할수록 항균력을 나타내는 inhibition zone 크기도 같이 증가 하였으며, 특히 ethylacetate 분획물에서 가장 높은 힝균력을 보여주었다. 최대억제 농도는 모든 균주에서 80% ethanol 추출물 및 ethylacetate와 butanol 분획물에서 100 ppm 농도로 처리 시 최소 생육 저해 효과를 보였으며, 또한 암대극 추출물이 식품 유해 미생물인 B. cereus, L. monocytogenes, E. coll 등 3송의균주를 대상으로 생육 특성에 미치는 영향을 측정한 결과, ethylacetate 분획물이 가장 효율적인 항균 활성을 보여 주었다.
후속연구
- 2와 Table 2의 결과에서 보듯이 ethylacetate 분획물에서의 종 폴리페놀 함량이 다른 분획물에 비해 월등히 높음에도 불구하고 항산화 활성에는 총 폴리페놀 함량 차이만큼 크나 큰 차이를 보이지 않았다. 그 원인으로는 암대극에 함유되어 있는 성분들이 radical 반응 전반에 걸쳐 반응성을 모두 억제하는 것이 아니라 활성산소의 종류나 radical source에 따라 또한 산화반응기작에 따라 반응성이 다르게 작용되기 때문이라 여겨지며, 이를 극복하기 위해선 반응기작에 따라 반응성을 억제할 수 있는 항산화물질 연구가 보다 더 세밀히 이루어져야 될 것으로 여겨진다.
- 암대극은 본 연구에 사용된 식품 유해 미생물에 대해 폭넓게 항균럭을 보여주었고, 그 중 총폴리 페놀 함량이 높게 나타난 ethylacetate 분획물에서 가장 우수한 항균 활성을 나타냄으로써 항균성에 관여하는 물질이 단일 성분이라고 단정 짓기는 어려우나 항산화 결과와 마찬가지로 주된 항균 활성 물질은 페놀성 화합물로 사료도며, 이상의 결과를 종합해 볼 때 암대극은 천연항산화제뿐만 아니라 또한 천연 항균 소재로서의 개발 가능성도 높다고 사료된다.
- 나타내는 주된 물질은 페놀성 화합물임을 간접적으로 확인할 수 있었다. 특히 분획 레벨에서의 활성이 대조구 성분 못지않게 우수하게 나타난 것은 앞으로 암대극을 이용한 천연항산화제루서 개발 가능성이 높다고 사료된다.
- 천연물에 존재하는 항균성 물질을 힝 균소재로 이용하고 자 하는 연구는 식품, 의약 및 생물공학산업 등에서 오래전부터 활발히게 연구가 진행되고 있으나 대부분 항균성에 대한 연구가 식품(8-10)이나 한약재(11-15)로 이용되는 식물체에 국한되고 있고 주위에서 흔히 구할 수 있는 많은 자생식물에 대해서는 연구가 미흡한 실정이다 (16, 17).특히 식용으로 이용되어 온 생약류인 경우 항균효과뿐만 아니라 다양한 생리활성을 가지고 있어 이를 굳이 정제하거나 순수 분리하는 과정을 거치지 않고 시품에 직접첨가가 가능할 것으로 사료되며, 그 경우 식품의 보존성 향상뿐만 아니라 인체에 유용한 다양한 생리활성을 동시에 섭취히는 효과를 얻을 수 있을 것으로 생각되어진다.
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