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문제 정의
- 본 연구는 인삼 재배 중 주요 병인 Cylindrocarpon destructans, Phytophthora cactorum, Botrytis cinerea, 등의 병원균에 대한 길항 미생물을 선발하여, 친환경적 인삼재배를 위한병방제를 위하여 방제효과를 시험하고 인삼의 고품질 안전생산 기술체계를 확립할 수 있는 기본 자료를 제공할 목적으로 수행하였다.
제안 방법
- 염기서열 분석을 위한 primer는 5'-GCC ACACTGGAACTGAGACAC-3' (nucleotides 311-330), 5'-TGTAGC GGTGAAATGCGTG-3' (nucleotides 684-703), S-GGAGCATGTGGT TTAATTCG-3' (nucleotides 944-963), 5'-CTACACACGTGCTACAA TGG-3' (nucleotides 1228-1247)을 이용하였다. NCBI (National Centers for Biological Information) genbank를 통해 염기서열의 상동성을 추적하였다.
- 이후 잔여 사슬 연장을 위해 72℃에서 10분 동안 반응시켰다. PCR 산물은 Wizard PCR Preps DNA Purification System (Promega)을 이용하여 정제하였다.
- 역병균 (Z cactorum)의 유주자 현탁액을 만들기 위하여, 역병균을 딩근쥬스배지(CaCQ 0.5 g, bacto agar 20 g, V8쥬스 100 ml-1)에서 5일간 배양하였다. 이 역병균의 균총 절편들을 당근쥬스배지에서 3일간 배양하였다.
- 재배하였다. 위 실험 (가)에서 분리된 길항균주들을 TSA배지에 2일간 30℃ 항온기에서 배양한 후, 현탁액 (1 X 109cfu MT)을 만들어 각 균주 당 9주씩 3반복으로 분무 접종하였다. 역병균을 접종하기 5일전에 인삼 줄기와 잎에 흐르도록 듬뿍 살포하였다.
- X 104 zoospores ml-1의 현탁액을 조제하였다. 이 현탁액을 인삼에 분무접종하였고, 접종 후 3, 5, 10일에 역병 발생 정도를 조사하였다.
- 인삼의 주요 병원균에 대해 항균력이 인정된 3개 길항균 주의 현탁액을 1년근 인삼의 잎과 줄기에 분무한 후 5일 뒤 역병균 (R cactorum)^\ 유주자를 분무 접종하였다. 길 항균 주를 처리하지 않은 인삼에서는 역병균을 접종한 3일 후부터 병반이 나타나기 시작하여 10일 후에는 약 95%의 인삼이 말라 죽었다.
- 정제된 plasmid는 DNA sequencer (Applied Biosystems 3, 100, USA)를 이용하여 염기서열을 분석하였다. 염기서열 분석을 위한 primer는 5'-GCC ACACTGGAACTGAGACAC-3' (nucleotides 311-330), 5'-TGTAGC GGTGAAATGCGTG-3' (nucleotides 684-703), S-GGAGCATGTGGT TTAATTCG-3' (nucleotides 944-963), 5'-CTACACACGTGCTACAA TGG-3' (nucleotides 1228-1247)을 이용하였다.
- Fusarium solani, Pythium idnnmni)에 대한 항균력을 대치배양법에 의해 조사하였다. 즉, 1/2 potato dextrose agar (PDA)에 cork borer (0 6 mm)로 구멍을 낸 후배지 중앙에 인삼병원균을 치상하고, 구멍 속에 분리된 미생물 현탁액 (1 X 109cfu 을 50 μl씩 접종하여 병원균에 대한 생육억지원의 직경을 측정하였다. 인삼병원균 7종은 농촌진흥청 농업과학기술원에서 분양받아 사용하였다.
- 증폭된 단편은 pGEM-T easy vector (Promega)에 클로닝하였다. 정제된 plasmid는 DNA sequencer (Applied Biosystems 3, 100, USA)를 이용하여 염기서열을 분석하였다.
대상 데이터
- 세균을 분리하였다. 그 중 5종류의 인삼병원균 (Cylindmcarport destructans, Rhizoctonia solani, Phytophthora cactorum, Botrytis cinerea, Fusarium 跖"沥)과의 대치배양으로 길항력을보이는 3종의 세균 (B8856, B8180, B7944)을 선발하였다. B8856은 C.
- 1년근 인삼을 포트 (65 cm X 25 cm)에 27주씩 심고, 온실에서 50일간 재배하였다. 위 실험 (가)에서 분리된 길항균주들을 TSA배지에 2일간 30℃ 항온기에서 배양한 후, 현탁액 (1 X 109cfu MT)을 만들어 각 균주 당 9주씩 3반복으로 분무 접종하였다.
- 정제된 plasmid는 DNA sequencer (Applied Biosystems 3, 100, USA)를 이용하여 염기서열을 분석하였다. 염기서열 분석을 위한 primer는 5'-GCC ACACTGGAACTGAGACAC-3' (nucleotides 311-330), 5'-TGTAGC GGTGAAATGCGTG-3' (nucleotides 684-703), S-GGAGCATGTGGT TTAATTCG-3' (nucleotides 944-963), 5'-CTACACACGTGCTACAA TGG-3' (nucleotides 1228-1247)을 이용하였다. NCBI (National Centers for Biological Information) genbank를 통해 염기서열의 상동성을 추적하였다.
- 즉, 1/2 potato dextrose agar (PDA)에 cork borer (0 6 mm)로 구멍을 낸 후배지 중앙에 인삼병원균을 치상하고, 구멍 속에 분리된 미생물 현탁액 (1 X 109cfu 을 50 μl씩 접종하여 병원균에 대한 생육억지원의 직경을 측정하였다. 인삼병원균 7종은 농촌진흥청 농업과학기술원에서 분양받아 사용하였다.
- 풍기인삼시험장에서 4년간 발효된 갈잎부숙퇴비 (약토)에서 300 g씩 4점의 시료를 채취하였다. 채취한 약토는 2.
이론/모형
- 미생물의 total genomic DNA는 Tsai & Olsen (1991)의 방법에 따라 Wizard Genomic DNA Purification (Promega Co., Madison, Wis., USA)을 이용하여 분리 . 정제하였다.
- 형성된 콜로니는 TSA 배지에서 다시 2일간 순수배양한 후, -70℃에 보관하였다. 이미 생물의 인삼 병원균 7종 (Cylindrocarpon destuctans, Rhizoctonia solani, Phytophthora cactorum, Botrytis cinerea, Alternaria panax. Fusarium solani, Pythium idnnmni)에 대한 항균력을 대치배양법에 의해 조사하였다. 즉, 1/2 potato dextrose agar (PDA)에 cork borer (0 6 mm)로 구멍을 낸 후배지 중앙에 인삼병원균을 치상하고, 구멍 속에 분리된 미생물 현탁액 (1 X 109cfu 을 50 μl씩 접종하여 병원균에 대한 생육억지원의 직경을 측정하였다.
성능/효과
- 그 중 5종류의 인삼병원균 (Cylindmcarport destructans, Rhizoctonia solani, Phytophthora cactorum, Botrytis cinerea, Fusarium 跖"沥)과의 대치배양으로 길항력을보이는 3종의 세균 (B8856, B8180, B7944)을 선발하였다. B8856은 C. d&ructans와 P. cactorum, R. solanie 대하여, B8180은 R. solani, P. cactorum, Fusarium solanie 대하여 강한 항균력을 보였으며, B7944는 P. cactorum, C. destructans, R. solanie 대하여 항균력을 보였다 (Table 1).
- 그리고 B7944 균주는 Burkholderia cepacia와 99% (1397/ 1403 bp) 이상의 상동성을 나타내었다 (Table 2). 이상의 결과를 토대로 B8180 균주는 Streptomyces lauretii, B8856 균주는 Bacillus subtilis, B7944 균주는 Burkholderia cepacic로고려된다.
- 세 길항균주의 동정을 위하여 각 세균의 16S ribosomal RNA gene의 염기서열을 분석한 결과 B8180 균주는 Streptomyces laurethe 99% (1375/1387bp)의 상동성을 나타내었고, B8856 균주는 Bacillus subtilis와 100%의 상동성을 나타내었다. 그리고 B7944 균주는 Burkholderia cepacia와 99% (1397/ 1403 bp) 이상의 상동성을 나타내었다 (Table 2).
- 그리고 B7944 균주는 Burkholderia cepacia와 99% (1397/ 1403 bp) 이상의 상동성을 나타내었다 (Table 2). 이상의 결과를 토대로 B8180 균주는 Streptomyces lauretii, B8856 균주는 Bacillus subtilis, B7944 균주는 Burkholderia cepacic로고려된다. 이 중 Bacillus subtilis B8856 균주는 구근류에 병원성을 나타내는 종이기 때문에 인삼에 있어서도 다른 두 균주와 함께 병원성 검정이 요구된다.
- 인삼 역병에 대해 방제효과가 인정된 세 길항균주의 형태를 전자현미경으로 관찰한 결과, B8180 균주는 진균의 균사 모양이었으며, B8856 균주와 B7944 균주는 각각 사방에 편모가 부착된 주모균과 한쪽에 편모가 부착된 속모균이었다 (Fig. 2).
- 인삼의 안정적인 생산 및 합리적인 병해방제에 기여하기 위하여 연구를 실시한 결과 갈잎 퇴비에서 분리된 Streptomyces lauretii B8180과 Bacillus subtilis B8856, Burkholderia cepacia B7944 세 균주의 인삼병원균 5종에 대한 항균력이 인정되었으며, 특히 실내실험을 통하여 높은 역병 방제효과가 인정되었다. 그러나 이 실험에서와 같이 식물의 지상부에 길항균을 살포하는 방법을 통하여 역병 방제효과를 높일 수 있을 것으로 생각된다.
후속연구
- 그러나 이 실험에서와 같이 식물의 지상부에 길항균을 살포하는 방법을 통하여 역병 방제효과를 높일 수 있을 것으로 생각된다. 이 길항균들은 갈잎 퇴비에서 분리되었기 때문에, 갈잎퇴비에서 증식시켜 인삼재배 예정지에 투입하면, 억제형 토양 (suppressive soil) 조성을 통한 주요병해 방제 가능성도 클 것으로 생각된다.
- 1). 또한 앞으로 수행할 뿌리썩음병 (Cylindrocarpon destructans, Fusarium solani)과 잘록병 (Rhizotonia solani, Pythium ultimum), 잿빛곰팡이병 (Botrytis cineria)에 대한 포트실험은 대치 배양에서의 결과로 보아 각 병원균에 대한 방제력이 충분히 있으리라 사료된다.
- , 1992) 연작장해의 주요 원인균으로 알려져 있다. 이와 같이 뿌리썩음 증상을 나타내는 토양 병원균은 발생 후에는 화학적인 방제가 거의 불가능한 실정이므로 길항미생물을 이용한 친환경적인 병방제 및 연작 장해피해 경감 대책을 위한 계속적인 연구가 시급하다.
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