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문제 정의
- 본 연구에서는 PAM의 단백질 전달체로서 가능성을 알아보기 위하여, 모델 단백질로 라이소자임 (lysozyme)을 이용하여 봉입률과 방출 특성에 관하여 조사하였다. PAM의 라이소자임 봉입률은 아세틸화 정도에 따라 차이가 남을 보였는데 PA1 의 경우 가장 낮은 값을 보인 반면, PA5의 경우 가장 높은 봉입률을 보였다(Table I).
- 하지만 사용된 미립 구의 재질이 산가수분해(acid hydrolysis)라는 고유의 특성을 가지고 있기 때문에 봉입된 단백질 약물의 변성을 촉진하여 미립구의 상품적 가치를 감소시킨다. 본 연구에서는 이러한 단점을 극복하기 위하여 다당류의 일종인 플루란을사용하여 미립구를 제조하여 단백질 전달을 시도 하였다. 하지만, 플루란은 수용성 고분자이기 때문에 그 자체만으로는 미립 구의 제조에 사용할 수 없다.
- 본 연구에서는 합성고분자가 갖는 단점을 극복함과 동시에 천연고분자의 단점인 W/O/W방법 사용시 휘발성 용매에 대한 난용성 문제를 해결하기 위하여, 생체적합성이 좋고 생분해 능을 가지고 있는 플루란 아세테이트(pullulan acetate) 를 합성하여 미립구를 제조하였다. 그리고 여기에 모델 단백질인 라이소자임 (lysozyme)을 사용하여 이 미립구의 단백질 전달체로서의 가능성 여부를 파악하였다.
제안 방법
- 2.3 mg/mL Micrococcus lysodeikticus(ATCC 4698) 세 포 현탁액 (66mM phosphate buffer pH 6.2) 중 100 μL을 앞선 실험에서 얻은 시료 라이소자임 1mL 중 150 μL (혹은 표준시료 용액 0-1 mg/mL)와 섞은 후 450nm에서 15초 간격으로 4분간 시간에 따른 흡광도 감소를 조사한다. 얻어진 곡선의 선형 부분의 기울기는 표준시료의 기울기와 관계가 있다.
- 2) 봉입 시 단백질 약물의 변성, 3) 산가수분해에 의해 봉입된 단백질의 활성 손실이라는 문제점을 극복하고자 다당류인 플루란을 아세트화(PA)하여 미립구(PAM)를 제조하였다. PA는 휘발성 용매인 methylene chloride 에 대해 용해도가 높아 W/O/W법을 이용한 단백질 약물전달체의 제조에 가능성을 가지고 있다.
- 각 PAM으로부터 라이소자임 방출 시험을 실시하였으며, 시험 방법은 다음과 같다. 미립구 20mg을 3mL PBS buflfer(pH 7.
- 표준시료 라이소자임 농도별 초기속도에 대한 표준값을 정한 후, 각 표준시료 라이소자임의 초기속도는 활성도 100%을 의미한다. 각 측정 시료의 초기속도를 계산 후 표준시료 초기속도와 비교하여 상대적 활성도를 계산한다.
- 합성하여 미립구를 제조하였다. 그리고 여기에 모델 단백질인 라이소자임 (lysozyme)을 사용하여 이 미립구의 단백질 전달체로서의 가능성 여부를 파악하였다. 플루란은 Aureobasidium pullulans에 의해 생산되는 포도당이 a-(l- 4) 또는 (1-6)로 연결되어 있는 중성선형 세포외 다당류 (extracellular polysaccharide) 로서 생체적합성이 뛰어나기 때문에 다양한 화학적 모사를 통하여 생체재료로 많이 연구되고 있다.
- 먼저, 미립구를 메탈 스터브 (metal stub) 위에 놓고 진공상태에서 gold 코팅을 한 후 전자현미경 촬영을 진행하였다.
- 본 논문에서는 다양한 정도로 아세트화된 플루란을 W/O/W법을 이용하여 라이소자임이 봉입된 미립구를 제조한 후라이소자임의 방출 특성과 방출된 라이소자임의 활성 (activity) 을 평가하였다.
- 본 연구에서는 미립구 안에 봉입된 라이소자임의 안정성을 두 가지로 분류하여 측정하였다. 첫 번째는 미립구내에봉입된 단백질의 안정성이고, 두 번째는 방출된 단백질의 안정성이다.
- 9wt% NaCl 용액 1 L에 주입하여미립구을 제조하였다. 원심분리법(2500rpm 3분간)으로 입자를 회수하였다.
- 두 번째는 단백질이 활성의 손상 없이 미립구 안에 봉입되었더라도 미립 구 안의 여러 가지 환경변화에 의해 활성을 잃게 되는 문제점을 가질 수 있다는 것이다. 이를 알아보기 위해 방출된 단백질의 활성을 측정하였다. Figure 5는 미립구 제조 시 라이소자임의 불용성화 정도를 보여 준다.
- 제조된 미립구의 라이소자임 봉입 률(lysozyme encapsula- tion%)을 측정하고자 다음과 같은 방법을 사용하였다. 20 mg (혹은 표준시료로 라이소자임 2.
- 제조된 미립구의 표면 분석은 전자현미경 (Scanning Electron Microscope; SEM(JSM-5800, JEOL))을 이용하여 수행되었다. 먼저, 미립구를 메탈 스터브 (metal stub) 위에 놓고 진공상태에서 gold 코팅을 한 후 전자현미경 촬영을 진행하였다.
- 플루란에 양친성을 도입하기 위하여 다음의 방법으로 아세트화(acetylation)를 시도하였다(Figure 1). 플루란 2 g을 20 mL 포름 아마이드에 넣고 50℃에서 강력하게 교반하여용해시켰다.
- 이러한 과정을 3회 이상 반복하여 불순물을 제거한다. 합성된 플루란 아세테이트는 FT-IR, NMR, GPC 등을 이용하여 치환도를 구하였다.
대상 데이터
- PA가 녹아 있는 MC 용액상에 라이소자임이 녹아 있는 수용액을 넣은 뒤 15초 간 격렬하게 vortex하여 W/O 상을 준비하였다. 준비한 W/O 용액을 20 wt% PVA/0.9wt% NaCl 용액 1 L에 주입하여미립구을 제조하였다. 원심분리법(2500rpm 3분간)으로 입자를 회수하였다.
- 플루란(Mw; 100, 000 Da)은 일본 Hayashibara사로부터 구입하여 사용하였고, 무수아세트산(Acetic anhydride), 피리딘 (pyridine), 라이소자임 (lysozyme) 등은 시그마(Sigma) 사로부터 구입하여 사용하였다. 그 외 화학약품과 용매는 특별한 정제과정 없이 특급시약을 사용하였다.
이론/모형
- 이렇게 합성된 5가지의 PA 시료들(PA1, 2, 3, 4, 5)은 W/O/W법을 이용하여 미립구 제조에 이용되었다. Figure 3 은 전자현미경을 이용한 PA 미립자들의 표면을 관찰한 것으로, 모든 시료로부터 제조된 미립자의 모양s] 구형을 이루고 있음을 보였다.
성능/효과
- PA는 휘발성 용매인 methylene chloride 에 대해 용해도가 높아 W/O/W법을 이용한 단백질 약물전달체의 제조에 가능성을 가지고 있다. PA로부터 제조된 미립구(PAM) 는 아세틸화가 증가할수록 균일한 입자 분포를 보였으며, 봉입효율 또한 증가하였다. 단백질 약물의 초기 방출은 미립 구제 조의 성패를 좌우한다 할 수 있는데 높은 이세틸화를 갖는 PAM의 경우 10% 내외의 초기방출을 보였다.
- 또한 PA 1, 2의 경우 방출 시작 10일 후방출이 거의 중지한 것을 보였지만, PA 4와 5의 경우 꾸준히 방출이 지속되어 40일 동안 단백질의 방출이 계속 됨을 보였다. PLGA 미립구를 이용한 라이소자임의 방출이 거의 PA 1, 2 미립구와 유사한 경향성을 보이는 것을 감안하면, PA 4와 5 미립구는 단백질 약물의 방출을 충분히 조절할 수 있다는 관점에서 매우 고무적이라고 생각된다.
- 또한 봉입된 단백질의 불활성 정도를 나타내는 불용성화 또한 높은 아세틸화 PAM에서 좋게 나타났다. 그리고 PA5에서 방출된 라이소자임은 거의 100%의 활성을 유지하였다.
- 이러한 낮은 초기 방출값은 PLGA 미립구의 경우에 비해서도 매우 낮은 값으로 단백질/펩타이드 약물의 전달체로서 가능성을 제시한다. 또한 PA 1, 2의 경우 방출 시작 10일 후방출이 거의 중지한 것을 보였지만, PA 4와 5의 경우 꾸준히 방출이 지속되어 40일 동안 단백질의 방출이 계속 됨을 보였다. PLGA 미립구를 이용한 라이소자임의 방출이 거의 PA 1, 2 미립구와 유사한 경향성을 보이는 것을 감안하면, PA 4와 5 미립구는 단백질 약물의 방출을 충분히 조절할 수 있다는 관점에서 매우 고무적이라고 생각된다.
- 단백질 약물의 초기 방출은 미립 구제 조의 성패를 좌우한다 할 수 있는데 높은 이세틸화를 갖는 PAM의 경우 10% 내외의 초기방출을 보였다. 또한 봉입된 단백질의 불활성 정도를 나타내는 불용성화 또한 높은 아세틸화 PAM에서 좋게 나타났다. 그리고 PA5에서 방출된 라이소자임은 거의 100%의 활성을 유지하였다.
- 05 로 유의적 차이가 있는 것을 확인할 수가 있었다. 또한PAI, PA.2, PA3, PA4, PA5에 대해서는 one-way ANOVA 분석 결과 p = 0.009로 각 개체간 차이가 있었으며, 세부적으로는, PA5에 대해서 PA1는 P = 0.024, PA2는 0.016, PA3는 0.007, RA4는 0.215로 나타났음. 즉, PA5에 대해서는 PA4 와 유의적 차이가 없으나, PAI, PA2, PA3에 대해서는 유의적 차이를 보였다.
- 'Figure 6은 PA5로부터 방출된 라이소자임의 활성을 측정한 것이다. 라이소자임의 활성도는 25일 간의 방출기간이 지난 후에도 거의 100%를 유지함을 알 수 있었다. 이는 미립구안의 환경이 크게 산성으로 바뀌지 않았다는 것을 의미함과 동시에 단백질과 미립구 사이에 아실레이션(acylation)과 같은 화학적 공유결합이 존재하지 않았다는 것을 의미한다.
- PA5의 경우 약 17% 정도로 상대적으로 가장 낮은 값을 보였다. 본 실험을 통계적 비교를 위해 유의성 test 결과 정규성 검증을 한 결과 정규분포를 따르고 있는 것을 확인했으며, PLGA에 대한 각 PA 샘플에 대한 2 sample t test 결과 PAI(P = 0.028), PA2(P = 0.004), PA3 (P = 0.005), PA4(P = 0.002), PA5(P = 0.002)로_ 모두 P<0.05 로 유의적 차이가 있는 것을 확인할 수가 있었다. 또한PAI, PA.
- 상기의 결과들로 보아 PAM은 생체 적합성과 분해성에 관련된 연구 결과가 뒷받침되어야 하겠지만 단백질/펩타이드 약물의 전달을 위한 수송체로서 PLGA를 대체할 수 있는 매우 높은 잠재력을 가지고 있는 것으로 생각된다.
- Figure 4는 PAM으로부터 라이소자임의 방출 특성을 보여 준다. 상대적으로 아세틸화 정도가 적은 PA 1, 2의 경우 약물의 초기 방출 정도가 약 45% 정도로 매우 크게 보이지만, 아세틸화 정도가 높은 PA 4와 5의 경우 10% 내외로 크게 감소함을 보였다. 이러한 낮은 초기 방출값은 PLGA 미립구의 경우에 비해서도 매우 낮은 값으로 단백질/펩타이드 약물의 전달체로서 가능성을 제시한다.
- 특히 PA5의 경우 입자분포는 30-50 pm 정도였다. 이 결과들은 아세틸화가 커질수록 입자의 분포가 좁아짐과 동시에 작은 입자의 수가 줄어들었음을 의미한다. 앞에서 언급
- 215로 나타났음. 즉, PA5에 대해서는 PA4 와 유의적 차이가 없으나, PAI, PA2, PA3에 대해서는 유의적 차이를 보였다. 이는 아세틸화가 높은 미립구일수록 라이소자임이 활성을 유지한 채 봉입된다는 것을 의미한다.
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