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문제 정의
- 최근 quinone 계 물-질은 효소 상호작용에 의하여 ethanol 대사를 증가시킬 수 있다고 보고 되었다.7)따라서 본 연구에서는 알로에 생리활성 탐색 연구의 일환으로 macrophage cell 라인인 Raw cell을 이용하여 항염증 효과를 검정하기 위하여 세포내의 단백질의 변화를 western blotting을 통하여 염증억제효과를 검토하였다.
제안 방법
- Western blotting에 의한 iNOS 발현 측정. NO 측정은 cell 의 s Raw cell 농도에 따라서 처리한 sample을 준비한 다음 Raw cell의 confluence가 80% 때에 DMEM배지를 거두어내 고무 혈청 배지인 EMEW[배지로 교환한 후에 약물을 처치하여 위와 같은 조건으로 배양한 후에 적정시간세 상징액은 제거한 후 PBS로 2회 세척하고 scrapper로 cell을 수확한 후에 lysis buffer를 넣어서 세포를 용출시켰다. 수확된 protein은 BSA (bovine serum albumin)로 작성한 standard curve에 OD 값을 대입시켜서 protein량을 보정하였다.
- Oxide 측정. NO 측정은 cell의 supernatant에서의 nitric oxide(NO)의 량을 nitrite and nitrate로서 측정을 하였다. Nitrite에 대한 nitrate로 환원된 후의 안전한 형태인 griess reagent(Sigma, USA)를 사용하였으며, 6well plate에 2X106개의 cell을 confluence가 80% 일 때, PBS로 2번 washing한 후에무혈청 배지를 사용하여 12시간 이상 배양시킨 후에 PA 50 M 을 control 군을 뺀 모든 well에다 넣어서 자극시켰다.
- NO 측정은 cell의 supernatant에서의 nitric oxide(NO)의 량을 nitrite and nitrate로서 측정을 하였다. Nitrite에 대한 nitrate로 환원된 후의 안전한 형태인 griess reagent(Sigma, USA)를 사용하였으며, 6well plate에 2X106개의 cell을 confluence가 80% 일 때, PBS로 2번 washing한 후에무혈청 배지를 사용하여 12시간 이상 배양시킨 후에 PA 50 M 을 control 군을 뺀 모든 well에다 넣어서 자극시켰다. 2시간 후에 시료를 60-80 m/의 농도로 처리하여 실험하였다.
- , USA)에서 구입하였다. 그 외의 기타 시약은 특급 시약을 사용하였으며, uv/vis spectrophotometer(Hitachi? Japan), centrifuge(Hitachi, Japan), ELISA reader(Bio Rad, Japan) 등을 사용하여 측정하였다.
- NO 측정은 cell 의 s Raw cell 농도에 따라서 처리한 sample을 준비한 다음 Raw cell의 confluence가 80% 때에 DMEM배지를 거두어내 고무 혈청 배지인 EMEW[배지로 교환한 후에 약물을 처치하여 위와 같은 조건으로 배양한 후에 적정시간세 상징액은 제거한 후 PBS로 2회 세척하고 scrapper로 cell을 수확한 후에 lysis buffer를 넣어서 세포를 용출시켰다. 수확된 protein은 BSA (bovine serum albumin)로 작성한 standard curve에 OD 값을 대입시켜서 protein량을 보정하였다. 그 후에 coomassie blue로 염색하여 재보정한 후에 western sample로 사용하였다.
- 시료조제. 시료의 조제는 시판되는 현탁액의 경우 알로에 베라와 알로에 센스를 60와 80m2의 농도로 증류수에 현탁 시켜서 사용하였으며, 청징액은 현탁액을 0.1 pm pore size의 milipore filter를 통하여 여과시켜 사용하였다.
대상 데이터
- 시약 및 기기. 항염증효능 검정에 사용된 시약은 PA (phosphatidic acid), 3<4, 5-dimethyldTiazol-2-yD25~diphaiylteteolium (MTT)와 dimethyl sulfbxide(DMSO)는 Sigma(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였고, fetal bovine serum(FBS)과 antibiotics는 Gibco/BRL(Eggenstein, Germany)에서 구입하여 사용하였으며, 2차" antibody는" BD Bioscience(San Diego, USA), Cayman (Ann Arbor, USA), Zymed(South San Francisco, USA) 에서 각각 구입하였다. Tumor necrosis factor(TNF)-a, IL-1와 IL-6 의 ELISA kit는 Pierce endogen(Rockford, IL.
- Murine macrophage cell line인 Raw 264.7 cells 은 한국세포주은행 (Korean Cell Line Research Foundation) 에서 구입하였으며, Dulbecco's modified Ease's medium(DMEM)에 Gibcc사의 fetal bovine serum(FBS)를 10%, 100 U/m/ penicillin 및 100 |ig/m/ streptomycin을 혼합한 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 72시간 배양하였다. Cell 배양 dish에 cell의 밀도가 2~3><1 /m/ 정도가 되게 계대 배양하여 5% CO2 조건으로 cell 상태를 유지하였다.
- Louis, MO, USA)에서 구입하였고, fetal bovine serum(FBS)과 antibiotics는 Gibco/BRL(Eggenstein, Germany)에서 구입하여 사용하였으며, 2차" antibody는" BD Bioscience(San Diego, USA), Cayman (Ann Arbor, USA), Zymed(South San Francisco, USA) 에서 각각 구입하였다. Tumor necrosis factor(TNF)-a, IL-1와 IL-6 의 ELISA kit는 Pierce endogen(Rockford, IL., USA)에서 구입하였다. 그 외의 기타 시약은 특급 시약을 사용하였으며, uv/vis spectrophotometer(Hitachi? Japan), centrifuge(Hitachi, Japan), ELISA reader(Bio Rad, Japan) 등을 사용하여 측정하였다.
- 실험재료. 본 실험에서 사용한 알로에는 2005년 12월에 시중에서 (주)김정문알로에 제품인 알로에 베라와 알로에 센스를 구입하여 4, C에 냉장 보관하면서 사용하였다.
성능/효과
- 또한, aloe 성분 중에는 화상과 절상에서의 염증유발원인 bradykinin을 분해하는 효소가 포함되어 있으며, 이러한 성분은 유종, 창상, 열창상에 대한 치료효과를 나타내며, 위액분비에 관계가 있는 histamine 탈탄산효소와 방향성 아미노산 탈탄산 효소의 활성을 저해하는 물질을 포함하고 있는 것으로 보고 되었다. 3)알로에는 품종이 다양하 전 세계적으로 약 300여종에 이르나;) 약용으로 사용되는 알로에는 그 중 일부분으로 Cape Aloe(Aloe ferox, Aloe arborescens)와 Socotra Aloe(Aloe perryi), 그리고 Curasao Aloe(Aloe barbadensis, Aloe vera)이다. 이 중 현재는 Cape Aloe와 Curasao Aloe 두 종류만 주로 사용되고 있으며, 알로에 베라로부터 분리된 당단백인 NY 945가 히스타민 등의 매개체 분비를 억제하며 호산구의 조직 내 침윤을 억제함으로써 항 알레르기 효과를 나타낸다고 보고 되었다.
- iNOS는 바이러스를 포함하는 전염성의 병원체에 대하여 방어하는 역할을 하며, 여러 염증 질환, 순환계질환 및 암과 밀접한 연관이 있는 것으로 알려지고 있다. NO 생성 억제기작에 관한 iNOS 단백질의 관련성을 조사하기 위하여 immunoblot analysis를 이용하여 세포질 내에서의 iNOS 단백질의 발현량을 조사한 결과 Fig. 3에서와 같이 Raw cell에서 PA처치에 의해 iNOS 발현이 현저히 증가하였으며, 알로에베라 및 센스 추출물 처리에 의해 iNOS 발현은 모든 실험군에서 PA에 비해 상대적으로 증가함을 나타내었으나, clearing extract 처리의 농도가 60[ig/m/에서 80 pig/m/로 높아질수록 density가 감소하는 억제현상이 관찰되어 적절한 처리 농도만 제시 된다면 염증억제 효과도 나타낼 수 있을 것이라 추측되었다. So 등은 대식세포에서 산더덕에 의해 iNOS 발현이 억제되었다는 결과를 보고하였으며, Byun 등'"은 현삼메탄올 추출물이 LPS로 유도된 Raw cell의 iNOS 발현에 미치는 영향을 조사한 결과에서도 처치군에서 iNOS 발현이 감소한 결과를 나타내었다고 보고하였다.
- production에 미치는 영향. PA로 염증이 유도된 Raw 264.7 cell의 NO production에 대한 알로에 추출물의 NO 생성억제 정도를 관찰하기 위하여 알로에를 60 및 80 g/mZ의 농도로 세포에 처리하여 생성되는 NO량을 측정한 결과 Fig. 2에서와 같이 알로에 현탁액 처리군의 경우 베라 처리군에서는 PA 처리군에 비해 NO의 양이 증가하였으나, 센스 처리군에서 80의 농도 처리에 의해 PA 처리군보다 상대적로 낮은 NO 생성량을 나타내었다. Byun 등은 현삼 메탄올 추출물에서, Kim 등은 상황 물추출물에서 LPS로 유도된 Raw cell의 NO production에 미치는 영향을 관찰한 결과 NO 생성량이 억제된 결과를 나타내었다고 보고하였으며, 본 실험의 결과 알로에도 NO 억제활성을 나타냄으로 인해 염증억제제로 활용할 수 있을 것이라 판단되었다.
- 7 cell에 알로에 추출물을 60 및 80 /m/의 농도로 세포에 처리하여 생성되는 NO량을 측정한 결과이다. 그 결과 현탁액 처리군과 청징액 처리군 모두 알로에 추출물을 첨가하지 않은 Raw 264.7 cell 배양액인 control군에 비해 NO 양의 증가가 관찰되지 않아 알로에 자체가 염증유발 반응에 직접적으로 관여 하지 않는 것으로 나타났다.
- 그러므로 COX-2에 선택적인 inhibitor의 개발은 염증의 치료 target molecule이 되고 있다. 본 실험에서 PA 처리시 COX-2 단백질이 유도되었으며, 알로에 베라를 처리한 실험군에서는 PA 처리군에 비해 상대적으로 높은 값을 나타내었으나 처리 농도가 높아질수록 농도의존적인 억제 양상이 나타났으며, 알로에 센스 처리구의 경우 Fig. 4에서와 같이 현탁액처리 및 청징액 처리구 모두 PA 처리구에 비해 매우 닞은 COX-2의 양이 확인되어 염증억제 효과가 우수한 것으로 판단되었다 0<0.01). Byun 등은 현삼 메탄올 추출물 처리에 의하H COX-2의 량이 현저히 줄어들었으며, Kim 등, 즈은 상황 물 추출물에 의해 COX-2 발현에는 변화가 없었다는 결과와 비교해보아, R4에 의한 iNOS와 COX-2의 발현은 둘 다 염증반응에 관련된 분자이지만 처리하는 약재에 의한 결과는 서로 다른 기전을 가지고 있는 것으로 판단되며 이에 대한 연구는 차후 지속적으로 이루어져야 한다고 생각된다.
후속연구
- 01). Byun 등은 현삼 메탄올 추출물 처리에 의하H COX-2의 량이 현저히 줄어들었으며, Kim 등, 즈은 상황 물 추출물에 의해 COX-2 발현에는 변화가 없었다는 결과와 비교해보아, R4에 의한 iNOS와 COX-2의 발현은 둘 다 염증반응에 관련된 분자이지만 처리하는 약재에 의한 결과는 서로 다른 기전을 가지고 있는 것으로 판단되며 이에 대한 연구는 차후 지속적으로 이루어져야 한다고 생각된다.
- 2에서와 같이 알로에 현탁액 처리군의 경우 베라 처리군에서는 PA 처리군에 비해 NO의 양이 증가하였으나, 센스 처리군에서 80의 농도 처리에 의해 PA 처리군보다 상대적로 낮은 NO 생성량을 나타내었다. Byun 등은 현삼 메탄올 추출물에서, Kim 등은 상황 물추출물에서 LPS로 유도된 Raw cell의 NO production에 미치는 영향을 관찰한 결과 NO 생성량이 억제된 결과를 나타내었다고 보고하였으며, 본 실험의 결과 알로에도 NO 억제활성을 나타냄으로 인해 염증억제제로 활용할 수 있을 것이라 판단되었다.
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